Посещений:
МОРФОГЕНЕЗ ВЕТВЛЕНИЯ

Механизмы

Tissue remodelling through branching morphogenesis
Markus Affolter, Rolf Zeller & Emmanuel Caussinus
Tissue remodelling through branching morphogenesis

Branched structures are evident at all levels of organization in living organisms. Many organs, such as the vascular system, lung, kidney and mammary gland, are heavily branched. In each of these cases, equally fascinating questions have been put forward, including those that address the cellular and molecular mechanisms that regulate the branching process itself, such as where the branches are initiated and how they extend and grow in the right direction. Recent experiments suggest that cell competition and cell rearrangements might be conserved key features in branch formation and might be controlled by local cell signalling.


Рис.1.  |  Drosophila melanogaster trachea and vertebrate vasculature branching.


Рис.2.  |  Lung patterning by iterative programming./span>


Рис.3.  |  Molecular regulation of lung and kidney branching morphogenesis.


Box 1  | Quantitative modelling of the forces that shape tissues


Box 2  | Techniques to study the mechanics of tissues in intact organisms


Box 3  |  A self-regulatory signalling system controls limb bud organogenesis


Box 4  |  Branching in plants

DATABASES

Entrez-Gene

  • escargot
  • blistered
  • Fgf10
  • sprouty 2
  • Bmp2
  • Bmp4
  • Wnt11
  • Fgf7


    • UniProtKB
    Разветвленные структуры обнаруживаются на всех уровнях организации у живых организмов, от молекулярного уровня, к органеллам, клеткам, многоклеточным органам и всему организму. В частности многие органы у высших животных, такие как сосудистая система, легкие, почки и молочные железы, являются сильно разветвленные структуры. Процесс ветвления позволяет сильно увеличить область поверхности для функциональных причин (в легких, почках и молочных железах) или позволяет достигать удаленных мест в организме (напр., сосудистая сеть и трахейная система насекомых). Что же контролирует инициацию этих веточек и что регулирует правильное направление их расширения.
    В данном обзоре мы сконцентрируемся на ветвлении в эпителиальных тканях (в частности, на трахейной системе Drosophila melanogaster и почках, легких и молочных железах млекопитающих) и на ветвлении в endothelial tissue (сосудистой системе). Существенный прогресс был недавно достигнут в идентификации участвующих молекул и в функционировании этих молекул, связанной с клеточными активностями, контролирующими процесс ветвления. Во всех системах, которые мы здесь опишем, клетки составляют суть разветвленных органов и имеют эпителиальную или эндотелиальную природу. Эти клетки, в большинстве случаев поляризованы вдоль из апикально-базальной оси в ходе процесса ветвления (апикальная сторона,будучи обращенной лицом в просвет и базальная сторона противоположна просвету). Клетки слипаются др. с др. посредством E-cadherin слипчивых соединений (Box 1), но в некоторых примерах они устанавливают или повторно устанавливают полярность, чтобы генерировать функциональный эпителий. После процесса ветвления сеть просветов идет через все разветвленные структуры, создавая пространство для транспорта газов или питательных веществ. Мы не будем обсуждать огромное количество литературы. связанной с эпителиальной поляризацией и образованием просветов и укажем на недавние великолепные обзоры по этому вопросу1-5. Мы ограничимся самим процессом ветвления в разных системах.

