Во время ранних стадий эмбриогенеза позвоночных происходит скоординированная сортировка и расхождение предназначенных для артерий и вен ангиобластов в разные сети артерий и вен, что важно для установления функциональной сосудистой сети. Недавние исследования на мышах и рыбках данио выявили ключевую роль ряда сигнальных путей и транскрипционных регуляторов при артрио-венозной спецификации (7, 2).

Во время развития сосудов у рыбок данио ангиобласты мигрируют из латеральной пластинки мезодермы к срединной линии (3, 4) и в конечном счете образуют первую эмбриональную артерию (dorsal aorta, DA) и вену (caudal vein, CV). Происходящий из хорды Sonic hedgehog, который индуцирует vascular endothelial growth factor a (Vegfa) в вентральных частях сомитов, является важным для дифференцировки ангиобластов (5). Vegfa-индуцированная активация передачи сигналов Notch (5, 6), а также других факторов (2, 7-9), затем способствует артериальной спецификации в субнаборе ангиобластов (4), до артериально-венозного расхождения. Для изучения механизмов сортировки аретрильно-венозных ангиобластов анализировали развитие сосудов с высоким временным разрешением у Tgf(kdrl:GFP)^s843 (4) эмбрионов (10). Эти трансгенные эмбрионы экспрессировали green fluorescent protein (GFP) в эндотелиальном клоне, позволяя отслеживать ангиобласты во время ранних стадий сосудистого развития. GFP-позитивные ангиоблесты соединялись по срединной линии, чтобы сформировать одиноный сосудистый тяж на ст. 21 сомита (19.5 hours postfertilization; hpf; Fig. 1, A and B, and fig. SI).

Последующее ремоделирование тяжа ведет к образованию зачатка DA с просветом на 22 hpf. С 21 по 23 hpf, субпопуляция ангиобластов распространяется вентрально от DA зачатка и соединяется (anastomosed) с соседними клетками, чтобы сформировать зачаток CV на 24 hpf (Fig. 1, A to C; figs. SI, S2, and S4; and movies SI and S2). Следовательно, первая артерия и вена обладают общим сосудистым зачатком. Отрастание дорсальных intersegmental vessel (ISV) происходит с регулярными интервалами вдоль DA и инициируется позднее, чем вентральное врастание (23 hpf; Fig. IB), указывая тем самым на разные механизмы, управляющие поведением дорсального и вентрального разрастания. Т.о., DA формируется в результате классического васкулогенеза, тогда как образование CV использует альтернативный механизм, при котором избирательное отрастание предназначенных для вен ангиобластов, последующее прекращение отрастания и межклеточная сегрегация позволяют сформироваться отдельным артериальным и венозным сосудам. Следовательно, в отличие от ангиогенеза, при котором формируемые новые капилляры оказываются в одной сети с исходным сосудом, два не связанных кровеносных сосуда могут происходить из общей группы клеток.

Различия между образованием трубок DA и CV подчеркиваются контрастирующими способами образования просвета. Образование просвета DA происходит в результате образования полости в сосудистом тяже (11), тогда как функциональный CV просвет образуется по другому (Fig. 1, A, D, and E; figs. SI, S2, S5, and S6; and movies S3 and S4). При использовании Tg(gatal:dsRed)^сd2 эмбрионов, которые экспрессируют флюоресцентный белок dsRed в эритроцитах (12) и selective plane illumination microscopy (13), мы установили, что первоначальное образование полости в зачатке CV сопровождается быстрым расширением просвета после инвазии эритроцитов, позиционированных вентральнее DA (fig. S6 and movies S3 and S4). Вскоре после этого просвет CV очищается в результате зависимого от тока перемещения эритроцитов, процесс, который не происходит у эмбрионов после инъекции cardiac troponin t2 (tnnt2) morpholino oligonucleotide (MO), у которых отсутствует циркуляция (14) (Fig. IE).

