Во время развития животных дискретные единицы развития, наз. компартментами, разделяются с помощью границ, ограничивающих клоны, которые останавливают клетки с др. качественными особенностями от смешивания. Кроме того, границы компартментов часто содержат сигнальные центры. Разделение клеточных популяций на компартментных границах важно для корректного формирования паттерна и дифференцировки окружающих тканей^1-3. Этот организующий принцип законсервирован от мухи до человека. У человека дефекты сортировки клеток во время компартментализации, как полагают, вызывают злокачественную инвазию и врожденные дефекты, такие как craniofrontonasal синдром^15-17. У позвоночных ромбомеры заднего мозга и крыловые диски дрозофилы обнаруживают рассортировку клеток между компартментами, управляемую как транскрипционными факторами, которые обеспечивают компартмент-специфические качественные особенности, так и передачей сигналов, локализующихся на границах, таких как передача сигналов EPH-Ephrin, Hedgehog или Notch^18-26. Иерархически ниже этих факторов было предложено несколько механизмов клеточной сортировки, в основном связанных с дифференциальной адгезией¹⁹, а также с регуляцией цитоскелета^10,11, регуляцией клеточной пролиферации^10,12 или защитой с помощью клеточного матрикса³. Однако in vivo подтверждения для этих гипотез слабы, а молекулярные и клеточные механизмы сортинга клеток на границах компартментов остаются неизвестные.

Здесь мы исследовали эту проблему на ранних эмбрионах Drosophila. Во время сегментации туловище подразделяется на альтернативные передний и задний компартменты (Fig. 1a)²⁷. Передние клетки, которые экспрессируют Wnt-1 гомолог Wingless (Wg), и задние клетки, которые экспрессируют гомеодоменовый белок Engrailed (En), разделены с помощью парасегментных границ, ограничивающих клоны (они останавливают перемешивание клеток) во время стадии эмбриогенеза 8-11 (ref. 28). Задний интерфейс En полоски (где будет сформирована сегментная граница на более поздних стадиях) не является барьером для перемешивания клеток на этих стадиях²⁸.

Мы установили, что во время стадий 8-11, клетки на обеих сторонах PS границы минимизируют свои контакты, формируя прямую линию, прилегающих мембранных интерфейсов (Fig. 1b). Если компартментализация подвергается риску, как у мутантов wg выравнивание мембран теряется и некоторые клетки проникают в расположенный напротив компартмент (Fig. 1c). Мы оценивали количественно степень неправильного расположения путём измерения индекса прямоты (index of straightness (IS)) для поверхностей разделов рядов, IS близкая к 0, соответствует прямой линии. Количественная оценка подтвердила, что интерфейсы компартментных границ существенно прямее, чем др. интерфейсы дорсо-вентральных столбов (Fig. Id; IS = 3.7 ± 0.4 for PS boundaries and IS = 14.2 ± 1.1 for other interfaces, n - 25). У wg^CX4 мутантных эмбрионов интерфейсы, которые д. формировать PS границы имели показатель IS - 14.8 ± 1.0 (n = 24), это сходно с IS для не пограничных интерфейсов у эмбрионов дикого типа (Fig. Id). Следовательно, выравнивание мембран является свойством клонального ограничения границ у эмбрионов Drosophila.