    Branching of the fly tracheal system


    Наиболее хорошо охарактеризованным разветвленным органом является система трахей у D. melanogaster. Трахейная система является сильно разветвленной сетью эпителиальных трубок, которая позволяет кислороду достигать каждой клетки организма путем пассивной диффузии его в пространстве просвета. Благодаря доступности мощной генетической техники, используемой в комбинации с получением картин в живую высокого разрешения и с лазерным устранением (Box 2), и благодаря небольшому количеству клеток, которые составляют систему трахей, выявляется обстоятельный молекулярный сценарий контроля процесса ветвления6-8.
    Ветвление трахей начинается после инвагинации кластеров примерно из 80 клеток с поверхности эктодермы. Эти клетки полностью поляризованы вдоль апикально-базальной оси и организованы как эпителиальный слой вокруг центрального просвета. Это просветное пространство сильно усовершенствуется в ходе процесса ветвления. Трахейные клетки остаются поляризованными во время всего процесса и не делятся. Branchless (BNL), fibroblast growth factor (FGF) лиганд, инициирует процесс ветвления, запуская клеточную миграцию и функционируя на вершине иерархии клеточных взаимодействий, которые руководят процессом ветвления. Недавние исследования выявили новые роли передачи сигналов BNL (see below), и это исключает, что существуют комбинированные эффекты этих BNL-контролируемых клеточных поведений на морфогенез ветвления трахей (Fig. 1).
    BNL determines the tracheal branching pattern. Ключевая роль передачи сигналов BNL заключается в контроле клеточной подвижности9, 10. Bnl экспрессируется динамическим способом вокруг инвагинировавшего tracheal sac группами эктодермальных или мезодермальных клеток10. Клетки трахей, ближайшие к источнику BNL лиганда воспринимают его посредством FGF receptor (FGFR) Breathless (BTL) на своей базальной стороне, которые индуцируют образование многочисленных filopodia и в конечном итоге миграцию двух или трех клеток прочь от трахейного мешка, чтобы создать почко-образные выпячивания10 (Fig. 1a). Во время этого процесса активно мигрирующие клетки остаются полностью интегрированы в трахейный эпителий, а пространственная экспрессия Bnl (или доступность BNL лиганда) в клетках, соседних с трахейным мешком, детерминирует пространственную организацию веточек.
    Во время периода, когда формируется паттерн ветвления у ранних эмбрионов, по-видимому, отсутствует достоверная обратная связь экспрессии Bnl между клетками трахей и тканями мишенями, такими как эпидермис и мышцы, это указывает на то, что клетки трахей могут просто следовать 'building plan', инструктируемые окружающей тканью. Такой изысканный контроль трехмерного (3D) паттерна ветвления с помощью клеточного окружения может быть, по-видимому, обычным, т.к. веточки трахей д. направляться во все основные сайты, чтобы обеспечить кислородом, что важно для личиночного развития.
    BNL coordinates cell behaviour during extension. После образования зачатка передача сигналов BNL запускает взаимодействия среди клеток трахей, которые осуществляют иерархическую организацию клеток в ведущие (tip) клетки и ведомые (stalk) клетки11. Эти два клеточных фенотипа не являются пре-специфицированными. Вместо этого клетки конкурируют за положение в веточке, так что клетки с наивысшей активностью BTL рецептора (запускаемые с помощью наивысших уровней BNL), как полагают, занимают ведущую позицию, тогда как клетки с низкой активностью рецептора следуют за этими кончиковыми клетками и в конечном итоге формируют стебель. Конкуренция между трахейными клетками за ведущее положение использует Notch-обусловленную латеральную ингибицию (Fig. 1b), которая предупреждает дополнительные клетки от становления ведущими11 (see also the vascular branching section).
    BNL regulates cell intercalation. Когда BNL-индуцированный эпителиальный зачаток начинает удлиняться, то трахейные клетки большинства веточек подвергаются удивительному процессу intercalation12. Исследования по устранению клеток показали, что силы. индуцирующие этот удивительный процесс интеркаляции клеток генерируются за счет BNL-индуцированной миграции tip клеток13 (Box 1; Box 2). Когда кончиковые клетки мигрируют прочь от первоначального мешка, то они удлиняют веточку стебель и создают растягивающую нагрузку на остальные клетки. Эта растягивающая нагрузка существенна для и в конечном итоге запускает клеточную интеркаляцию, которая позволяет веточке удлиняться. Интересно, что клетки трахей в веточках, в которых удлинение сопровождается интеркаляцией клеток, существенно удлиняются. Исследования по устранению клеток установили, что такая характерная удлиненная форма клеток также является следствием сил, генерируемых миграцией кончиковых клеток и следовательно, передачей сигнала BNL (Fig. 1b,c).
    BNL regulates cell determination and sprouting. Чтобы сформировать полностью функциональную сеть трубок, независимо развивающиеся сегментные единицы оказываются взаимосвязанными благодаря событиям слияния веточек, а терминальные клетки на периферии сети нуждаются в соединении с тканями мишенями посредством многочисленных тонких клеточных выростов. Чтобы произошли такие события, два высоко специализированных типа клеток. т.наз. клетки слияния и терминальные клетки, специфицируются в соотв. временной и пространственной последовательности.
    В то время как клетки слияния позволяют двум независимым сетям просветов соединиться посредством сложного механизма hollowing сливающихся клеток, терминальные клетки выпускают многочисленные тонкие выпячивания с просветами, которые достигают практически всех клеток организма и делают возможным обмен кислородом. Передача сигнала BNL контролирует активацию генов, таких как escargot (в клетках слияния) и blistered (в терминальных клетках), которые и детерминируют эти типы клеток10 (Fig. 1c). Однако прямые гены мишени для этих транскрипционных регуляторов пока не идентифицированы и механизмы, лежащие в основе терминальой дифференцировки не установлены.
    BNL regulates oxygen-dependent branching. В противовес событиям, описанным выше, которые происходят в развивающихся эмбрионах, выпячивания терминальных веточек изменчивы и пластичны и могут регулироваться кислородом во время личиночного развития (ветвление у эмбрионов не зависит от кислорода). Поразительно, но снова BNL, который действует как chemoattractant, чтобы индуцировать и управлять формированием новых терминальных веточек14. Во время личиночной жизни, клетки, ощущающие недостаток кислорода, индуцируют экспрессию Bnl, который в свою очередь наводит новые терминальные веточки в её направлении. Кислород, поставляемый с помощью вновь сформированных терминальных веточек, уменьшает hypoxia, это ведет к снижению экспрессии Bnl и прекращению дальнейшего врастания окончаний (с помощью процесса аналогичного ангиогенезу у млекопитающих). Роль BNL может, следовательно, меняться от онтогенетического контроля у эмбрионов до физиологического контроля на личиночных стадиях.
    Клетки трахей также реагируют на гипоксию и они также увеличивают уровни BNL рецептора BTL15. Однако до какой степени паттерн ветвления трахей изменяется уровнями кислорода в обычных условиях, ещё предстоит установить. Некоторые результаты также указывают на то, что развитие личиночного паттерна во время эмбриогенеза в основном контролируется онтогенетическим способом и не зависит от уровней кислорода15.
    Хотя BNL является жизненно важным для столь многих важных ступеней, которые контролируют ветвление, многие др. сигнальные пути, такие как signal transducer and activator of transcription (STAT), epidermal growth factor (EGF), Decapentaplegic (DPP), Wingless (WG), Hedgehog (HH) и slit пути, также связаны с процессом ветвления (Refs 16, 17, 18, 19, 20). Особенно интересны в этом отношении молекулы slit, передающие сигналы посредством roundabout (ROBO) рецепторов, наиболее известны в контроле нахождения путей аксонами и непосредственно влияющие на цитоплазматические события в чувствительных клетках нейронов21. Однако BNL сигнальный путь безусловно основной в контроле процесса ветвления трахей.

