Ретиноевая кислота является активным производным ретиноидов и метаболизируется из retinol через retinal. Вторая ступень синтеза ретиноевой кислоты (окисление retinal до ретиноевой кислоты) обеспечивается с помощью цитозольной retinal-dehyde dehydrogenases (RALDH). Ген
, один из членов семейства энзимов, экспрессируется в латеральной пластинке мезодермы в основании поля зачатка конечности (Fig. 4A; Niederreither ef al. 1997; Swindell et al. 1999). В поле конечности, следовательно, ретиноевая кислота синтезируется в основании зачатка и проксимальная часть зачатка конечности подвергается действию высокого уровня активности ретиноевой кислоты (Niederreither et al. 2002; Mic ef al. 2004; Yashiro et al. 2004). Затем ретиноевая кислота деградирует с помощью энзима P450, наз. CYP26, и активность ретиноевой кислоты балансируется за счет синтеза и деградации молекул (see a recent review by McCaffery & Simons 2007). Ген
, один из CYP26 энзимов, экспрессируется в дистальной части зачатка конечности, и дистальная область обладает низким уровнем активности ретиноевой кислоты (Fig. 4A; MacLean etal. 2001; Yashiro etal. 2004). Целенаправленное разрушение cyp26b1 у мышей дает дефекты дистальной области, главным образом аутопода (Yashiro et al. 2004), подтверждая, что низкий уровень активности ретиноевой кислоты, сбалансированный её деградацией, является критическим для образования аутопода. Идея, что низкая концентрация ретиноевой кислоты специфицирует аутопод, соответствует феномену proximalization, вызываемому экзогенным воздействием ретиноевой кислоты, описанному выше. Как raldh2, так и cyp26b1 начинают экспрессироваться в поле конечности на ранней стадии развития конечности и градиент активности ретиноевой кислоты вдоль PD оси устанавливается на ранней стадии (Niederreither et al. 2002; Mic et al. 2004; Yashiro et al. 2004). В этом смысле спецификация аутопода, по-видимому, инициируется задолго до приобретения клетками судьбы области аутопода и дифференцировки хрящевых элементов. Активность ретиноевой кислоты транслируется в регион-специфическую экспрессию генов вдоль PD оси. Доступные генные маркеры для наивысшего уровня активности ретиноевой кислоты это Meis1 и Meis2, которые кодируют гомеодоменовые транскрипционные факторы и экспрессируются в наиболее проксимальном домене зачатка конечности, соответствующего области презумптивного стилопода (Fig. 4A; Capdevila etal. 1999; Mercader etal. 2000). нарушение синтеза ретиноевой кислоты снижает экспрессию Meis генов (Niederreither et al. 2002), а нарушение деградации ретиноевой кислоты расширяет домен экспрессии этих генов в дистальном направлении (Yashiro et al. 2004). В этом контексте экспрессия генов для области презумптивного аутопода регулируется наинизшими концентрациями ретиноевой кислоты, а Hoxa13 является заслуживающей доверия молекулой, специфичной для клона аутопода.