Чтобы идентифицировать эффекторные гены, необходимые для сортировки клеток на PS границах, осуществляли поиск геномных делеций, которые бы давали изменения паттерна экспрессии. Мы обнаружили несколько делеций, которые давали у эмбрионов нерегулярные границы, напоминающие фенотип потери компартментализации (Supplementary Information, Fig. S1). Некоторые из этих делеций устраняли, по крайней мере, один регулятор сигнального Wg пути, что согласуется с его ролью в передне/задней компартментализации. Однако одна небольшая делеция не устраняла известные компоненты пути Wg, но удаляла один из двух цитоплазматических актиновых генов (actin5C) также как и spaghetti-squash (sqh), который кодирует MRLC (non-muscle myosin-II regulatory light chain). Чтобы проверить потенциальную роль актомиозинового цитоскелета в клональном ограничении на PS границах, мы исследовали выстраивание мембран у эмбрионов, у которых нарушена функция МуоII. Эмбрионы, гомозиготные по нулевым аллелям zipper, которые кодируют MHC (myosin heavy chain), не обнаруживали нерегулярности PS границ (data not shown), возможно из-за того, что материнский пул MHC достаточен для его функционирования. Чтобы воздействовать на материнский и зиготический пулы MyoII, мы обрабатывали эмбрионов соединением Y-27632, которое ингибирует MRLC предупреждая её фосфорилирование с помощью вышестоящей активаторной Rho kinase. Инъекции Y-27632 ранним эмбрионам в дозах, которые оставляли эпителий интактным и клеточные деления всё ещё происходили, нарушали выравнивание мембран на PS границах (Fig. Id, e; IS = 10.4 ± 1.9, n = 26 compared with IS = 4.3 ± 0.4, n = 25 in H₂0-injected embryos). Наблюдалась инвазия одиночных клеток из переднего или заднего компартментов в соседние (Fig. le). Дефекты PS границ у Y-27632-обработанных эмбрионов вызывались специфическим ингибированием MyoII, поскольку они устранялись за счёт экспрессии конституитивно активной phosphomimetic формы MRLC, MRLC^E20E21, которая функционирует в отсутствие Rho kinase (Fig. Id, e; IS = 5.0 ± 0.8, n = 26 ). Сходные дефекты сортировки клеток обнаруживались у эмбрионов, экспрессирующих доминантно-негативные формы MHC (IS = 10.3 ± 1.4, n = 25, for dominant-negative MHC-YFP expressed from an endogenous promoter, and IS = 13.9 ± 1.0, n = 23 for upstream activation sequence, UAS, dominant-negative MHC-GFP expressed with armGal4VP16; Fig. Id; Supplementary Informaion, Fig. S2). Т.о., ингибирование материнского и зиготического пула MyoII, или с помощью инъекции соединения или с помощью доминантно-негативной формы MHC, вызывало дефекты сортировки клеток, сходные с таковыми при потере передне/задней компартментализации у wg мутантов. Следовательно, функциональный актомиозиновый цитоскелет необходим для клонального ограничения на PS границах.

Чтобы исследовать, как актомиозиновый цитоскелет контролирует ограничение клонов, мы наблюдали за субклеточной организацией филаментозного актина и MyoII на границах клеток. MyoII (и в меньшей степени F-actin) многочисленны на PS границе между клетками, где они формируют линейные кабель-подобные структуры (Fig. 2a; Supplementary Information, Fig. S3a, b),сходное обогащение недавно описано для дорсовентральной границы в крыловом диске^10,11. Мы не наблюдали каких-либо отличий в структуре PS MyoII скоплений между парасегментами или между вентральными, латеральными и дорсальными регионами эктодермы (Supplementary Information, Movie S1; data not shown). Как и в случае планарных обогащений MyoII, наблюдаемых на ст. 6-8, во время удлинения зародышевого диска²⁹, как передние, так и задние клетки вносили вклад в PS кабели Myoll, поскольку скопления PS Myoll наблюдались на задней части соединения wg-клеток и на передней части соединения en-клеток (Fig. 2d; Supplementary Information, Fig. S3c). Присутствие PS Myoll кабелей соответствует периоду ограничения клонов на PS границах у эмбрионов дикого типа (Supplementary Information, Fig. S3d; stages 8-11). Кабели Myo II располагаются на уровне слипчивых соединений (Fig. 2a; Supplementary Information, Fig. S3e, f), там, где мембраны выстраиваются в линию на PS границе (IS = 3.6 ± 0.7 at adherens junctions and IS = 10.5 ± 0.9 at 5 pm below adherens junctions, n = 8; Fig. 2c, Fig. S3f, g). Кроме того, кабели отсутствовали у мутантов по компартментализации wg^CX4 (Fig. 2b). Мы пришли к выводу, что ограничение клонов на PS границах коррелирует с присутствием специализированных актомиозиновых структур в апикальных кортексах пограничных клеток (Fig. 2e).