Предполагается, что артериально-венозное расхождение и генерация дух отдельных сосудов может достигаться в результате избирательного включения предназначенных для вен ангиобластов в вентральные отрастания при ограничении вентральной миграции предназначенных для артерий ангиобластов. Vegfa, как было установлено, дифференциально регулирует поведение разрастания ангиобластов, т.к. способствует экспрессии Notch лиганда delta-like 4 (dll4) (15-17). Экспрессия D114 в кончиках клеток ISV активирует передачу сигналов Notch в соседних клетках, ограничивая тем самым поведение дорсального разрастания. Инъекции эмбрионам vegfa MO показали, что передача сигналов Vegfa также ограничивает поведение вентральной миграции ангиобластов (Fig. 2, table SI, fig. S7, and movies S5 and S6). У vegfa MO-инъецированных эмбрионов, ангиобласты первоначально соединяются, чтобы сформировать сосудистый тяж, но затем с излишком мигрируют вентрально, неспособные сегрегировать и, наконец, генерировать одиночную сосудистую трубку, включающую tg(gata1:dsRed)^sd2-позитивные эритроциты. Следовательно, Vegfa-обусловленная артериальная спецификация необходима для контроля и завершения вентральной миграции ангиобластов и поддержания интактной DA. Сходный фенотип наблюдался после инъекции MO по plcγl, который кодирует ключевой нижестоящий компонент передачи сигналов Vegfa (6), и после ингибирования активации рецептора Vegfa с использованием SU5416 (Fig. 2, table SI, fig. S7, and movies S5 and S7). ISV разрастание также нарушается у Vegfa-дефицитных эмбрионов, это согласуется с противоположными ролями передачи сигналов Vegfa при индукции дорсального отрастания (sprouting) (6) и ограничения вентрального разрастания. Vegfa влияет на поведение дорсального отрастания косвенно, активируя передачу сигналов Notch (15-17). Соответственно, N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-1 -alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)- обусловленное ингибирование передачи сигналов Notch способствует избыточному вентральному отрастанию(Fig. 2B). Более того, избыточная вентральная миграция обнаруживается также при инъекциях MO по gridlock/hey2, который кодирует ключевой транскрипционный эффектор передачи сигналов notch signaling (7). Т.о., завершение вентрального разрастания регулируется с помощью генов, стоящих ниже передачи сигналов Vegfa и Notch.

Напротив, морфогенез существенно нарушается широкого круга phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ингибитором LY294002 (Fig. 2B). Хотя воздействие LY294002 не влияет на общее количество числа ангиобластов, подтверждая отсутствие дефектов пролиферации (table S2), вентральное разрастание нарушается и существенно большее количество клеток остается в DA (Fig. 3, A to C), это согласуется с ролью PI3K в вентральном разрастание ангиобластов [supporting online material (SOM) text SI]. Миграция клеток во время ангиогенного разрастания избирательно нуждается в передаче сигналов посредством p110α изоформы PI3K ниже активации Vegf рецептора (18). Поэтому мы тестировали гипотезу, что подобный p1lOα-зависимый механизм может контролировать вентральное разрастание и образование CV. Мы исследовали группу I семейства PI3K (pllOα, p110β, p110σ, b pllOγ) с помощью изоформ-избирательных ингибиторов (19, 20) (table S3), чтобы избежать ранних онтогенетических дефектов и компенсировать взаимодействия, ассоциированные с генетически молчащими индивидуальными изоформами (19, 21, 22). В соответствии с ролью p110α, обработка эмбрионов ингибиторами в концентрациях, которые ингибируют p110α, блокировала морфогенез вены (fig. S12 and SOM text S2). Использование LY294002 или изоформы избирательного ингибитора, AS605240, в концентрациях, которые блокируют вентральное разрастание, также нарушало дорсальные ответвления (Fig. 3, A to C), указывая тем самым на общую потребность в PI3K при артериально-венозном sprouting.

