Conditional Gene Inactivation Reveals Roles for Fgf10 and Fgfr2 in Establishing a Normal Pattern of Epithelial Branching in the Моuse
Lung
 DEVELOPMENTAL DYNAMICS 238:1999-2013, 2009 | |
|
Fibroblast growth factor 10 (FGF10) signaling through FGF receptor 2 (FGFR2) is required for lung initiation. While studies indicate that Fgf10 and Fgfr2 are also important at later stages of lung development, their roles in early branching events remain unclear. We addressed this question through conditional inactivation of both genes in mouse subsequent to lung initiation. Inactivation of Fgf10 in lung mesenchyme resulted in smaller lobes with a reduced number of branches. Inactivation of Fgfr2 in lung epithelium resulted in disruption of lobes and small epithelial outgrowths that arose arbitrarily along the main bronchi. In both mutants, there was an increase in cell death. Also, the expression patterns of key signaling molecules implicated in branching morphogenesis were altereв and a proximal lung marker was expanded distally. Our results indicate that both Fgf10 and Fgfr2 are required for a normal branching program and for proper proximal-distal patterning of the lung. Developmental Dynamics 238:1999-2013, 2009. © 2009 Wiley-Liss, Inc.
 The mouse lung airway forms branches in three patterns, as illlustrated in colors: blue is domain ‘bottle-brush’ branching; green is flat branching; red is 3-D right-angle branching.
Рисунки из статьи The branching programme of mouse lung development
|
Лёгкие состоят из сложной сети эпителиальных веточек, которые являются критическими для нормальной функции органа. Эта сеть возникает в результате трех способов образования веточек, используя iteratively относительно простые последовательности (Metzger et al., 2008). Доказательства такого стереотипического формирования паттерна указывают на то, что существует ограниченный генетический контроль ветвления в легких. Образование разветвлений и формирование паттерна управляются реципрокными сигнальными взаимодействиями между популяциями эпителиальных и мезенхимных клеток (Cardoso and Lu, 2006). Эти взаимодействия обеспечиваются за счет нескольких сигнальных молекул, которые вместе со своими рецепторами, экспрессируются динамически в эпителии, мезенхиме легких в том и др.
Передача сигналов Fibroblast growth factor (FGF), как было установлено обеспечивает эпителиально-мезенхимные взаимодействия во время развития легких. 6 FGFs экспрессируются в легких, но из них только Fgf10 важен для формирования лёгких, которое инициируется на (E) 9.5 день эмбриогенеза (Warburton et al., 2005). Несколько линий доказательств указывают на то, что Fgf10 действует как хемоаттрактант для эпителия лёгких. Fgf10 экспрессируется в определенным образом расположенных сайтах в мезенхиме, начиная с самых ранних формирования легких, паттерна, который сдвигается динамически к сайтам образования проспективных зачатков (bud) в ходе всего развития (Bellusci et al., 1997). В In vitro исследованиях лишенные мезенхимы дистальные эпителиальные кончики, культивируемые в среде, содержащей рекомбинантный FGF10, увеличиваются, чтобы сформировать кисто-подобные структуры и затем и зачатки (Bellusci et al., 1997). Кроме того, обнаженные эпителиальные кончики пролиферируют и мигрируют в направлении кусочка, нагруженного FGF10 (Weaver et al., 2000).
Генетические доказательства сходным образом указывают на то, что передача сигналов FGF играет ключевую роль в раннем развитии легких. Нокаутные по Fgf10 мыши формируют трахею, но неспособны формировать легкие, демонстрируя тем самым, что ген Fgf10 необходим для инициации легких (Min et al., 1998; Sekine et al.. 1999). Анализ мутантов по FGF receptor (FGFR) выявил сходную потребность. Fgfr2 нулевые мыши погибают вскоре после имплантации, но у слитых химер, несущих нулевой аллель Fgfr2 преодолевается эта ранняя потребность и они доживают вплоть до рождения (Arman et al.. 1998, 1999; De Moer-looze et al., 2000). У этих мутантов обнаруживается агенез легких, как и у мышей, несущих нулевой аллель Fgfr2b, альтернативно сплайсированную изоформу Fgfr2, экспрессируемую только в эпителии (De Moerlooze et al., 2000). И химеры и Fgfr2b мутанты обнаруживают легочные фенотипы, напоминающие таковые у Fgf10 нулевых мышей. Эти данные, если рассматривать их вместе с доказательствами, полученными с помощью митогенных методов, демонстрируют, что FGF10 соединяется с высоким сродством и специфически с FGFR2b (Zhang et al., 2006), указывая тем самым, что путь FGF10-FGFR2 необходим для инициации легких.
