Valosin-containing protein (VCP) является повсеместно экспрессирующимся белком, принадлежащим к AAA+ (ATPases associated with various activities) семейству белков (Halawani и Latterich, 2006). VCP участвует во множественных клеточных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, формирование ядерной оболочки, биогенез аппарата Golgi и систему ubiquitin proteasome system (UPS; Halawani и Latterich, 2006). Из этих функций деградация неправильно упакованных субстратов, синтезированных посредством секреторных путей охарактеризован лучше всего (Ye et al., 2001). VCP в комплексе с Ufd1 и Np14 участвует в ретротранслокации субстратов для ER-associated degradation (ERAD) (Ye et al., 2001). Потеря активности VCP ведет к накоплению ubiquitinated белков и нарушению ERAD (Dalai et al., 2004; Wojcik et al., 2004). VCP также облегчает доставку белковых агрегатов во внутриклеточные тельца. Отсутствие VCP нарушает образование аггресом и деградацию увеличенных polyglutamine-содержащих белков (Kobayashi et al., 2007).
В соответствии с вовлечением VCP's в эти процессы, доминантно наследуемые мутации вызывают inclusion body myopathy (IBM), Paget's disease of the bone (PDB) и frontotemporal dementia (FTD [IBMPFD]), которые являются редкими мультисистемными дегенеративными нарушениями с тремя варьирующими по пенетрантности фенотипическими признаками (Watts et al., 2004). 90% обнаруживают вызывающую потерю трудоспособности слабость между 40-50 гадами. В том же самом возрасте у 51% пациентов обнаруживается PDB. А у 32% пациентов развивается FTD между 50-60 годами. Др. признаки, встречающиеся в некоторых семьях, это катаракты, нейропатии и кардиомиопатии, показывающие, что патогенез IBMPFD может быть связан с др. болезнями, связанными с возрастом (Weihl et al., 2009).
Некоторые общие патологические признаки встречаются в несопоставимых тканях, затронутых при IBMPFD. Мышцы и головной мозг содержат ubiquitin- и TDP-43 (TARDNA-binding protein 43)-позитивные включения (Schroder et al., 2005; Forman et al., 2006; Hubbers et al., 2007; Neumann et al., 2007; Weihl et al., 2008). В ткани головного мозга убиквитинированные и TDP-43 включения являются внутриядерными, это позволяет классифицировать IBMPFD как субтип frontotemporal lobar дегенерации с убиквитинироваными включениями (FTLD-U) (Schroder et al., 2005; Forman et al., 2006). В мышцах убиквитинированные включения являются мионуклеарными и саркоплазматическими (Guyant-Marechal et al., 2006; Hiibbers et al., 2007), а TDP-43 уменьшается в ядрах миофибрилл, несущих включения (Weihl et al., 2008; Salajegheh et al., 2009). Почему TDP-43 накапливается в цитозоле IBMPFD пациентов, неизвестно, но это согласуется с поведением TDP-43 при др. FTLD-Us и спорадическом амиотрофическом боковом склерозе (Neumann et al., 2006).
Др. поразительной патологией в IBMPFD мышцах являются саркоплазматические вакуоли (Watts et al, 2004). Эти вакуоли обладают характеристиками rimmed vacuoles (RVs), обнаруживаемых при др. мышечных дегенеративных изменениях, таких как sporadic inclusion body myositis (sIBM) и наследственный IBM. Термин RV в действительности является неправильным, поскольку RVs не выстилаются ограничивающими мембранами и не содержат какого-либо специфического клеточного содержимого из органелл. Их скорее всего следует описывать как скопления мембранного и белкового дебриса в мышечных волокнах. Во время тканевого преобразования эти пленочные скопления извлекаются и приводят к RV. Ультраструктурный анализ показал, что RVs содержат обрывки мембранных завитков, смешанных с tubulofilamentous и электрон-плотным материалом (Fernandez et al., 2005). Происхождение RVs при sIBM и наследственном IBM неясно, но предполагается, что они результат аутофагии.