    Branching of the developing vasculature


    Недавние исследования выявили неожиданное и удивительное сходство в клеточном поведении между ветвлением трахей у D. melanogaster и angiogenic sprouting у позвоночных. Хотя полностью функциональная сосудистая сеть, напр., у взрослых мышей создается миллионами клеток, становление сложного паттерна ветвления во время ангиогенеза во многих случаях контролируется на уровне одиночных клеток. Это означает, что индивидуальные клетки выполняют важные функции в установлении сложного 3D контура сосудистого древа (see below).
    VEGF induces angiogenic sprouting. В то время как клетки, которые ведут к ангиогенному разрастанию, как было установлено, формируют многочисленные филоподиальные выпячивания, несколько более ранних морфологических исследований выявили важные функции таких кончиковых клеток в создании сосудистого древа во время ангиогенеза, они не были полностью распознанными вплоть о недавнего времени. Однако жизненно важная роль специфического фактора роста, а именно, vascular endothelial growth factor (VEGF), в формировании кровеносных сосудов была открыта 20 лет тому назад22. VEGFA, кодируется одним из 4-х VEGF генов у млекопитающих, является ключевым для большинства. если не всех морфогенетических событий во время ангиогенеза, который контролирует миграцию, пролиферацию и жизнеспособность эндотелиальных клеток23-26. В плодотворном исследовании, Betsholtz and colleagues27 связали передачу сигналов VEGF с поведением кончиковых клеток и направленной миграцией (reviewed in Ref. 28). Используя раннюю постнатальную сетчатку мыши в качестве модельной системы, были продемонстрированы разные способы распределения VEGFA во внеклеточном пространстве, путем регуляции поведения эндотелиальных клеток с помощью агонистической активности VEGF receptor 2. В то время как миграция кончиковых клеток зависит от градиента VEGFA, пролиферация клеток стебля контролируется с помощью концентрации VEGFA. VEGFA секретируется предсуществующей сетью astrocytes и стимулирует образование и руководит ростом кончиковых клеток. Кончиковые клетки формируют многочисленные филоподии и мигрируют вдоль астроцитов, но клетки стеблей делятся под контролем VEGFA, чтобы обеспечить удлинение стебля. Подобно BNL в развивающейся трахее, VEGFA точно также контролирует ангиогенные врастания посредством образования филоподий эндотелиальными кончиковыми клетками (Fig. 1d). Однако в сосудистой сети передача сигнала VEGF также контролирует пролиферацию клеток стебля.
    VEGFA signalling controls tip and stalk cell formation. Как же выбираются кончиковые клетки? И как соседние клетки, которые могут ощущать сходные уровни VEGF, ингибируются, чтобы не стать самим кончиковыми клетками, это могло бы привести к миграции кластеров клеток или слоёв клеток скорее, чем к возникновению новых веточек? В серии работ выбор кончиковых клеток связывают с лигандом Delta-like 4 (DLL4) и его рецептором Notch 1 (Refs 29-34; rev. Refs 35,36). DLL4 является мишенью передачи сигналов VEGF в эндотелиальных клетках и преимущественно индуцируется в кончиковых клетках благодаря их близости к высоким уровням VEGF. Интересно, что потеря передачи сигналов DLL4-Notch 1 во время ангиогенеза in vitro и у эмбрионов мыши и рыбки данио вызывает эктопическое разрастание и увеличение количества кончиковых клеток (одинаково с результатами их потери в системе трахей D. melanogaster). Кроме того, анализ мозаиков в сетчатке мыши и в intersegmental vessels рыбки данио показал, что клетки, неспособные воспринимать сигналы Notch, быстрее адоптируют поведение кончиковых клеток, чем те, что воспринимают сигналы Notch. Всё это указывает на то, что индивидуальные эндотелиальные клетки на кончиках веточек конкурируют за лидирующее положение (т.е. за фенотип кончиковой клетки) и что эти клетки супрессируют tip cell фенотип у своих непосредственных соседей за счет экспрессии у себя DLL4 и презентации его в соседних клетках (Fig. 1d).
    Хотя детали такого конкурентного ингибирования ещё предстоит выяснить (see Ref. 28 for a more detailed discussion), очевидно, что паттерн ветвления сосудистого древа, который устанавливается с помощью sprouting ангиогенеза, в основном контролируется распределением VEGF и Notch-обусловленным ограничением фенотипа кончиковых клеток. VEGF секретируется многими разными типами клеток, чтобы индуцировать и привлечь новые сосуды. Кроме того гипоксия вызывает активацию VEGF37, так что миграция эндотелиальных клеток и sprouting ангиогенез индуцируются в направлении гипоксической области.
    И снова помимо передачи сигналов VEGF и Notch многие др. основные сигнальные пути участвуют в процессе ангиогенного ветвления. Особенно интересны молекулы, такие как semaphorins, slits и netrins, которые обладают привлекающими и отталкивающими свойствами на axonal growth cones и также необходимы для собственно сосудистого ветвления (rev. Refs 38,39). Несколько сотен лет назад анатомы обнаружили, что нервные волокна и кровеносные сосуды часто выстраиваются в линию и/или следуют параллельными курсами, а идентификация сходных привлекающих и отталкивающих сигналов дает объяснение этим морфологическим наблюдениям. Во многих или в большинстве случаев semaphorins, slits и netrins и соотв. их рецепторы модулируют реакцию эндотелиальных клеток на VEGF, или непосредственно или опосредованно. Хотя эти 'нейральные' сигналы наведения могут сами по себе и не управлять врастанием (sprouting), они ведут ангиогенные врастания в направлении или прочь от определенных областей, тем самым существенно влияя на финальный паттерн ветвления.
    Как сосуды, так и трахеи проникают почти повсюду в организме, это означает, что развивающиеся веточки привлекаются многочисленными клетками и типами клеток в эмбрионе. Гены, кодирующие D. melanogaster BNL (в трахеях) и VEGF у позвоночных (в ангиогенных врастаниях) обнаруживают чрезвычайно сложные паттерны экспрессии, обеспечивая привлекающими сигналами практически каждую ткань и создавая прообразы паттерна ветвления. Экспрессия обоих генов чувствительна к гипоксии, это указывает на способ преобразования уровней тканевого кислорода за счет стимуляции роста новых сосудов в гипоксические регионы.