Экспериментальные доказательства указывают на то, что помимо своей критической роли во время инициации легких Fgf10 и Fgfr2 продолжают функционировать позднее в развитии легких. Недавнее исследование показало, что инсерция lacZ кассеты в регуляторную область Fgf10 создает Fgf10 гипоморфных мутантов (Kelly et. al.. 2001; Mailleux et al., 2005). Эти мыши обладают маленькими легкими во время или перед рождением, в которых эпителиальное ветвление снижено (Ramasamy et al., 2007). Трансгенная экспрессия Fgf10в легочном эпителии нарушает морфогенез ветвления перинатально и вызывает образование легочных опухолей (Clark et al., 2001). Сходным образом, когда растворимая доминантно негативная форма Fgfr2 трансгенетически экспрессируется в легочном эпителии, то перинатально наблюдается меньше ветвлений, тогда как в постнатальных легких обнаруживается эмфизема (Peters et al., 1994; Hokuto et al., 2003). Эти результаты описывают роль Fgf10 и Fgfr2 в формировании эпителиальных веточек на поздних стадиях развития легких.
Итак, упомянутые выше исследования фокусируются преимущественно на поздних онтогенетических событиях, таких как дифференцировка эпителиальных и мезенхимных клеток и определении количества конечных эпителиальных веточек. Хотя, по крайней мере одна группа, изучала ветвление на ст. E12.5 (Ramasamy et al., 2007), ни одно из исследований не исследовало роли Fgf10 и Fgfr2 в морфогенезе ветвления непосредственно после инициации легких. В данном исследовании мы условно инактивировали каждый из этих генов, чтобы исследовать их функцию в эпителиальном ветвлении на ранних стадиях легочного развития. Мы установили, что образование древа из эпителиальных веточек снижается в обоих случаях, но в разной степени. Мы охарактеризовали наблюдаемые изменения путем изучения некоторых аспектов развития легких. Мы показали, что жизнеспособность клеток снижается у этих мутантов. Мы исследовали эффекты, что инактивация Fgf10 и Fgfr2 существенна и для др. сигнальных путей в развитии легких. Экспрессия некоторых ключевых молекул, включая bone morphogenetic protein 4 (Bmp4), sonic hedgehog (Shh) и сам Fgf10, изменяется в результате снижения передачи сигналов FGF10-FGFR2. Наконец, мы показали, что формирование proximal-distal (P-D) паттерна легких нарушено у этих мутантов. DISCUSSION Мы показали, что сигнальные пути Fgf10 и Fgfr2 влияют на ветвление в легких путем поддержания клеточной жизнеспособности и регуляции уровней и/или паттернов сигнальных молекул, которые существенны для развития легких. Кроме того, мы показали, что снижение или Fgf10 в легочной мезенхиме или Fgfr2 в легочном эпителии вызывают экспансию проксимального легочного маркера, указывая тем самым. что эти гены играют роль в формировании P-D паттерна легких. FGF10 Signaling Through FGFR2 Is Essential for Normal Branching Morphogenesis У обоих мутантов. охарактеризованных в данном исследовании, мы наблюдали нарушение ветвления веточек для долей лёгких, это указывает на то, что Fgf10 и Fgfr2 необходимы для установления нормального паттерна ветвления во время ранних стадий легочного развития. Хотя продемонстрирована общая потребность в Fgf10 and Fgfr2, эти два мутанта обнаруживают существенно различные фенотипы. Изучение сходства и различий в фенотипах между этими мутантами предоставляет информацию о некоторых аспектах динамики передачи сигналовFGF10-FGFR2.
Помимо Fgf10, несколько др. FGFs участвуют в морфогенезе ветвления, включая Fgf9, который экспрессируется с инициальных стадий ветвления (Colvin et al., 1999; del Moral et al.. 2006), Fgf1 и Fgf7, которые впервые экспрессируются между E13.5 и E14.5 (Fu et al., 1991; Mason et al., 1994; Finch et al., 1995), Dermol-cre; Fgf10 мутантные легкие часто лишены эпителиальных веточки для ростральной доли, указывая тем самым, что Fgf10 существенен для событий раннего ветвления сразу за инициацией легких и что др. FGFs, такие как Fgf9, не могут поддерживать эпителиальные выросты в отсутствие Fgf10. В противоположность ростральной доле ветвление идет для остальных долей у Dermol-cre;Fgf10 мутантов. Продолжающееся ветвление д. быть обусловлено остаточной экспрессией Fgf10 в этих долях или альтернативно, ветвление может обеспечиваться дополнительными FGFs на более поздних стадиях. Т.о., результаты с мутантами Dermol-cre: Fgf10 указывают на то, что Fgf10 является принципиальным FGF, ответственным за инициальные стадии ветвления, хотя остается возможным, что дополнительные Fgfs действуют вместе с Fgf10 на более поздних раундах ветвления.