Как же болезненные мутации в VCP влияют на его функцию до конца неясно. Все описанные мутации располагаются внутри N-терминального и D1 доменов, которые являются регионами, предположительно участвующими в ассоциации субстрата и кофактора (Watts et al., 2004; Weihl et al.,.2009). Одно из первых исследований показало, что IBMPFD мутанты всё ещё соединяются с Ufd1 и Np14, которые важны для UPS функции (Hiibbers et al., 2007). Биохимическая характеристика некоторых болезненных мутаций установила, что они формируют стабильные гексамеры и обладают повышенной ATPase активностью (Weihl et al., 2006; Halawani et al., 2009). Повышенная ATPase активность может отражать структурные изменения в ответ на связывание ATФ (Halawani et al., 2009). Скелетными мышцами ограниченная экспрессия IBMPFD мутантного VCP-R155H (VCP-RH) у трансгенных мышей воспроизводи многие признаки, обнаруживаемые в IBMPFD мышцах, включая слабость, миопатические признаки, ubiquitinated включения и образование вакуолей (Weihl et al., 2007). Экспрессия IBMPFD мутаций в культуре клеток обнаруживает смешанные результаты. В некоторых исследованиях обнаружено увеличение ubiquitinated белков (Weihl et al., 2006; Ju et al., 2008), тогда как в др. обнаруживаются минимальные или отсутствие изменений на этих уровнях (Hiibbers et al., 2007; Gitcho et al., 2009). Насколько культуры клеток могут эффективно моделировать IBMPFD может быть связано с типом клеток и уровнем экспрессии белка. ERAD и UPS субстраты также могут накапливаться в IBMPFD мутантных клетках. Уровни ERAD субстрата AF508 cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR; Weihl et al., 2006) и UPS субстрата Unc-45B (Janiesch et al., 2007) повышены в IBMPFD мутантных клетках, точно также как при ATPase-неактивном VCP или после ингибирования протеосом (Dalai et al., 2004). Наконец, очистка агрегированных полиглютаминов замедлена в IBMPFD мутантных клетках (Ju et al., 2008). Это обусловлено нарушением трафика белковых агрегатов в аггресомы (Ju et al., 2008).
Ни одна из предыдущих находок не объясняет всей патологии, наблюдаемой в мышцах пациентов с IBMPFD. Участвует ли VCP в аутофагии, неизвестно. В данном исследовании мы оценивали формирование, созревание и истекание аутофагосом в клетках животных, лишенных функционального VCP или экспрессирующих IBMPFD мутантный VCP. Кроме того, мы оценивали накопление цитозольного TDP-43 в IBMPFD мутантных, экспрессирующих VCP клетках и у животных в условиях нарушения аутофагии.
Discussion
Мы продемонстрировали, что потеря активности VCP нарушает аутофагию. В частности, LC3-позитивные вакуоли неспособны созревать в аутолизосомы, приводя к накоплению nondegradative аутофагосом. Более того, показатели аутофагического тока (flux) нарушены в клетках, лишенных функционального VCP. Экспрессия IBMPFD мутантного VCP-RH или -AE приводит к сходным результатам с нефункциональными аутофагосомами, накапливающимся на RVs в мышцах IBMPFD пациентов и трансгенных мышей. Накопление TDP-43 в цитозоле происходит в экспрессирующих IBMPFD мутантных клетках и животных, а также при химическом ингибировании созревания аутофагосом in vitro и in vivo. Наши данные указывают на то, что IBMPFD является нарушением созревания аутофагосом, приводящего к дисфункции аутофагии.
Дефект в созревании аутофагосом объясняет многие патологические признаки в IBMPFD мышцах. Напр., ubiquitinated агрегаты и p62 включения присутствуют в тканях, дефецитных по аутофагии (Hara et al., 2006; Komatsu et al., 2007). RVs, которые, как полагают, аутофагичного происхождения, в самом деле являются скоплениями p62- и LC3-позитивных аутофагосом IBMPFD. Ингибирование аутофагии посредством фармакологического воздействия chloroquine, который является ингибитором лизосомных proteases, у мышей и пациентов ведет к миопатии с накоплением вакуолей и белка (Suzuki et al., 2002). Сходным образом применение токсинов из лекарст. нарушающих микротрубочки, colchicine и vinblastine ведет к миопатии с RVs (Kuncl et al., 2003). Механизм действия этих лекарств, как полагают, связан с дефектами доставки аутофагосом/лизосом.