    Branching of the mouse lung


    Лёгкие, почки и молочные железы занимают определенные объём в организме и процесс ветвления существенно ограничен 'мешком' мезенхимной ткани. Эти органы могут, до некоторой степени, развивать собственные паттерны ветвления в культуре органа, которые контролируются с помощью реципрокных взаимодействий обратной связи между ветвящимся эпителием и окружающей мезенхимой. В этом смысле, процесст почкования может обладать сходством с эпителиально-мезенхимной передачей сигналов обратной связи в зачатках конечностей позвоночных. Регуляторные петли обратной связи, которые контролируют реципрокные сигнальные взаимодействия между разными клеточными популяциями в зачатках конечностей, используют скоординированную регуляцию от, по крайней мере, трех основных сигнальных путей, которые контролируют инициацию, рост и завершение в основном само-регулирующим образом (Box 3).
    Stereotypical branching of the mouse lung bud epithelium. Легкие млекопитающих состоят от тысяч до миллионов воздушных веточек, организованных в замысловатый паттерн. В своей героической попытке, Ross Metzger в лаб. Mark Krasnow недавно описал 3D паттерн ветвления и клоны бронхиального дерева мыши путем реконструкции его онтогенетической истории вплоть до pseudoglandular стадии, благодаря анализу сотен онтогенетических промежуточных образований на фиксированных препаратах40. Результаты этого обширного и тщательного исследования оглушающие и поучительны; процесс ветвления кажется довольно стереотипическим, указывая, что он монтируется жестко и генетически контролируется во времени и пространстве - подобно ветвлению трахей у мух.
    разветвленное древо генерируется с помощью трех геометрически простых способов ветвления: domain branching, planar bifurcation и orthogonal bifurcation (Fig. 2). Эти три способа используются в трех разных временных последовательностях (но предсказуемым способом) на всем протяжении легочного ветвления. Доменовое ветвление происходит в начале каждого крупного разветвления, но если начинается ортогональное ветвление, то этот способ сохраняется. Между веточками, возникающими за счет доменового ветвления, может происходить планарная бифуркация, дающая две веточки, одна из которых подвергается доменовому ветвлению и другая снова дает бифуркацию планарным способом. Т.о., для каждой данной точки в развивающемся легком в данный момент последовательность способа ветвления оказывается предсказуемой в значительной степени, это указывает на то. что ветвление тонко организовано в пространстве и использует три способа геометрического ветвления (Fig. 2). Контролируются ли последующие события ветвления также тонко или более стохастически ещё предстоит исследовать.
    Krasnow с коллегами предполагают, что три стандартные подпрограммы контролируются функциями генетической периодичности (которые предопределяют, когда боковые веточки будут формироваться с помощью доменового ветвления ), функции бифуркации (которая предопределяет, когда веточки будут раздваиваться) и вращающей функции (которая предопределяет будет происходить бифуркация в плоскости или ортогональным способом). Важно, что все эти три функции базируются на генераторе веточек - ключевом установленном порядке, который инициирует и удлиняет веточки и который может быть идентичным в обоих случаях (аналогично функциям BNL в трахеях и VEGF в сосудах). Что это такое 'branch generator' в молекулярных и клеточных терминах? Др. словами, как инициируются веточки и как они удлиняются? Является ли генератор веточек также организатором веточек в кончиковые или стебельные структуры и существует ли молекулярное сходство с сигнальными сетями, которые контролируют органогенез зачатков конечностей (Box 3)?
    FGF from the mesenchyme promotes epithelial branching. Пионерский генетический анализ раннего развития легких мыши, инициированный группой Brigit Hogan's, предоставил информацию о молекулярных механизмах, которые контролируют инициацию ветвления легких и чем является скорее всего branch generator. Эти исследования установили, что сигнальные пути FGF, sonic hedgehog (SHH), bone morphogenetic protein (BMP), ретиноевой кислоты и Wnt, и многие транскрипционные факторы (напр., friend of GATA protein 2 (FOG2; также известен как ZFPM2) и GATA4 (Ref. 41)), необходимы для нормального морфогенеза ветвления эпителия лёгких.
