Формирование нервной системы сложный процесс, который нуждается в функциональных микротрубочках во время всех ст. развития. События, такие как нейрогенез, миграция нейронов, нахождение аксонами пути и формирование синапсов, регулируются с помощью внутренних и внешних путей, которые в конечном итоге наталкиваются на сеть микротрубочек, на которых базируются структурные изменения, которые лежат в основе каждого процесса. Однако лишь недавно были описаны мутации в генах, кодирующих tubulin человека, мономеров, которые полимеризуются в микротрубочки. Мутации в генах человека, таких как TUB1A1 и TUBB2B, которые кодируют α-tubulin и β-tubulin, соотв., или в генах, которые регулируют функцию микротрубочек, такие как Lis1 и Doublecortin (Dcx) (des Portes et al., 1998; Gleeson et al., 1998; Jaglin et al., 2009; Keays et al., 2007; Poirier-et-аl .2007) вызывают нарушения в развитии головного мозга. Такие нарушения характеризуются lissencephaly (отсутствие складок головного мозга) и polymicrogyria (избыточной изогнутостью (convolutions) головного мозга), которые вызываются в принципе дисфункцией миграции нейронов. В ж. Cell, Tischfield et al. (2010) сообщают о новых мутациях в гене TUBB3 человека, кодирующем encoding neuronal βIll-tubulin нейронов. Используя разнообразные подходы они выявили мутации TUBB3, которые дают разнообразные клинические фенотипы, включая ocular motility disorder (CFEOM3). Неожиданно, это оказалось обусловлено, прежде всего, нарушением наведения аксонов, а не дисфункцией миграции нейронов. Это исследование элегантно устанавливает взаимоотношение между мутациями TUBB3, их влиянием на функцию микротрубочек и клиническими симптомами.

Используя базирующийся на семьях подход авт. идентифицировали 8 гетерозиготных мутаций в TUBB3. Клинически авт. установили, что пациенты с мутацией R262C (наиболее часто мутирующий остаток) или D417N мутацией обнаруживают гипоплазию глазо-двигательного нерва и некоторых др. нервных трактов, указывающих на дефекты в наведении и поддержании аксонов. Столь же интересно и их наблюдение, что пациенты, обладающие разными мутациями в TUBB3, имеют разные клинические диагнозы. Хотя большинство пациентов страдают от CFEOM3, те же, которые с мутациями R262H, E410K или D417H также обнаруживают в различной степени выраженный лицевой паралич и прогрессирующую сенсорно-моторную полинейропатию. Это привело авт. к предположению, что существуют генотип-фенотипические взаимоотношения, при этом специфические мутации ассоциируют с определенным набором клинических синдромов. Хотя эти классификации и вносят вклад в генетическое консультирование, они не являются абсолютными, поскольку степень клинического проявления варьирует. тем не менее, как же возникают дифференциальные клинические фенотипы в результате мутаций в одном и том же гене?

Чтобы ответить на это, авт. обратились к мышиной генетике и создали knock-in модель для наиболее распространенной мутации, R262C. Анализ мышей с гомозиготной R262C мутацией в ТubbЗ гене выявил выраженное нарушение некоторых трактов аксонов, включая oculomotor нервы, комиссуральные аксоны, ветвление краниальных нервов, истончение передней комиссуры, а также угнетенный рост мозолистого тела. Эти данные строго указывают на то, что первичный дефект связан с нарушением роста аксонов, это согласуется с imaging данными у человека и демонстрирует законность использования Tubb3^{R262C/ R262C} мышей в качестве модели. Неожиданно авт. установили, что слои нейронов в коре головного мозга были нормальными и не обнаруживали признаков структурных дефектов. Это указывает на то. что мутация R262C не влияет на миграцию нейронов, это также согласуется с отсутствием аномалий в закладке кортикальных слоёв у пациентов с мутациями TUBB3.

Авт. далее охарактеризовали мутантных мышей и высказали предположение, что мутация R262C нарушает биохимические свойства βlll-tubulin, приводя к аномалиям функции микротрубочек. В самом деле, микротрубочки в нейронах от этих мутантных мышей обнаруживали повышенную tyrosination, пост-транляционную модификацию, которая увеличивает стабильность микротрубочек. Однако микротрубочки также обнаруживали пониженное связывание с Kif21a, кинезиновым моторным белком. Это очень интересно, принимая во внимание, что люди с гетерозиготными мутациями в Kif21a обнаруживают изолированную дисфункцию глазного мотора с признаками дефицита аксонов в краниальных нервах, сходными с таковыми у пациентов с мутациями TUBB3 (Yamada et al., 2003). Принимая во внимание, что моторные белки, такие как