Чтобы понять. как эти кабели могут способствовать сортировке клеток на PS границах, ы наблюдали поведение клеток вблизи границ у живых эмбрионов, используя MRLC-GFP (Supplementary Information, Movie 1). Мы установили, что PS граница может временно деформироваться при делении или, что значительно реже, за счёт интеркаляции пограничных клеток (Fig. 3a, b; Supplementary Information, Fig. S4a). Во время этих событий кабели Myoll не демонтируются (Fig. 3a, b; Supplementary Information, Fig. S4). Когда делящаяся пограничная клетка округляется и временно втискивается в соседний компартмент, то кабели Myoll пограничного кортекса сильно деформируются (Fig. Зс, c'; Supplementary Information, Movie 2). Приблизительно, когда начинается цитокинез кабели Myoll приводятся в порядок и дочерние клетки оттесняются обратно в компартмент из происхождения. Это указывает на то, что кабели Myoll корректируют перемешивание клеток, создавая барьер кортикального натяжения на интерфейсах границ.

Чтобы протестировать эту гипотезу, мы разработали метод специфического ингибирования функции Myoll в пограничных PS кабелях живых эмбрионов. Chromophore-assisted laser inactivation (CALI) была применена к культивируемым клеткам, чтобы инактивировать одиночные белки на субклеточном уровне, включая^13,14,30-32. С помощью CALI, интенсивная лазерная иллюминация хромофор вызывает вредные реактивные виды кислорода, которые могут инактивировать белок мишень поблизости (30-45 A) за счёт разрезания или сшивания пептидных остовов^13,33-35. Мы модифицировали этот метод, чтобы ингибировать функцию Myoll у живых эмбрионов Drosophila, используя GFP в MRLC-GFP слитом белке в качестве мишени chromophore. В этих экспериментах, MRLC-GFP экспрессировался на нулевом фоне sqh, так что каждая MRLC молекула была нагружена GFP. Сначала мы исследовали, можем ли мы ингибировать цитокинез, который необходим для функции Myoll. Мы установили, что повторные лазерные облучения пула MRLC-GFP на одной стороне углубляющейся борозды в делящихся клетках ингибирует цитокинез на этой стороне (Fig. 4a, a'). Подобного ингибирования не обнаружено в сходных экспериментах, нацеленных Moesin-ABD-GFP, С-терминальный фрагмент Moesin, слитого с GFP, который декорирует актиновый цитоскелет, но не функционирует (Fig. 4b, b ). Эти результаты показали, что CALI на MRLC-GFP блокирует цитокинез у живых эмбрионов путем ингибирования функции Myoll на субклеточном уровне.

Чтобы проверить эффект CALI на белки, мы использовали western blotting для анализа одиночных эмбрионов, экспрессирующих MRLC-GFP, у которых большая часть ткани стала предметом интенсивного лазерного облучения (Supplementary Information, Fig. S5a-c). Мы выявили достоверное уменьшение уровня белка MRLC-GFP, тогда как уровни ассоциированной MHC, или локального ассоциированного с мембраной белка Dig, оказались неизменными. Это указывает на то, что ингибирование Myoll с помощью CALI вызывает деструкцию MRLC-GFP. Вредных эффектов не выявлено в отношении клеточной жизнеспособности или целостности эпителия (Fig. 4; Supplementary Information, Fig. S5d, d'; data not shown). Очевидно, что CALI может ингибировать функцию Myoll эффективно и специфически с разрешением на субклеточном уровне и без очевидной клеточной или тканевой токсичности.

Мы использовали GFP-based CALI, чтобы непосредственно тестировать потребность в кабелях Myoll для сортировки клеток на PS границах. Мы специфически ингибировали пул Myoll в кабелях путем повторных облучений PS границы у эмбрионов, экспрессирующих MRLC-GFP, и затем отслеживали позицию клеток с помощью time-lapse imaging остаточной флюоресценции GFP. Мы установили, что когда кабели Myoll инактивируются в присутствии делящихся пограничных клеток, то PS граница неспособна корректировать перемешивание клеток (100% of cases, n = 10) и становится нерегулярной (Fig. 5a, d; IS increased from 1.8 ± 03 to 9.6 ± 1.0). В этих экспериментах пул Myoll в кабелях был лишь субклеточным инактивированым пулом, тогда как цитокинез протекал нормально (Fig. 5e). В контроле мы использовали CALI, чтобы воздействовать на Moesin-ABD-GFP в PS пограничных кабелях, и установили, что оно не влияет на границу в присутствии клеточных делений (Fig. 5b, d; IS = 3.4 ± 0.3 before CALI and IS = 3.6 ± 0.5 after CALI, n = 9). Поскольку инактивация Myoll в кабелях воспроизводит фенотипы, обнаруживаемые при ингибировании Myoll во всей ткани, то эти результаты указывают на то, что Myoll кабели ответственны за сортировку клеток на PS границах.