Общая роль p110α в дорсальном и вентральном разрастании ангиобластов указывает на то, что общие пути регулируют эти процессы. Vegfa способствует дорсальному врастанию ISV после активации его рецептора, Flkl, и нижестоящей pllOα-обусловленной передаче сигналов (18). Ограниченная венозная экспрессия родственного Vegfc рецепторного гена flt4 (fig. S8) подтвержает роль p110α в морфогенезе вены ниже Flt4-обеспечиваемой передачи сигналов. Хотя вентральное разрастание и миграция ангиобластов существенного задерживается у vegfc или flt4 MO-инъецированных эмбрионов (fig. S13 and table S4) , возможное функциональное перекрывание с др. компонентами передачи сигналов Vegf или компенсация за счет альтернативных механизмов, делает возможной образование вены в более поздние промежутки времени. Однако роль передачи сигналов Flt4 в вентральном разрастании ангиобластов подтверждается трансплантациями клеток от Tg(kdrl:GFP)^s843 доноров в не трансгенных дикого типа хозяев. Значительно меньшее количество flt4 MO-инъецированных, чем контрольных MO-инъецированных, происходящих от доноров клеток вносит вклад в CV (Fig. 3, D and E, and table 55). Более того, избыточный вклад plcγl MO-инъецированных, производных от донора клеток в CV, блокируется ко-инъекциями flt4 MO. Следовательно, передача сигналов Vegfa/Flkl и Vegfc/Flt4 регулирует многонаправленно артериально-венозное разрастание (sprouting). Однако, vegfc не экспрессируется вентрально по отнрошению к DA, но в самой DA (fig. S14), указывая, что др. механизмы могут ориентировать направление миграции венозных ангиобластов вентрально.

EphB4 рецепторная тирозин киназа и её расположенный на плазматической мембране лиганд, EphrinB2 (EfhB2), демаркируют венозный и артериальный домены, соотв. (23). Исследования EphB4- и EfhB2-нулевых мышей выявляют роли для прямой и обратной передачи сигналов EphB4-EfhB2 в морфогенезе сосудов (23-25); , однако точная функция и способ действия двунаправленной передачи сигналов EphB4-EmB2 остается неизвестным (1). Наблюдения, что экспрессиия Efhb2a у рыбок данио ограничена наиболее дорсальными клетками сосудистого тяжа (4) (fig. S15) и её тонкая регуляция с помощью Vegfa (figs. Sll and SI6), а также передачи сигналов Notch (5-7) приводит нас к гипотезе о роли Ephb4a-Efhb2a в направленном контроле миграции ангиобластов. В согласии с этой гипотезой генерация самостоятельных аптериальных и венозных сосудов нарушена и PDK-зависимая вентральная миграция ангиобластов разрегулирована у efhb2a или ephb4a MO-инъецированных эмбрионов (Fig. 4, A and B, fig. SI7, and table S6). В противоположность vegfa MO-инъецированным эмбионам, efhb2a и ephb4a MO-инъецированные эмбрионы всё ещё формируют ISVs (Figs. 2A and 4, A and B), указывая, что ангиобласты мигрируют как дорсально. так и вентрально, но неспособны сегрегировать. Чтобы выяснить самостоятельные функции Efhb2a и EphMa в артериально-венозной сегрегации мы трансплантировали клетки от Tg(kdrl:GFP)^s843 доноров нетрансгенным дикого типа хозяевам. efiib2α MO-инъецированные, происходящие от доноров клетки вносили вклад в CV с вдвое большей частотой чем в контрольных клетках(Fig. 4C, table S6, and figs. S18 and S19). Напротив, значительно меньше ephb4a MO-инъецированных, происходящих от доноров клеток, вносит вклад в CV по сравнению с контролем. Т.