Роль аутофагии в скелетных мышцах неясна. Специфичный для скелетных мышц нокаут аутофагии важного белка ATG5 у мышей ведет к атрофии type II мышечных волокон с накоплением ubiquitin и p62 в этих волокнах (Raben et al., 2008). Напротив, атрофия, индуцируемая в скелетных мышцах постоянно активным F0X03 (forkhead box 03) уменьшалась, когда на мышцы воздействовали замалчивающими РНК, направленными на LC3 (Mammucari et al., 2007). Нарушения в аутофогосомно-лизосомной деградации предлагают механизм, с которым согласуются и др. вакуолярные миопатии, такие как болезнь Danon's (Nishino et al., 2000) и X-сцепленная миопатия с избыточной аутофагией (Ramachandran et al., 2009). Эти миопатии, подобно IBMPFD, накапливают не деградировавшие белки в ассоциации с мембранозными структурами. По-видимому, мыши, дефицитные по генам аутофагии в скелетных мышцах, таким как ATG5, не дают аутофагосомы, тогда как в случае IBMPFD, аутофагосомы образуются, но неспособны созревать и деградировать. Вообще-то цитоскелетные нарушения и мембранозные скопления, которые появляются при вакуолярных миопатиях, являются вредными для функции скелетных мышц и объясняют патологическое различие между дефицитными и дефектными по аутофагии мышцами.
Перераспределение TDP-43 из ядра в цитозоль и последующая агрегация является признаком мышц пациентов с IBMPFD (Weihl et al., 2008). Саркоплазматический TDP-43 ко-локализуется с ubiquitin, указывая тем самым, что его деградация нарушена (Weihl et al., 2008). Этот признак наблюдается и при др. мышечных нарушениях с RVs, включая sIBM и hIBM2 (Weihl et al., 2008; Kusters et al., 2009; Salajegheh et al., 2009). Причина RVs
при этих нарушениях неизвестна, но предполагается как вторичная по отношению к аутофагии. Мы продемонстрировали, что TDP-43 накапливается в цитоплазме клеток, экспрессирующих IBMPFD мутантный белок и в мышцах трансгенных мышей. Эта патологическая находка воспроизводится в условиях нарушения слияния autophagosome-lysosome после воздействия chloroquine и Baf. Мы полагаем, что IBMPFD мутанты нарушают аутофагию и что это в конце концов приводит к накоплению цитозольного TDP-43. В недавнем исследовании установлено, что VCP и TDP-43 могут взаимодействовать в культуре клеток и тканях пациентов (Gitcho et al., 2009). Было предположено, что TDP-43 может быть субстратом для VCP. Считается, что TDP-43 или его фрагменты могут быть деградированы посредством аутофагии и накапливаются, если аутофагия не функционирует (Filimonenko et al., 2007; Caccamo et al., 2009; Kadokura et al., 2009; Kim et al., 2009). Как же перераспределение TDP-43 происходит в скелетных мышцах и являются ли TDP-43 или его фрагменты bona fide субстратом аутофагии, предстоит определить.
Данное исследование сфокусировано принципиально на патогенезе скелетных мышц при IBMPFD. Мышечная слабость присутствует у более 50% пациентов с IBMPFD и 90% IBMPFD пациентов имеет IBM с существенно меньшей фенотипической экспрессией PDB и FTD (~51% и ~32%, соотв.; Weihl et al., 2009). Более того, патология у пациентов с IBMPFD в мышцах и нейронах определенно различна. Напр., ткань головного мозга IBMPFD имеет преимущественно ядерные ubiquitinated включения с редкими цитоплазматическими включениями (Schroder et al., 2005; Forman et al., 2006), тогда как IBMPFD скелетные мышцы содержат ubiquitin-позитивные ядра и многочисленные саркоплазматические ubiquitinated включения (Hiibbers et al., 2007; Gidaro et al., 2008; Weihl et al., 2009). Сходным образом, IBMPFD ткань головного мозга содержит ядерные включения TDP-43, тогда как снижение TDP-43 в ядрах касается кортикальных нейронов (Neumann et al., 2007), IBMPFD скелетные мышцы обнаруживают исключительно накопление саркоплазматических TDP-43 и отсутствие включений в мышечных ядрах мышечных волокон (Weihl et al., 2008; Kiisters et al., 2009; Salajegheh et al., 2009). Причина подобных патологических различий неизвестна, но может быть связана с тем как ткани мышц и головного мозга отвечают на инсульт аутофагии.