Передача остаточных сигналов FGF10-FGFR2 у обоих мутантов предоставляет дополнительную информацию о том, как этот путь влияет на ветвление в легких. У Sftpc-cre :Fgfr2 мутантов, Fgfr2 транскрипты обнаруживались в изолированных эпителиальных клетках на ст. E12.5, а также после инициации морфогенеза ветвления. В отличие от ветвления трахей у дрозофилы, где одиночная FGFR-позитивная клетка м. управлять выростом нормальной веточки (Ghabrial and Krasnow, 2006), персистенция изолированных FGFR2-позитивных клеток у Sftpc-cre;Fgfr2 мутантов не ведет к нормальному удлинению веточки. Это наблюдение указывает на то, что критическая масса клеток способна отвечать на передачу сигналов FGF10, это необходимо для для продолжения выростов. Сходный феномен, при котором минимальное количество клеток необходимо для принятия онтогенетических решений, уже давно наблюдался в др. онтогенетических событиях и обозначен как "community effect" (Gurdon, 1988). Мутантный фенотип Dermol-cre;Fgf10 также согласуется с этой концепцией эффекта сообщества. Уменьшенное количество веточек образуется у этих мутантов возможно потому, что меньшие группы чувствительных клеток воспринимают количество сигналов FGF 10, преодолевающее порог, необходимый для выростов. Интересно, что, несмотря на снижение передачи сигналов FGF10, веточки, которые образуются у Dermol-cre; Fgf10 мутантов,, по-видимому, не оказываются уже в диаметре по сравнению с контролем. Это наблюдение указывает на то, что диаметр веточек контролируется независимо от потребности в Fgf10 для разветвления.
Наконец, у обоих проанализированных мутантов мы обнаружили существенные мезенхимные выросты, не сопровождаемые появлением эпителиальных веточек. Напр., у Dermol-cre;Fgfl0 мутантов мезенхимный вырост в позиции ростральной доли персистирует, даже когда эпителиальная веточка к ростральной доле отсутствует. Эти наблюдения указывают на то, что выросты эпителиальных веточек несущественны для мезенхимных выростов во время инициации долей. FGF Signaling Is Required for Epithelial Cell Survival Как Dermol-cre;Fgf10, так и Sftpc-cre; Fgfr2 мутанты обнаруживают эктопическую гибель клеток, этот результат согласуется с предыдущими находками, это указывает на то, что передача сигналов FGF важна для жизнеспособности клеток в др. онтогенетических установочных параметрах (Chi et al.. 2003; Verheyden et al., 2005). Величина клеточной гибели, наблюдаемой у Sftpc-cre: Fgfr2 мутантов, повышена в своей интенсивности более обширна, чем наблюдаемая у мутантов Dermol-cre;Fgf10. Эта вариация фенотипов скорее всего обусловлена различиями в величине резидуальной передачи сигналов FGF у двух мутантов. Доказательства подтверждают, что наблюдаемые эпителиальные фенотипы не обусловлены лишь клеточной гибелью. У обоих мутантов дефекты ветвления наблюдаются последовательно, начиная со ст. E11.25 (Fig. 3). В то время как эктопическая гибель клеток обнаруживается также на этой стадии, она обнаруживается лишь у приблизительно у половины мутантных легких. Сравнение этих результатов указывает на то, что морфогенез фенотипа предшествует увеличению клеточной гибели. Мы полагаем, что увеличение клеточной гибели не может объяснить наблюдаемые изменения в генной экспрессии. Некоторые из проанализированных генов, включая Shh и Fgfr2, согласно TK probe, экспрессируются в поксимальном и дистальном легочном эпителии. Их экспрессия в проксимальном эпителии не снижается у мутантов по сравнению с контролем на ст. E12.5 (Figs. 3, 5), даже если увеличивается гибель клеток в этой ткани (Fig. 4). Более того, экспрессия Fgf10 и Sox2 увеличивается у обоих мутантов на ст. E12.5 (Figs. 6, 7), даже когда наблюдается повышенная клеточная гибель в их соотв. доменах экспрессии. Т.