    Базируясь на экспериментах по потере и избыточности функции и на паттернах экспрессии соотв. молекул в эпителиальных или мезенхимных клеточных слоях, были предложены многочисленные молекулярные сценарии, лежащие в основе процесса почкования (see Refs 42,43 for more detailed discussions). Все эти сценарии приписывают ключевую роль передаче сигналов FGF от мезенхимы эпителию, которая индуцирует образование зачатков. Последующие эпителиально-мезенхимные взаимодействия с использованием FGFs регулируют рост и ветвление и дистально-проксимальные эпителиальные взаимодействия, которые генерируют судьбы клеток кончика и стебля (see below) (Fig. 3a).
    Epithelial-mesenchymal feedback and branch extension. Fgf10 экспрессируется динамическим способом в дистальной мезенхиме вокруг эпителиального зачатка кончика и является важным для формирования зачатка и направленного роста44-46. FGF10 активирует путь передачи сигналов FGF преимущественно посредством FGFR2B, который экспрессируется эпителием и необходим для ветвления (Fig. 3a). Передача сигналов FGF активирует несколько генов в кончике зачатка, некоторые из которых возможно участвуют в спецификации кончика в противовес судьбе стебля в растущем зачатке. Одним из наиболее ранних генов, активируемых в ответ на передачу сигналов FGFR2 это sprouty 2 (Spry2))47, 48. SPRY2 негативно регулирует передачу сигнала FGF путем ингибирования или ослабления mitogen-activated protein kinase (MAPK) пути. Экспрессия Bmp2 и Bmp4 также индуцируется в дистальном эпителии с помощью передачи сигналов FGF49-51 и BMP4, как было установлено, играет роль в пролиферации, жизнеспособности и морфогенетическом поведении клеток дистального легочного эпителия50. Bmp4 экспрессируется также окружающей мезенхимой, но точная роль BMP4 из этого источника неясна.
    Др. ген, специфически экспрессирующийся в эпителии кончика зачатка, это Shh. SHH секретируемая сигнальная молекула и ключевой регулятор развития зачатка конечности44, 52 (Fig. 3a; Box 3). SHH, по-видимому, регулирует прогрессию, но не инициацию ветвления легочного эпителия, возможно за счет негативно регулируемой экспрессии мезенхимного Fgf10, которая запрещает дальнейшее расширение зачатка. Несколько дополнительных сигнальных путей участвует в регуляции проксимо-дистальной полярности во время роста веточек, включая лиганды из семейств Wnt и netrin49, 53-55. Т.к. эти лиганды кодируются членами крупных семейств генов, то необходимо точное выделение их сигнальных путей, чтобы получить больше информации об необходимости их функции для нормального морфогенеза ветвления эпителия легких.
    From genetics to cell behaviour. Мало известно о клеточных изменениях, которые индуцируются в среде вокруг формирующихся зачатков легких и в самом зачатке после FGF10-обеспечиваемой передачи сигналов. In vitro исследования показали возможность chemoattractant функции FGF10, но его точная роль в кончике зачатка остается неясной. FGF10 д. контролировать количество клеточных активностей, таких как клеточная миграция, конкурентноспособность, адгезивность, сортировка и пролиферация. Удаление FGFRs из клонов клеток, комбинированное с наблюдением в живую, может дать множество ответов, но необходимо решить некоторые технические затруднения.
    Итак, каковы же клеточные события, контролирующие ветвление? Как используется периодичность bifurcator и rotator функций, которые, как предполагают, влияют или управляют программой почкования? Влияют ли они все на описанный генератор зачатка? Исключено ли, что SPRY2 регулирует место инициации и количество веточек в специфических доменах и тем самым влияет ли на периодичность генератора40. Вовлечение SPRY2 в периодичность генератора может указывать на то, что регуляция с помощью обратной связи контролирует реакцию на FGF и является важной для этой стандартной субпрограммы (Fig. 3a). Ген shifty , по-видимому, кодирует регулятор проксимо-дистального регистра всех доменов ветвления40. Он важен для идентификации многих молекул, которые функционируют в генераторе периодичности, спецификаторе домена, бифуркаторе и ротаторе, поскольку они являются ключевыми игроками, которые генерируют разные геометрии способов ветвления.