Нарушение аутофагии согласуется с данными по др. болезням, которые обладают общми фенотипическими признаками с IBMPFD (т.e., PDB и FTLD-U). Мутации аутофагосомном белке p62 вызывают PDB (Laurin et al., 2002). p62 связывает ubiquitinated белки и LC3 (Pankiv et al., 2007). В условиях нарушенной аутофагии p62 обусловливает агрегацию ubiquitinated белков (Komatsu et al., 2007) и секвестрирует их от UPS (Korolchuk et al., 2009). Интересно, что VCP улучшает функцию UPS в условиях избыточной экспрессии p62, идентифицируя тем самым точку пересечения между UPS и аутофагией (Korolchuk et al., 2009). Мутации в CHMP2B (charged multivesicular body protein 2B) вызывают FTLD-U (Skibinski et al., 2005). CHMP2B является членом ESCRT (endosomal-sorting complex required for transport) пути, которые облегчает endosomal/lysosomal деградацию белков плазматической мембраны (Skibinski et al., 2005). Члены семейства ESCRT, включая CHMP2B, участвуют в autophagosome-lysosome слиянии, а потеря членов семейств ESCRTI и ESCRTIII ведет к накоплению TDP-43 (Filimonenko et al., 2007).
Это исследование не устраняет возможности того, что UPS или деградация мышце-специфических UPS субстратов нарушена при IBMPFD. Ранее мы сообщали, что уровни стабильного состояния AF508CFTR увеличены в IBMPFD мутантных VCP миобластах (Weihl et al., 2006). Мы предположили, что это вызывается дефектами UPS-обеспечиваемой деградации. Однако наши сегодняшние данные открывают возможность, что AF508CFTR накапливается из-за того, что мутации IBMPFD затрагивают аутофагию. Осуществляется ли это посредством прямой деградации ERAD субстрата с помощью аутофагии или вторичного нарушения UPS, как это наблюдается при хроническом ингибировании аутофагии, неизвестно (Korolchuk et al., 2009). Независимо от этого вполне возможно, что предыдущие исследования оценивали деградацию UPS субстратов и накопление ubiquitinated белков, что отражает первичных дефект аутофагии, обусловленный IBMPFD мутациями скорее, чем дисфункцией UPS (Weihl et al., 2006; Janiesch et al., 2007; Ju et al., 2008).
Механизм. с помощью которого VCP регулирует аутофагию неизвестен. Наши данные показывают, что потеря VCP не влияет на индукцию аутофагии, но нарушает созревание аутофагосом. Это может быть обусловлено дефектами доставки autophagosome/lysosome или autophagosome-lysosome слияния. Ранее мы показали, что IBMPFD мутации в VCP затрагивают доставку белковых агрегатов во внутриклеточные тельца (Ju et al., 2008). Это ведет к нарушению аутофагической деградации агрегированных polyglutamine-содержащих белков. Могут ли IBMPFD мутации также затрагивать доставку аутофагосом во внутриклеточные тельца, неизвестно, но это согласуется с имеющимися данными. VCP осуществляет свою функцию посредством взаимодействий с ubiquitinated промежуточными соединениями или путем ассоциации с ubiquitin-подобными доменами (Schuberth и Buchberger, 2008). Эти кофакторы содержат гомологичные в 76-80-aa последовательности со структурным сходством с ubiquitin. Некоторые ассоциированные с аутофагосомами белки (LC3, GABARAP и GATE-16) также имеют домены с гомологией ubiquitin (Sou et al., 2006). Образует ли VCP комплекс с этими белками. чтобы вызывать autophagosome-lysosome слияние, дискуссионно. Однако др. AAA+ белок, NSF, ассоциирует с GATE-16 (Sagiv et al., 2000). NSF обеспечивает сборку GATE-16 и GOS-28, Golgi v-SNARE, необходимого для гомотипического слияния мембран (Muller et al., 2002). Наше исследование выявило важную роль VCP в аутофагии и участие дисфункции аутофагии в патогенезе IBMPFD, и её фенотипических вариантов (IBM, PDB и FTLD-U), и в др. TDP-43 протеинопатиях.
Сайт создан в системе
uCoz 