Мы установили, что ключевой угрозой для эмбриональных границ является деление пограничных клеток (Fig. 3a, note that cells dividing at a distance from the boundary had no effect). В соответствии с этим CALI инактивация Myoll кабелей в отсутствие клеточных делений не вызывала дефектов клеточной сортировки на PS границах (Fig. 5c, d; IS = 2.0 ± 0.6 before CALI and IS =2.6 ± 0.3 after CALI in the absence of divisions, n = 10, compared with IS = 1.8 ±0.3 before CALI and IS = 9.6 ± 1.0 after CALI in presence of divisions, n = 10). Более того Myoll кабели присутствуют, когда эмбриональный эпителий митотически активен и исчезает. когда деления в эпидермисе затухают (Supplementary Information, Fig. S6). Эта корреляция между митотической активностью и образование кабелей Myoll обнаружена также в крыловом диске Drosophila. Здесь преходящие Myoll кабели обнаруживались непосредственно перед образованием непролиферативной зоны на дорсовентральной граница крылового диска^39-42 (Supplementary Information, Fig. S6). Мы полагаем, что базирующиеся на актомиозине барьеры функционируют путем генерации асимметричных сил растяжения в кортексе challenging пограничных клеток, чтобы предупредить их от возможности проникновения в противоположный компартмент, особенно когда они делятся (Fig. 5f).

Итак,наши результаты демонстрируют, что актомиозиновые барьеры сортируют клетки на границах компартментов у ранних эмбрионов Drosophila. Скопления Myoll на PS интерфейсах границ нуждаются в передача сигналов Wg (Fig. 2b), однако, необходимы дополнительные исследования, чтобы определить участвующий механизм. Одна из возможностей в том, что wg- и en-экспрессирующие клетки обладают разными адгезивными свойствами и что эти различия запускают образование кабелей Myoll. В подтверждение этой модели, мутантные клоны по адгезивной молекуле Echinoid (гомолог Nectin) формируют актомиозиновые скопления на границе с тканью дикого типа в крыловом диске Drosophila и в фолликулярном эпителии^36,37.

Находки, что скопления Myoll также возникают на дорсовентральной компартментной границе в крыловом диске дрозофилы^10,11 подтверждает, что сборка базирующихся на актомиозине барьеров на границах д. быть генеральной стратегией остановки клеток с определенными качественными характеристиками от смешивания, особенно в митотически активных тканях. В заднем мозге позвоночных передача сигналов Eph-Ephrin регулирует сортировку клеток на границах ромбомеров^20,21,26. Принимая во внимание, что передача сигналов Eph-Ephrin регулирует актомиозиновый цитоскелет в др. контексте, таком как нахождение аксонами путей³⁸, рол базирующихся на actomyosin барьеров может быть предположена и в этой системе.

У развивающихся эмбрионов позвоночных имеются доказательства механизмов клеточной сегрегации не только между компартментами, но и также между разными типами ткани²⁹. Actomyosin-зависимое кортикальное натяжение, как было показано. участвует в сегрегации зародышевых слоёв у рыбок данио⁴⁰. Итак, наши результаты указывают на то, что локальная регуляция кортикального натяжения скорее, чем дифференциальная адгезия, может быть первичным механизмом клеточной сортировки у живых организмов.

Note added in proof: while this paper was in press, a report showed that the cell interfaces at the antero-posterior boundary in the Drosophila wing disc are under Myosin II-dependent tension. Computational simulations suggested that this increased tension is sufficient for compartmental cell sorting (Landsberg et al., Increased cell bond tension governs cell sorting at the Drosophila anteroposterior compartment boundary. Curr. Biol. doi:10.1016/j.cub.2009.10.021; 2009).