2-2. Hoxa13 as a marker for the future autopod
Hoxa13, один из гомеобоксных генов, который обнаруживается в специальном генном кластере, начинает экспрессироваться в зачатке конечностей кур на ст. 22 (Yokouchi etal. 1991; Nelson etal, 1996; Vargesson etal. 2001), это согласуется с началом образования аутопода (Fig. 2A). Домен экспрессии Hoxa13 первоначально органичен очень небольшой дистально-задней областью и расширяется проксимально и вперед по мере роста конечности. На более поздних стадиях (у кур ст. 25 и позднее), домен Hoxa13 соответствует области аутопода, в котором видны хрящевые рудименты. Начало экспансии и финальная локализация экспрессии Hoxa13 строго указывает на то, что домен Hoxa13 на всех стадиях маркирует будущий аутопод. Hoxd13 также экспрессируется в области аутопода, хотя самый передний палец не экспрессирует Hoxd13 (Nohno etal. 1991; Yokouchi etal. 1991; Nelson etal. 1996; Vargas & Fallon 2005). необходимо отметить, что Hoxd13 экспрессируется не только в области аутопода, но и также экспрессируется в задней половине более проксимальной области. Экспрессия Hoxa13 в зачатке конечности начинается внутри домена экспрессии Hoxa11 и в ходе процесса экспансии домена Hoxa13, клетки дистальной части зачатка конечности оказываются позитивными по двум генам Hoxa11/Hoxa13 (Yokouchi et al. 1991; Nelson et at. 1996; Sato et al. 2007), Экспрессия Hoxa11 исчезает в наиболее дистальной области, домен перекрывания Hoxa11/Hoxa13 становится узким и клетки аутопода наконец-то становятся позитивными только по Hoxa13. Двойной нокаут Hoxa13/Hoxd13 вызывает потерю скелета аутопода (Fromental-Ramain etal. 1996), указывая, что эти гены больше, чем просто маркеры аутопода. В др. исследовании было продемонстрировано, что Hoxa11 не существенен для образования аутопода (Davis etal. 1995; Davis & Capecchi 1996). Однако очевидно, что эктопическая экспрессия Hoxa11, которая распространяется в область аутопода (вызывается с помощью избыточной экспрессии Meis1) нарушает формирование нормального скелетного паттерна в аутоподе (Mercader etal. 1999) и что эктопическая экспрессия Hoxa13 в zeugopod вызывает аномальное формирование скелетного паттерна в нём (Yokouchi etal. 1995). Поэтому считается, что в отношении экспрессии Hoxa генов, исчезновение экспрессии Hoxa11 и Hoxa13-single-позитивная ситуация в области аутопода являются критическими для формирования нормального скелета в аутоподе.
Регион-специфическая экспрессия
Hoxa13 является нижестоящей мишенью для сигнального пути ретиноевой кислоты (Fig. 4A). Воздействие избытком ретиноевой кислоты вызывает редукцию экспрессии
Hoxa13 в области аутопода (Mercader etal. 2000), и также у сур26b1-нокаутных эмбрионов мыши, у которых уровни активности ретиноевой кислоты высоки во всём зачатке конечности, домен Hoxa13 в дистальной части зачатка конечности сильно уменьшен (Yashiro et al. 2004). Низкий уровень активности ретиноевой кислоты, вызываемый разрушением гена её синтетического энзима,
raldh2, приводит к элиминации всего скелета конечности, включая и элементы аутопода (Niederreither et al. 2002; Mic et al. 2004), однако остается неясным, почему тяжелые фенотипические отклонения в конечностях обусловлены дефектами формирования PD оси.
2-3. Cell surface property
Область аутопода, специфицируемая с помощью регион-специфической экспрессии Hoxa13, формирует хрящевые модули скелетного паттерна, включая mesopodium и acropodium. Характерным признаком элементов скелета аутопода является их более мелкие, более тонкие структуры, чем те, что в zeugopod и stylopod. Для элементов фаланг, периодические циклы дистального роста хрящевых конденсатов и сегментаций ведут к образованию цепочек мелких хрящевых элементов, которые разделены уставами (see a review by Casanova & Sanz-Ezquerro 2007). Прехондрогенные конденсации мезенхимных клеток, формируемых в аутоподе меньше, чем те, что в проксимальной области, это указывает на то, что мезенхимные клетки в будущих отростках аутопода обладают определенными клеточными свойствами, которые и делают скелетную морфологию характерной для аутопода. В самом деле, доказательством идеи, что свойства клеточной поверхности являются одной из характеристик, стали исследования по клеточно/тканевым агрегациям и трансплантациям.