о., Efhb2a ограничивает вентральную миграцию венозных ангиобластов, подтверждая роль двунаправленного Ephb4a-Efhb2a-обусловленного отталкивания между артериальными и венозными клетками при контроле направления разрастаний артериальных и венозных клеток (fig. S19). Более того, донорские клетки избыточно экспрессирующие efnb2a или ephb4a преимущественно вносят вклад в ISVs, это согласуется с увеличением отталкивания артериальных ангиобластов от ephb4a-экспрессирующих венозных клеток в ответ на увеличение Efhb2a или мощное форсированное Ephb4a-Efhb2a цис-взаимодействие в ответ на повышение Ephb4a (Fig. 4C, table S6, and figs. SI8 and SI9). Донорские клетки, избыточно экспрессирующие обратный signaling-deficient Efhb2a (26) (ΔC-Efhb2a), не сохраняются в DA (Fig. 4C, table S6, and figs. S18 and S19), подтверждая роль обратной передачи сигналов Ephb4a-Efnb2a в регуляции артериально-венозного расхождения. Следовательно, Vegfa-индуцированная экспрессиия efnb2a и двунаправленная передача сигналов Ephb4a-Efnb2a избирательно исключают артериальные ангиобласты из венозных отрастаний (sprouts) и способствуют вентральной миграции венозных ангиобластов. Эти данные подтверждают концепцию, что Notch, EfnB2, and EphB4 могут регулировать размеры развивающихся артерий и вен и что эндотелиальные клетки из DA могут вносить вклад в формирование CV у мышей (27). Т.о., репульсивная передача сигналов Ephb4a-Efnb2a регулирует направляющий контроль поведения отрастания ангиобластов. Предыдущая работа была сфокусирована на идентификации сигналов, которые модулируют спецификацию артериально-венозных ангиобластов, но как эти сигналы в конечном итоге влияют на клеточное поведение, чтобы сортировать и сегрегировать ангиобласты в самостоятельные сосуды, неизвестно. Наши данные представляют клеточные рамки морфогенеза артериально-венозных трубок, при этом координирующую регуляцию поведения разрастаний артериальных и венозных ангиобластов с помощью передачи сигналов Vegf, Notch и Ephb4a-Efnb2a эффективное формирование эмбриональной сосудистой сети (fig. S20 and SOM text S3) и проливают свет на то, как многонаправленные артериальные и венозные разрастания могут быть достигнуты благодаря поддержанию целостности предшественников сосудов. Наиболее важно, что мы открыли альтернативный способ сосудистого развития, который делает возможным расхождение клеток на дискретные артериальные и венозные сосуды из одного общего сосудистого предшественника. Во время ранних стадий эмбриогенеза позвоночных происходит скоординированная сортировка и расхождение предназначенных для артерий и вен ангиобластов в разные сети артерий и вен, что важно для установления функциональной сосудистой сети. Недавние исследования на мышах и рыбках данио выявили ключевую роль ряда сигнальных путей и транскрипционных регуляторов при аретрио-венозной спецификации (7, 2).