о., мы склоняемся к объяснению, что изменения в генной экспрессии обусловлены нарушением регуляции с помощью FGF10-FGFR2 этих генов. FGF Signaling Regulates Important Lung Development Factors Предыдущие исследования привели к предложению модели, согласно которой взаимодействия обратной связи между Fgf10, Bmp4 и Shh являются существенными для управления нормальным паттерном выроста веточек (Chuang and McMahon. 2003). В частности было предположено, что FGF 10 способствует экспрессии как Bmp4, так и Shh в дистальном эпителии. Передача сигналов SHH и BMР4 затем образует петлю обратной связи, чтобы ингибировать экспрессию/функцию Fgf10, это ведет к подразделению домена экспрессии Fgf10. Этот латеральный сдвиг экспрессии Fgf10 управляет выростом новой эпителиальной веточки. Мы установили, что Shh и Bmp4 подавляются как у Dermol-cre;Fgf10, так и Sftpc-cre; Fgfr2 мутантов. Наши культуры in vitro также продемонстрировали, что экспрессия Shh усиливается в присутствии экзогенного FGF10 белка. Эти данные указывают на то, что передача сигналов FGF10-FGFR2 позитивно регулирует экспрессию в эпителии легких Shh и Bmp4, подтверждая одну из граней модели. В подтверждение второго аспекта модели, предполагающей регуляцию Fgf10 петлей обратной связи, предыдущие данные показали, что BMP4 ингибирует функцию FGF 10 (Weaver et al., 2000). Более того, трансгенная избыточная экспрессия Shh в легочном эпителии ведет к подавлению экспрессии Fgf10 , тогда как Shh нулевые мутанты обнаруживают позитивно регулируемую экспрессию Fgf10 (Bellusci et al., 1997; Pepicelli et al., 1998). В соответствии с пониженной экспрессией Shh и Bmp4 у Dermol-cre;Fgf10 и Sftpc-cre:Fgfr2 мутантов, мы также наблюдали увеличение экспрессии Fgf10. Т.о., наши данные согласуются с ранее опубликованными данными и с возможностью, что SHH и/или BMP4 ингибируют экспрессию Fgf10. FGF Signaling Causes the Expansion of a Proximal Lung Epithelial Marker Результаты изучения мутантов Dermol-cre;Fgf10 и Sftpc-cre;Fgfr2 показали, что путь передачи сигналов FGF10-FGFR2 играет роль в формировании P-D паттерна эпителия легких. Мы наблюдали снижение экспрессии дистального маркера Sox9 у наших мутантов. Этот результат согласуется с предыдущими наблюдениями, сделанными на гипоморфном мутанте Fgf10, где экспрессия дистальных маркеров, таких как Surfactant Protein В и NKX2.1 была снижена на поздних стадиях развития (Ramasamy et al., 2007). Экспансия проксимального маркера Sox2 у обоих проанализированных мутантов предоставляет более убедительные доказательства, что передача сигналов FGF10-FGFR2 регулирует формирование P-D паттерна эпителия. Одним из возможных объяснений этого является то, что передача сигналов FGF10 через FGFR2 регулирует клеточные адгезивные взаимодействия или клеточную сортировку между дистальными клетками, которые воспринимают сигнал и проксимальными клетками, которые не воспринимают сигнал. Однако в свете доказательств, демонстрирующих, что FGF10 негативно регулирует экспрессию Sox2 в эпителии передней кишки (Que et al., 2007), мы склоняемся к гипотезе, согласно которой путь FGF 10-FGFR2 регулирует формирование P-D паттерна за счет ингибирования проксимальной судьбы и генной экспрессии.регулирует ли FGF экспрессию Sox2 непосредственно или косвенно посредством др. сигнальных путей, предстоит определить.Др. FGF-регулируемые сигналы, такие как упоминаемые BMP4, участвуют в формировании P-D паттерна (Weaver et al., 1999). Более того показано, что передача сигналов WNT снижена у Fgf10 гипоморфных мутантов (Ramasamy et al., 2007). WNT сигналы в легочном эпителии, как было показано, ингибируют проксимальные легочные судьбы, способствуя дистальным легочным судьбам (Mucen et al., 2003; Shu et al., 2005; Yin et 2008). Передача сигналов FGF10-FGFR2 действует посредством этих сигнальных путей, устанавливая нормальный паттерне эпителиального ветвления.
|