У земноводных, как упоминалось выше, регенерирующая бластема конечностей формируется на уровне проксимальной части стилопода, постепенно регенерируя stylopod, zeugopod и autopod, тогда как бластема на уровне запястья регенерирует только структуры аутопода. Если бластема запястья имплантируется в в бластему бедра, то бластема запястья не регенерирует непосредственно, но смещается дистально (Fig, 4B). Когда регенерация хозяина достигает уровня щиколотки, то трансплантированная донорская бластема начинает регенерировать структуры аутопода (Crawford & Stocum 1988). Эти факты указывают на то, что клетки дистальной бластемы для аутопода обладают своими собственными свойствами клеточной поверхности, отличными от таковых проксимальных частей и что дистальные клетки могут начинать морфогенез, когда свойства поверхности совпадают с таковыми окружающей ткани. Это подтверждается результатами, полученными с использованием системы тканевой культуры (Nardi & Stocum 1983). Когда две бластемы, происходящие с одного и того же уровня соединяются и позиционируются вместе, то они сливаются и распределяются равномерно. Однако , когда бластема запястья соединяется с бластемой верхней части руки, то бластема запястья окружается таковой верхней части руки, демонстрируя, что бластема запястья, чтобы сформировать аутопод обладает более значительными адгезивными свойствами, чем проксимальные части. разные клеточные адгезивные свойства, как полагают, вызывают поведение сортировки таких тканей (Steinberg 1970). Развивающиеся мезенхимные клетки конечностей обнаруживают поведение сортировки, сходное с таковым в клетках регенерирующей бластемы конечности. В рекомбинантном зачатке конечности, который содержит диссоциированные и реагрегированные мезенхимные клетки конечностей с эктодермальным чехлом, то будущие клетки аутопода перераспределяются в дистальную часть возникающей в результате конечности (Wada et al. 1993). В системе монослойной культуры мезенхимные клетки конечности курицы, будущие клетки аутопода сегрегируют от более проксимальных клеток и они в конечном итоге отсортировываются др. от др. (Fig. 4C; Wada et al. 1993; Ide et al. 1994, 1998; Wada & Ide 1994). Сходные результаты получены с использованием клеток зачатков задних конечностей Xenopus (Koibuchi & Tochinai 1998). Зависимое от положения поведение клеточной сортировки завершается в течение короткого периода (около 18 ч) в культуре, подтверждая, что сортировка обусловлена разными свойствами клеточной поверхности, которыми клетки изначально обладают.
Дальнейшие исследования продемонстрировали, зависимая от положения клеточная сортировка тесно скоррелирована с позиционными качественными особенностями вдоль PD оси. Обработанные ретиноевой кислотой клетки аутопода не сегрегируют от проксимальных клеток в культуре и эти обработанные клетки превращаются в клетки. которые вносят вклад в более проксимальные структуры (Tamura etal. 1997). Замещение клетками аутопода клеток в проксимальных структурах также наблюдается для клеток аутопода, избыточно экспрессирующих Meis1 (Mercader etal. 2000, 2005) и в cyp26b1-нокаутных зачатках конечностей (Yashiro et al. 2004). Сходным образом клетки аутопода Hoxa13-нокаутных эмбрионов мышей неспособны отделяться от проксимальных клеток (Stadler etal. 2001). Зависимое от позиции клеточное сродство, как полагают, является клеточным свойством, необходимым для образования морфологии. специфической для аутопода. Эти исследования продемонстрировали, что разные регионы конечности используют разные количества и типы молекул клеточной поверхности, таких как молекулы клеточной адгезии. Дальнейшие исследования выявили несколько молекул, включая cadherins и Ephs, в качестве кандидатов, ответственных за клеточную сортировку. Cadherin-11 транскрипты экспрессируются в дистальной мезенхиме зачатков конечностей (Kimura etal. 1995). В культуре, cadherin-11-позитивные клетки отсортировываются от негативной клеточной популяции, указывая тем самым, что cadherin-11 