Во время развития сосудов у рыбок данио ангиобласты мигрируют из латеральной пластинки мезодермы к срединной линии (3, 4) и в конечном счете образуют первую эмбриональную артерию (dorsal aorta, DA) и вену (caudal vein, CV). Происходящий из хорды Sonic hedgehog, который индуцирует vascular endothelial growth factor a (Vegfa) в вентральных частях сомитов, является важным для дифференцировки ангиобластов (5). Vegfa-индуцированная активация передачи сигналов Notch (5, 6), а также других факторов (2, 7-9), затем способствует артериальной спецификации в субнаборе ангиобластов (4), до артериально-венозного расхождения. Для изучения механизмов сортировки аретрильно-венозных ангиобластов анализировали развитие сосудов с высоким временным разрешением у Tgf(kdrl:GFP)^s843 (4) эмбрионов (10). Эти трансгенные эмбрионы экспрессировали green fluorescent protein (GFP) в эндотелиальном клоне, позволяя отслеживать ангиобласты во время ранних стадий сосудистого развития. GFP-позитивные ангиобласты соединялись по срединной линии, чтобы сформировать одиноный сосудистый тяж на ст. 21 сомита (19.5 hours postfertilization; hpf; Fig. 1, A and B, and fig. SI).

Последующее ремоделирование тяжа ведет к образованию зачатка DA с просветом на 22 hpf. С 21 по 23 hpf, субпопуляция ангиобластов распространяется вентрально от DA зачатка и соединяется (anastomosed) с соседними клетками, чтобы сформировать зачаток CV на 24 hpf (Fig. 1, A to C; figs. SI, S2, and S4; and movies SI and S2). Следовательно, первая артерия и вена обладают общим сосудистым зачатком. Отрастание дорсальных intersegmental vessel (ISV) происходит с регулярными интервалами вдоль DA и инициируется позднее, чем вентральное врастание (23 hpf; Fig. IB), указывая тем самым на разные механизмы, управляющие поведением дорсального и вентрального разрастания. Т.о., DA формируется в результате классического васкулогенеза, тогда как образование CV использует альтернативный механизм, при котором избирательное отрастание предназначенных для вен ангиобластов, последующее прекращение отрастания и межклеточная сегрегация позволяют сформироваться отдельным артериальным и венозным сосудам. Следовательно, в отличие от ангиогенеза, при котором формируемые новые капилляры оказываются в одной сети с исходным сосудом, два не связанных кровеносных сосуда могут происходить из общей группы клеток.

Различия между образованием трубок DA и CV подчеркиваются контрастирующими способами образования просвета. Образование просвета DA происходит в результате образования послости в сосудистом тяже (11), тогда как функциональный CV просвет образуется по другому (Fig. 1, A, D, and E; figs. SI, S2, S5, and S6; and movies S3 and S4). При использовании Tg(gatal:dsRed)^сd2 эмбрионов, которые экспрессируют флюоресцентный белок dsRed в эритроцитах (12) и selective plane illumination microscopy (13), мы установили, что первоначальное образование полости в зачатке CV сопровождается быстрым расширением просвета после инвазии эритроцитов, позиционированных вентральнее DA (fig. S6 and movies S3 and S4). Вскоре после этого просвет CV очищается в результате зависимого от тока перемещения эритроцитов, процесс, который не происходит у эмбрионов после инъекции cardiac troponin t2 (tnnt2) morpholino oligonucleotide (MO), у которых отсутствует циркуляция (14) (Fig. IE).

Предполагается, что артериально-венозное расхождение и генерация дух отдельных сосудов может достигаться в результате избирательного включения предназначенных для вен ангиобластов в вентральные отрастания при ограничении вентральной миграции предназначенных для артерий ангиобластов. Vegfa, как было установлено, дифференциально регулирует поведение разрастания ангиобластов, т.к. способствует экспрессии Notch лиганда delta-like 4 (dll4) (15-17). Экспрессия D114 в кончиках клеток ISV активирует передачу сигналов Notch в соседних клетках, ограничивая тем самым поведение дорсального разрастания. Инъекции эмбрионам vegfa MO показали, что передача сигналов Vegfa также ограничивает поведение вентральной миграции ангиобластов (Fig. 2, table SI, fig. S7, and movies S5 and S6). У vegfa MO-инъецированных эмбрионов, ангиобласты первоначально соединяются, чтобы сформировать сосудистый тяж, но затем с излишком мигрируют вентрально, неспособные сегрегировать и, наконец, генерировать одиночную сосудистую трубку, включающую tg(gata1:dsRed)^sd2-позитивные эритроциты. Следовательно, Vegfa-обусловленная артериальная спецификация необходима для контроля и завершения вентральной миграции ангиобластов и поддержания интактной DA. Сходный фенотип наблюдался после инъекции MO по plcγl, который кодирует ключевой нижестоящий компонент передачи сигналов Vegfa (6), и после ингибирования активации рецептора Vegfa с использованием SU5416 (Fig. 2, table SI, fig. S7, and movies S5 and S7). ISV разрастание также нарушается у Vegfa-дефицитных эмбрионов, это согласуется с противоположными ролями передачи сигналов Vegfa при индукции дорсального отрастания (sprouting) (6) и ограничения вентрального разрастания. Vegfa влияет на поведение дорсального отрастания косвенно, активируя передачу сигналов Notch (15-17). Соответственно, N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-1 -alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)- обусловленное ингибирование передачи сигналов Notch способствует избыточному вентральному отрастанию(Fig. 2B). Более того, избыточная вентральная миграция обнаруживается также при инъекциях MO по gridlock/hey2, который кодирует ключевой транскрипционный эффектор передачи сигналов notch signaling (7). Т.о., завершение вентрального разрастания регулируется с помощью генов, стоящих ниже передачи сигналов Vegfa и Notch.