    Kidney branching morphogenesis


    Во время развития дефинитивных, т. наз. метанефрических почек ветвление эпителия уретрического протока, (который д. сформировать собирающую систему) контролируется с помощью эпителиально-мезанхимных feedback сигнальных взаимодействий между эпителием уретрического зачатка и окружающей метанефрической мезенхимой56-58 (Fig. 3b). Уретрический зачаток пронизывает метанефрическую мезенхиму как следствие удлинения ножки и локальной пролиферации его дистального кончика, это ведет к характерному утолщению - ампуле59. Пролиферирующие клетки ампулы расширяют дистальный кончик билатерально, это приводит к симметричной бифуркации, а вновь с формировавшаяся ножка удлиняется до тех пор, пока не будет инициировано ветвление снова на дистальном кончике60. Последующие раунды ветвления уретрического эпителия происходят скоординированно, но не полностью синхронно.
    Первая бифуркация уретрического зачатка всегда симметрична, тогда как последующие события ветвления более разнообразны60. В частности, событие терминальных трифуркаций часто обнаруживается между вторым и 5-м раундами ветвления (18% от всех веточек). Многие из этих веточек в результате ремоделируются в бифуркационные веточки за счет дифференциального роста, который сдвигает одну ветвь в более проксимальное положение. Более того, большая фракция боковых веточек, которые возникают в из удлиняющиеся ножки скорее, чем из терминальной ампулы, возникает во время второго и третьего раундов ветвления у эмбрионов мыши (6% от всех веточек)60. Такие события бокового ответвления могут быть более распространенными во время развития почек человека, чем у мыши61.
    GDNF из мезенхимы контролирует уретрическое ветвление. Инициация выроста уретрического зачатка и морфогенез эпителиального ветвления контролируются с помощью glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), передающего сигналы от метанефрической мезенхимы к соотв. рецепторам, перестраивающимися во время трансфекции (RET) в Вольфовом протоке - протоке, который дает уретрический зачаток почки62. Образующийся уретрический зачаток и дистальные кончики проникающего и ветвящегося эпителия экспрессируют высокие уровни RET, тогда как первоначально низкий и униформный уровень экспрессии GDNF в метанефрической мезенхиме усиливает свою активность специфически в мезенхимных клетках, соседствующих с уретрическим зачатком59 (Fig. 3b). генетическая инактивация Gdnf, Ret и RET co-receptor GDNF family receptor alpha1 (Gfralpha1) у мышей вызывает почечную аплазию (отсутствие развития почек) в большой фракции мутантного эмбриона благодаря нарушению ветвления62. GDNF стимулирует пролиферацию и ветвление эпителиальных кончиков, а анализ химерных мышиных эмбрионов показал, что клетки, лишенные RET не колонизируют эти дистальные кончики63. Более того, производные клеток дистальных кончиков вносят вклад в производные новых кончиков и дистальные части новых ножек.
    Недавние исследования показали, что первичный уретрический зачаток образуется как следствие существенных клеточных перестроек в каудальной части Вольфова протока и стимулируется за счет передачи сигналов RET64. Анализ химер эмбрионов мышей показывает, что первичные клетки уретрического кончика выбираются в результате конкуренции, так что клетки с высокой активностью передачи сигналов RET перемещаются в регион будущего уретрического зачатка. Этот регион формирует псевдостратифицированный эпителий во время RET-зависимых клеточных перемещений, но сам по себе не зависит от передачи сигналов GDNF-RET64. Эти результаты вместе с тем фактом, что почечная аплазия Gdnf-дефицитных эмбрионов мыши устраняется с помощью трансгеном обусловленной униформной экспрессии GDNF в уретрическом эпителии65, указывает на то, что др. факторы участвуют в ограничении образования уретрического зачатка одним местом и в контроле упорядоченной прогрессии эпителиального ветвления. В самом деле, генетический анализ мышей выявил дополнительные пути, которые ингибируют формирование эктопических уретрических зачатков. В частности, дополнительные уретрические зачатки образуются у эмбрионов мыши, лишенных или эпителиального SLIT2 лиганда или мезенхимного ROBO2 рецептора66. Анализ показал, что SLIT2-обеспечиваемая передача сигналов ROBO2 в метанефрической мезенхиме ограничивает экспрессию GDNF в каудальном регионе вокруг уретрического зачатка. Эктопические уретрические зачатки и ветвление наблюдаются у эмбрионов мыши, лишенных внутриклеточного рецепторного тирозин киназного антагониста SPRY1, который обычно противодействует передаче сигналов GDNF-RET в Вольфовом протоке67.
    Epithelial-mesenchymal feedback and branch extension. После начала роста уретрического зачатка экспрессия Wnt11активируется в эпителиальных кончиковых клетках и передачи сигналов WNT11 вносит вклад в в распространение экспрессии мезенхимного Gdnf и ветвление как часть само-регуляторной эпителиально-мезенхимной петли обратной связи68. Установление для передачи сигналов WNT11-GDNF эпителиально-мезенхимной обратной связи и инициация ветвления нуждаются в редукции активности BMP4 за счет антагониста BMP gremlin 1 (GREM1) в мезенхиме, окружающей уретрический зачаток69, 70 (Fig. 3b). Эти взаимодействия напоминают сеть передачи сигналов эпителиально-мезенхимной обратной связи, которая контролирует развитие зачатков конечностей (Box 3). Инициация роста уретрического зачатка нарушается у Grem1-дефицитных эмбрионов, но восстанавливается при дополнительном генетическом снижении Bmp4 (Ref. 69). Обработка культивируемых почек BMP антагонистом GREM1 индуцирует дополнительные уретрические зачатки, тогда как усиление активности BMP ингибирует ветвление кончика и способствует элонгации ножки71.
    D противоположность др. рассмотренным системам ветвления морфорегуляторная роль FGFs во время развития почек всё ещё до конца не понята. Это возможно связано с функциональным перекрыванием среди FGF лигандов, которое по аналогии с FGFs, экспрессируемыми в зачатках конечностей, может указывать на лежащий в основе крепкий механизм (Box 3). Генетический анализ у мышей выявил Fgf7 и Fgf10, каждый из которых экспрессируется в метанефрической мезенхиме, регулируя уретрическое ветвление72, 73. Соответственно, инактивация Fgfr2 в уретрическом эпителии редуцирует количество кончиков в ампулах и ветвление и удлиняет ножку74. In vitro эксперименты показали, что FGFs могут регулировать ветвление, стимулируя пролиферацию и жизнеспособность клеток кончиков59. Всё это показывает, как разные сигнальные пути влияют на позиционирование уретрического зачатка, инициируют его рост и координируют эпителиальное ветвление (Fig. 3b).
    D то время как GDNF-RET путь, по-видимому, составляет 'двигатель', др. обсужденные пути, по-видимому, гарантируют пространственно и во времени правильную инициацию, ход и окончание морфогенеза эпителиального ветвления. Фактически отмечаются существенные молекулярные и механистические сходства между эпителиально-мезенхимными сигнальными взаимодействиями, контролирующими морфогенез конечностей и почек70. Поэтому вполне возможно смоделировать взаимодействия GDNF, BMP и FGF путей, так как это недавно было проделано для зачатков конечностей75 (Box 3). Предсказательная сила такого моделирования может предоставить тестируемые сигналы для лучшего понимания того, как эти пути взаимодействуют в морфогенезе эпителиального ветвления в почках и могут быть также расширены на др. ветвящиеся органы.