участвует в избирательной ассоциации мезенхимных клеток. Транскрипты и белки N-cadherin распределены в большом количестве в дистальной части зачатка конечности и количество N-cadherin в дистальной части зачатка увеличивается по ходу развития конечности (Yajima et al. 1999, 2002). Как и в случае с cadherin-11, N-cadherin-позитивные клетки отделяются от негативных клеток в культуре. Как ингибирование функции N-cadherin в дистальном регионе. так и избыточная экспрессия N-cadherin в проксимальных клетках нарушают нормальное поведение клеточной сортировки. Интересно, что N-cadherin белок обнаруживает градиент распределения вдоль PD оси и следовательно, градиент количеств N-cadherin может быть вовлечен в придание качественных характеристик каждому из элементов аутопода. Ephs принадлежит к крупному семейству рецепторных тирозин киназ, регулирующих форму, движения клеток и прикрепление способом. зависимым от межклеточных контактов. Взаимодействуя со своими лигандами, ephrins, он запускает широкий круг клеточных реакций, включая клеточное распознавание, адгезию, образование границ и отталкивание. Ephrin лиганды принадлежат двум группам: GPI-закрепленному типу (ephrin-A) и мембран-связанному типу (ephrin-B). Сортировка и поглощение нарушаются с помощью PI-PLC, который удаляет GPI-закрепленные связанные с мембраной белки (Wada etal. 1998; da Silva etal. 2002), и избыточно экспрессирующийся ephrin-A2 в самом деле нейтрализует сродство клеток аутопода (Wada et al. 2003). При нормальном развитии конечностей экспрессия ephrin-A2 отсутствует в области аутопода, а некоторые из рецепторов, EphA4 и EphA7, экспрессируются в области аутопода, указывая, что эти молекулы играют роль в специфичных для аутопода свойствах клеточной поверхности и в зависимой от позиции сортировке клеток (Stadler etal. 2001; Wada etal. 2003). Экспрессия EphA7 снижается в мезенхимных клетках у Hoxa13 мутантных гомозиготных мышиных эмбрионов (Stadler etal. 2001) и имеются доказательства того, что EphA7 является непосредственной мишенью для Hoxa13 (Salsi & Zappavigna 2006).
Cadherins и Ephs/Ephrins,оба семейства важные для свойств клеточной поверхности, выполняют разные функции в клеточных коммуникациях, межклеточной адгезии и распознавании, и множественные механизмы могут действовать как финальная ступень формирования аутопода ниже пути ретиноевой кислоты и Ноха транскрипционного каскада, предопределяя специфичные для аутопода клеточные свойства final step for the autopod
3. Origin of the autopod
Конечности всех тетрапод, включая как существующие, так и вымершие виды, имеют аутоподы. Конечности и плавники рыб, как полагают, являются гомологичными образованиями и что конечности сформировались из парных плавников lobe-finned рыб (sarcopterygians). В эволюционном процессе перехода от плавников к конечностям аутопод образуется как новшество, но не обязательно думать, что аутопод был вновь добавлен у самых ранних аутопод (вымершие амфибии, такие как Acanthostega и Ichthyostega). Возможно, что некоторые из sarcopterygians, такие как Panderichthys и Tiktaalik. были уже снабжены аутопод-подобными радиальными структурами, т.к. имеется дистальный эндоскелет их плавников, хотя его структура кажется неполной (Shubin etal. 2006; Johanson et al. 2007). Онтогенетическая биологическая информация о переходе от плавников к конечностям очень ограничена, поскольку эмбрионы лишь немногих видов sarcopterygians доступны для лабо. исследований. Экспрессия Hoxd13 является одним из доступных сигналов. Как упоминалось, Hoxd13экспрессируется в будущей области аутопода. В зачатке конечностей тетрапод домен его экспрессии в ранней фазе располагается в задней половине зачатка, соответствующего заднему zeugopod. Экспрессия распространяется вперед по мере роста зачатка конечности и на поздней фазе домен его экспрессии включает большую часть будущей области аутопода (Nelson et al. 1996). Экспрессия Hoxd 13 описана в зачатке грудного плавника Australian двоякодышащих рыб, Neoceratodus