Напротив, морфогенез существенно нарушается широкого круга phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ингибитором LY294002 (Fig. 2B). Хотя воздействие LY294002 не влияет на общее количество числа ангиобластов, подтверждая отсутствие дефектов пролиферации (table S2), вентральное разрастание нарушается и существенно большее количество клеток остается в DA (Fig. 3, A to C), это согласуется с ролью PI3K в вентральном разрастание ангиобластов [supporting online material (SOM) text SI]. Миграция клеток во время ангиогенного разрастания избирательно нуждается в передаче сигналов посредством p110α изоформы PI3K ниже активации Vegf рецептора (18). Поэтому мы тестировали гипотезу, что подобный p1lOα-зависимый механизм может контролировать вентральное разрастание и образование CV. Мы исследовали группу I семейства PI3K (pllOα, p110β, p110σ, и pllOγ) с помощью изоформ-избирательных ингибиторов (19, 20) (table S3), чтобы избежать ранних онтогенетических дефектов и компенсировать взаимодействия, ассоциированные с генетически молчащими индивидуальными изоформами (19, 21, 22). В соответствии с ролью p110α, обработка эмбрионов ингибиторами в концентрациях, которые ингибируют p110α, блокировала морфогенез вены (fig. S12 and SOM text S2). Использование LY294002 или изоформы избирательного ингибитора, AS605240, в концентрациях, которые блокируют вентральное разрастание, также нарушало дорсальные ответвления (Fig. 3, A to C), указывая тем самым на общую потребность в PI3K при артериально-венозном sprouting.

Общая роль p110α в дорсальном и вентральном разрастании ангиобластов указывает на то, что общие пути регулируют эти процессы. Vegfa способствует дорсальному врастанию ISV после активации его рецептора, Flkl, и нижестоящей pllOα-обусловленной передаче сигналов (18). Ограниченная венозная экспрессия родственного Vegfc рецепторного гена flt4 (fig. S8) подтверждает роль p110α в морфогенезе вены ниже Flt4-обеспечиваемой передачи сигналов. Хотя вентральное разрастание и миграция ангиобластов существенно задерживается у vegfc или flt4 MO-инъецированных эмбрионов (fig. S13 and table S4) , возможное функциональное перекрывание с др. компонентами передачи сигналов Vegf или компенсация за счет альтернативных механизмов, делает возможной образование вены в более поздние промежутки времени. Однако роль передачи сигналов Flt4 в вентральном разрастании ангиобластов подтверждается трансплантациями клеток от Tg(kdrl:GFP)^s843 доноров в не трансгенных дикого типа хозяев. Значительно меньшее количество flt4 MO-инъецированных, чем контрольных MO-инъецированных, происходящих от доноров клеток вносит вклад в CV (Fig. 3, D and E, and table 55). Более того, избыточный вклад plcγl MO-инъецированных, производных от донора клеток в CV, блокируется ко-инъекциями flt4 MO. Следовательно, передача сигналов Vegfa/Flkl и Vegfc/Flt4 регулирует многонаправленно артериально-венозное разрастание (sprouting). Однако, vegfc не экспрессируется вентрально по отнрошению к DA, но в самой DA (fig. S14), указывая, что др. механизмы могут ориентировать направление миграции венозных ангиобластов вентрально.