    Mouse mammary gland branching


    Молочная железа является эпидермальным придатком, состоящим из нескольких разного типа клеток, включая эпителиальные клетки (эпителиальные просветные и базальные миоэпителиальные клетки) и адипоцитов из жировых подушек. У развивающихся эмбрионов мыши формируются молочные плакоды и инвагинируют, чтобы сформировать зачатки76, 77. Во время морфогенеза ветвления молочных желез эпителиальные клетки подвергаются обширному ветвлению в жировых полушках. Затем эти эпителиальные зачатки врастают и ветвятся, чтобы сформировать рудиментарные ветвистые структуры.
    Наиболее эффектная фаза морфогенеза ветвления молочных желез происходит постнатально во время полового созревания, когда terminal end buds (TEBs; булавовидные структуры, представленные наружным слоем покровных (cap) клеток и клетками многослойной внутренней сердцевины) появляются на кончиках протоков, инициируя врастание и заполнение жировых подушек. Пролиферация TEB клеток ведет к элонгации протоков, а расщепление TEBs ведет к бифуркации протоков и генерации ветвления. Во время беременности обширные побочные ответвления ведут к дальнейшему разветвлению древа молочных желез (rev. Refs 78, 79, 80).
    Stochastic branching of the mammary epithelium. Ветвление эпителия молочных желез также регулируется как и ветвление легких и почек, но др. сигналами от эпителия или стромы, такими как BMP, Wnt и EGF76, 81-83. Кроме того, гормональный контроль играет важную роль в морфогенезе ветвления молочных желез79, 84-87. Однако в резком контрасте с др. процессами ветвления, не идентифицировано сигнала, который бы специфически экспрессировался бы стромой в регионах, которые формируют препаттерн выростов веточек. Процесс эпителиального ветвления в молочных железах, по-видимому, стохастический и поэтому, по-видимому, не контролируется жестким способом.
    Ветвление в молочных железах происходит в TEBs дихотомически или посредством развития новых веточек от предсуществующих протоков за счет бокового (lateral) ответвления. Др. отличием ветвления эпителия в молочных железах по сравнению с ветвлением в почках и легких то, что веточки заполняют уже предсуществующее пространство, жировые подушки, которые не растут настолько сильно, чтобы приспособиться к развивающемуся разветвленному древу. Возникающие веточки могут заполнять доступное пространство наиболее эффективно, используя механизм self-avoidance. В самом деле эпителиальные клетки в молочных железах обладают такими свойствами; новые веточки часто стартуют под острым углом к существующим и отклоняются или прекращают рост, если оказываются вблизи др. веточки88. Было предположено, что передача сигналов transforming growth factor-beta (TGFbeta) может участвовать в таком процессе89, который может быть в чем-то сходным с гомотипическими взаимодействиями по ограничению территорий ветвления в развивающихся нейронах (see, for example, Ref. 90).
    Tissue geometry and the extracellular matrix in branching. Поскольку локальные сигналы, направляющие рост веточек (такие как BNL, VEGF, FGF и GDNF сигналы в трахеях, сосудах, легких и почках, соотв. ) не идентифицированы в молочных железах, то предпринимались разные, подходы для выяснения механизма ветвления. Используя подход формирования микропаттерна, чтобы контролировать инициальную геометрию канальцев, образуемую эпителиальными клетками молочных желез в культуре, наблюдали, что форма канальцев диктует позицию последующего ветвления. После стимуляции с помощью EGF или hepatocyte growth factor (HGF), веточки инициируются только с кончиков канальцев, а не с их боковых строн, указывая тем самым, что позиционный контекст кодируется предсуществующей структурой89. Поскольку в этом подходе веточки эпителиальных клеток возникали в отсутствие мезенхимы, то секретируемые аутокринные ингибирующие сигнальные молекулы могут предопределять позиции веточек на кончиках канальцев.
    Интересно, что TGFbeta ингибирует морфогенез ветвления в молочных железах in vivo91, 92 и в micro-patterning подходах89, возможно путем индукции отложения компонентов внеклеточного матрикса. Поскольку клетки сконструированных канальцев продуцируют TGFbeta, а локальный минимум концентрации TGFbeta может создаваться на концах канальцев, то это может приводить к более низким уровням отложения внеклеточного матрикса и увеличению способности ветвиться. Хотя это и элегантный сценарий генерации локального сигнала для индукции ветвления, но необходимы дополнительные исследования in vivo, чтобы подтвердить существование такого способа ветвления. Micro-patterning подход, такой как предложенный в лаб. Bissell laboratory, может оказаться пригодным для количественного анализа.
    Cell behaviour during mammary epithelial branching. Чтобы визуализовать клеточное поведение, лежащее в основе элонгации и ветвления протоков, Werb с коллегами недавно использовали первичные, органотипические 3D культуры и получение долговременных конфокальных time-lapse картин93. Они показали. что клетки в удлиняющихся протоках реорганизуются в многослойный эпителий, мигрируют коллективно и преобразуются динамически без образования ведущих клеточных выпячиваний. Эти наблюдения указывают на то, что морфогенез ветвления использует активную подвижность как просветных, так и миоэпителиальных клеток. В то время как эпителиальные клетки продвигаются совместно, миоэпителиальные клетки, по-видимому, ограничивают элонгацию протоков.
    Интересно, что инактивация Fgfr2 во время ветвления в молочных железах при половом созревании показала, что FGFR2 необходим для развития TEB94. Более того, анализ мозаиков показал, что Fgfr2-дефицитные клетки оказывались не конкурентноспособными по отношению к Fgfr2 гетерозиготным соседям в пролиферативных частях TEBs, но не в менее пролиферативной проксимальной области протока95. Необходим ли FGFR2 исключительно для клеточной пролиферации в TEBs, или он может быть также важным для перестройки клеток, пока неизвестно.