forsteri, редкой живущей sarcopterygian рыбы, доступной в качестве лаб. животного (Johanson et ai 2007). Согласно этому исследованию экспрессия Hoxd13 в точности совпадает с поздней фазой паттерна экспрессии (кпереди расширенный домен), наблюдаемый в аутоподе тетрапод, указывая тем самым, что radials плавников у Neoceratodus и пальцы тетрапод имеют общие механизмы развития, отличные от таковых для проксимальных элементов плавников/конечностей. fin/limb elements. Базальные actinopterygian (ray-finned fish), у paddlefish (Polyodon spathula), также обнаруживают позднюю фазу экспрессии Hoxd13, паттерн экспрессии, характерный для развивающихся аутопод (Davis etal. 2007). Возможно, что поздняя фаза экспрессии Hoxd13 не является новшеством тетрапод, коррелирующим с эволюцией полных аутопод и что регуляция экспрессии Hoxd13 для аутопод является родоначальной у тетрапод. У рыбок данио, teleost, зачаток грудного плавника, по-видимому, лишен этой поздней фазы экспрессии HoxD (Sordino etal. 1995), указывая тем самым, что teleosts потеряли механизм генной регуляции родоначальной экспрессии HoxD, который сохранился у базовых actinopterygians, sarcopterygians и tetrapods (osteichthyans). Экспрессия HoxD описана также у chondrichthyans (cartilaginous fish), сестринской группы osteichthyans, это указывает на то, что механизм экспрессии HoxD поздней фазы является примитивным условием, присутствующим у общего родоначальника chondrichthyans и osteichthyans (Freitas etal. 2007).
Данные по экспрессии Hoxa 11/Hoxa 13 в зачатках плавников доступны для некоторых из видов teleost. У рыбок данио Hoxal 1/Hoxa13 экспрессируются в развивающихся зачатках грудных плавников и домены экспрессии в основном перекрываются, как это наблюдается на ранних стадиях в зачатках конечностей тетрапод. Перекрывающаяся экспрессия этих генов продолжается и на более поздних стадиях и их домены никогда не разделяются (Fig. 2C; Sordino et al. 1995, 1996; Neumann etal. 1999; Grandel etal. 2000). Исходя из отсутствия пространственно-временных изменений в экспрессии Hoxal 1/Hoxa13 вдоль PD оси, возникающие в результате эндоскелетные элементы в парных плавниках рыбок данио не могут быть классифицированы как какие-либо части конечностей тетрапод (radials, Fig. 2D). В этом смысле, необходимо сказать, что грудные плавники рыбок данио не обладают какими-либо элементами, соответствующими аутоподу. Плавник paddlefish также обнаруживает перекрывающуюся экспрессию Hoxal 1/Ноха13 (Metscher etal. 2005; Davis etal. 2007), указывая тем самым, что плавник не устанавливает PD ось, чтобы можно было отличать autopod и zeugopod, хотя регуляция Hoxd13 для аутопода может быть заложена. Было бы интересно выяснить, потеряно ли разделение программ Hoxal 1/Hoxa13 у actinopterygians или программа была вновь создана у sarcopterygians. Исследования экспрессии Hoxal 1/ Hoxa13 у chondrichthyans могут дать намеки в отношении этого вопроса.
Final words
Hoxa13 expression is a good marker for the autopod, but its expression does not directly mean the autopod. What is important for autopod formation is the sequential change in the Hoxa 73-expressing domain during limb development, that is, change from Hoxal 1/ Hoxa 73-double positive to Hoxa 73-single positive, as shown in Figure 2A. Even in the Hoxa /3-expressing domain, there is evidence of clear regionality of cell fate and affinity, and the regionality exists gradually along the PD axis. Qualitative difference in key molecules is probably responsible for. the gradual regionality, and accumulation of data from fine-tuned studies with newly developed methodology is opening the next window to investigate this complex process. Studies on autopod formation, which focus on traditional developmental biological problems, the most advanced molecular issues and evolutional topics, will continue to provide general ideas on pattern formation during development.
Сайт создан в системе
uCoz
Sayuri Yonei-Tamura, Tohru Yano, Hitoshi Yokoyama aod Hiroyuki Ide )
)
)
)