EphB4 рецепторная тирозин киназа и её расположенный на плазматической мембране лиганд, EphrinB2 (EfhB2), демаркируют венозный и артериальный домены, соотв. (23). Исследования EphB4- и EfhB2-нулевых мышей выявляют роли для прямой и обратной передачи сигналов EphB4-EfhB2 в морфогенезе сосудов (23-25); , однако точная функция и способ действия двунаправленной передачи сигналов EphB4-EmB2 остается неизвестным (1). Наблюдения, что экспрессия Efhb2a у рыбок данио ограничена наиболее дорсальными клетками сосудистого тяжа (4) (fig. S15) и её тонкая регуляция с помощью Vegfa (figs. Sll and SI6), а также передачи сигналов Notch (5-7) приводит нас к гипотезе о роли Ephb4a-Efhb2a в направленном контроле миграции ангиобластов. В согласии с этой гипотезой генерация самостоятельных аптериальных и венозных сосудов нарушена и PDK-зависимая вентральная миграция ангиобластов разрегулирована у efhb2a или ephb4a MO-инъецированных эмбрионов (Fig. 4, A and B, fig. SI7, and table S6). В противоположность vegfa MO-инъецированным эмбрионам, efhb2a и ephb4a MO-инъецированные эмбрионы всё ещё формируют ISVs (Figs. 2A and 4, A and B), указывая, что ангиобласты мигрируют как дорсально., так и вентрально, но неспособны сегрегировать. Чтобы выяснить самостоятельные функции Efhb2a и EphMa в артериально-венозной сегрегации мы трансплантировали клетки от Tg(kdrl:GFP)^s843 доноров не трансгенным дикого типа хозяевам. efiib2α MO-инъецированные, происходящие от доноров клетки вносили вклад в CV с вдвое большей частотой чем в контрольных клетках(Fig. 4C, table S6, and figs. S18 and S19). Напротив, значительно меньше ephb4a MO-инъецированных, происходящих от доноров клеток, вносит вклад в CV по сравнению с контролем. Т.о., Efhb2a ограничивает вентральную миграцию венозных ангиобластов, подтверждая роль двунаправленного Ephb4a-Efhb2a-обусловленного отталкивания между артериальными и венозными клетками при контроле направления разрастаний артериальных и венозных клеток (fig. S19). Более того, донорские клетки избыточно экспрессирующие efnb2a или ephb4a преимущественно вносят вклад в ISVs, это согласуется с увеличением отталкивания артериальных ангиобластов от ephb4a-экспрессирующих венозных клеток в ответ на увеличение Efhb2a или мощное форсированное Ephb4a-Efhb2a цис-взаимодействие в ответ на повышение Ephb4a (Fig. 4C, table S6, and figs. SI8 and SI9). Донорские клетки, избыточно экспрессирующие обратный signaling-deficient Efhb2a (26) (ΔC-Efhb2a), не сохраняются в DA (Fig. 4C, table S6, and figs. S18 and S19), подтверждая роль обратной передачи сигналов Ephb4a-Efnb2a в регуляции артериально-венозного расхождения. Следовательно, Vegfa-индуцированная экспрессия efnb2a и двунаправленная передача сигналов Ephb4a-Efnb2a избирательно исключают артериальные ангиобласты из венозных отрастаний (sprouts) и способствуют вентральной миграции венозных ангиобластов. Эти данные подтверждают концепцию, что Notch, EfnB2, and EphB4 могут регулировать размеры развивающихся артерий и вен и что эндотелиальные клетки из DA могут вносить вклад в формирование CV у мышей (27). Т.о., репульсивная передача сигналов Ephb4a-Efnb2a регулирует направляющий контроль поведения отрастания ангиобластов. Предыдущая работа была сфокусирована на идентификации сигналов, которые модулируют спецификацию артериально-венозных ангиобластов, но как эти сигналы в конечном итоге влияют на клеточное поведение, чтобы сортировать и сегрегировать ангиобласты в самостоятельные сосуды, неизвестно. Наши данные представляют клеточные рамки морфогенеза артериально-венозных трубок, при этом координирующую регуляцию поведения разрастаний артериальных и венозных ангиобластов с помощью передачи сигналов Vegf, Notch и Ephb4a-Efnb2a эффективное формирование эмбриональной сосудистой сети (fig. S20 and SOM text S3) и проливают свет на то, как многонаправленные артериальные и венозные разрастания могут быть достигнуты благодаря поддержанию целостности предшественников сосудов. Наиболее важно, что мы открыли альтернативный способ сосудистого развития, который делает возможным расхождение клеток на дискретные артериальные и венозные сосуды из одного общего сосудистого предшественника.