Figure 1. Microtubules and Brain Development Human genetic studies have revealed that mutations in genes encoding tubulin, the monomer that polymerizes into microtubules, lead to a variety of defects during brain development associated with abnormal neuronal migration and axon guidance. Mutations in the TUBA1A gene encoding a-tubulin lead to type I lissencephaly (smooth brain), whereas mutations in the TUBB2B gene encoding ^-tubulin lead to polymicrogyria (convoluted brain) characterized by prematurely arrested neurons in the deeper cortical layers. Mutations in TUBB3, which encodes plll-tubulin, produce a different dinical syndrome (ocular motility disorder) primarily due to disrupted axon guidance during brain development. Furthermore. TUBB3 mutations lead to impaired interactions of kinesin motor proteins with microtubules and increased microtubule stability, which contributes to the axon guidance defects. Although the mutations in the tubulin-encoding genes result in different disorders, all of them impair the formation of tubulin heterodimers. This would eventually result in suboptimal microtubule dynamics during various developmental events. Patients with TUBA1A and TUBB2B mutations (gray lines) also display evidence of disrupted axon tract formation, but it is unclear whether this is a secondary deficit due to the inhibition of neuronal migration.

кинезины, являются важными для транспортирования груза вдоль микротрубочек (De Vos et al., 2008), снижение взаимодействия между Kif21a и микротрубочками может приводить к дефектам аксонального транспорта ростовых материалов и сигналов, необходимых для роста аксонов.

Как же разные мутации продуцируют разные клинические фенотипы, принимая во внимание, что все они локализуются вβIll-tubulin? Ответ авт. получили в серии биохимических и cell-imaging подходов, чтобы определить эффекты разных мутаций на функцию микротрубочек. Во-первых, бесклеточная система была использована, чтобы продемонстрировать, что некоторые мутации нарушают способность tubulin формировать гетеродимеры, это является обязательным условием для полимеризации тубулина в микротрубочки. Во-вторых, авт. использовали дрожжевую модельную систему, чтобы протестировать эффекты одиночных мутаций TUBB3 и установили. что все мутантные линии дрожжей обладают определенной степенью резистентности к фармакологически индуцируемой дестабилизации микротрубочек. Это подтверждает предыдущие эксперименты, показавшие, что мутации TUBB3 увеличивают стабильность микротрубочек. Наконец, обратились к cell imaging, используя α-tubulin, нагруженный yellow fluorescent protein (YFP) или YFP-меченные kinesins KiрЗр и Kip2p. Эти эксперименты показали, что некоторые из мутаций делали скорость деполимеризации микротрубочек менее динамичной, приводя к усилению стабильности микротрубочек. Интересно, что imaging YFP-Kip3p и YFP-Kip2p показало, что большинство из распространённых TUBB3 мутаций (E410, D417, and R262) снижают локализацию кинезинов на кончиках микротрубочек. Это указывает на то, что мутации не только нарушают динамику микротрубочек, но и также нарушают взаимодействие микротрубочек с белками, которые используют систему микротрубочек, подобно наблюдениями у мутантных мышей.

Исследование Tischfield et al. ответило на многие вопросы относительно влияния мутаций TUBB3, но многие ещё остались. Во-первых, почему мутации в TUBB3 вызывают дефекты роста аксонов, тогда как мутации в TUBA1A и TUBB2B прежде всего вызывают нарушения миграции нейронов? Базируясь на клинических фенотипах, можно предположить, что функции этих генов отличаются во время развития головного мозга; TUBB3, по-видимому, наиболее важен во время ведения аксонов, но безразличен для миграции нейронов. Т.к. потеря TUBB3 ведет к увеличению стабильности микротрубочек, то это может указывать на то, что миграция нейронов может нуждаться в повышенной стабильности микротрубочек, тогда как рост аксонов может нуждаться в более динамичных микротрубочках в ростовом конусе. Однако, хотя мутации и продуцируют разные фенотипы, все они вызывают нарушения гетеродимеризации tubulin приводя в целом к аберрантной полимеризации микротрубочек (Figure 1). Второй вопрос в том, нарушают ли мутации TUBB3 взаимодействие микротрубочек с tubulin-взаимодействующими белками, подтверждается, что TUBB3 мутации ингибируют взаимодействие микротрубочек с кинезиновыми моторными белками. Однако поскольку субъединицы tubulin д. взаимодействовать с молекулярными шаперонами, чтобы складываться соответственно перед полимеризацией в микротрубочки (Lewis et al., 1997), возможно, что мутации TUBB3 нарушают также взаимодействие tubulin с шаперонами или др. tubulin-модифицирующими белками. Ответ на этот вопрос мог бы также предоставить информацию, почему разные мутации TUBB3 дают разные клинические проявления. Напр., возможно. что разные генетические мутации могут препятствовать взаимодействию tubulin с индивидуальными tubulin-взаимодействующими белками (включая шапероны), которые экспрессируются и используются в разные моменты времени развития нейронов, приводя к разным клиническим исходам. Итак, мутации TUBB3 вместе с недавно открытыми мутациями TUBB2B и TUBA1A, чётко демонстрируют, что динамика микротрубочек играет ключевую роль в развитии головного мозга.