    Emerging similarities and differences


    Ключевые сигнальные системы, контролирующие ветвление в некоторых отличающихся видах и органах, начинают обнаруживаться. Напр., у D. melanogaster трахеи и у позвоночных сосудистая система, передачи сигналов FGF и VEGF, соотв., контролируют процесс ветвления на многих уровнях в кончиковых клетках (напр., они контролируют цитоплазматические активности, экспрессию генов и конкурентноспособность клеток) и они, по-видимому, регулируют основные аспекты всего процесса ветвления. Во время васкуляризации VEGF контролирует также деления клеток стебля, тогда как во время развития трахей удлинение стебля осуществляется за счёт BNL-индуцированной интеркаляции клеток и изменения их формы. Сходным образом, FGF, GDNF и др. сигнальные пути обнаруживают разные эффекты на кончиковые и стебельковые клетки во время морфогенеза ветвления легких и почек. Эти исследования выявили важное и общее свойство морфогенеза ветвления: растущие веточки поляризованы благодаря установлению кончика и стебля. На клеточном уровне немногие клетки или одиночная клетки занимают лидирующую позицию (и только эти клетки обнаруживают активное миграторное поведение) и за ними следуют клетки стебля в трахеях и васкулатуре. Эпителиальные клетки обычно конкурируют за ведущую позицию, а молекулярные механизмы, лежащие в основе этоко конкурентного поведения только начинают выявляться. Клеточные взаимодействия, которые детерминируют кончиковые и стеблевые структуры в трахеях и сосудистой системе зависят от Notch-определяемой латеральной ингибиции на уровне одиночных клеток.
    В др. системах ветвления клеточная сложность значительно выше, т.к. ветвящиеся кончики состоят из многих клеток, что делает невозможным, чтобы путь Notch участвовал в сегрегации кончиковых и стебельковых клеток. В такой сложной ситуации механизм сегрегации базируется скорее всего на клеточном сродстве (напр., ephrin сигнальная система). Кроме того, пролиферация клеток является важным фактором, вносящим вклад в элонгацию и ветвление этой сложной системы, возможно под влиянием митогенных факторов, таких как FGFs и GDNF. Хотя исследования всё ещё в основном концентрируются на ключевых сигнальных системах, которые регулируют инициацию и поддержание ветвления, недавние исследования показали, что направленный рост находится под влиянием сигналов, которые были первоначально идентифицированы по их функции в наведении ростового конуса. Это впервые было установлено и понято для ветвления трахей и сосудистой системы, но начинает выявляться как столь же важное свойство и во время морфогенеза легких, почек и молочных желез. Эти сигнальные системы могут влиять на структуру кончиков или стеблей в легких, почках и молочных железах.

    Outlook


    Two of the most burning questions still await clear answers. First, how are branch points defined in time and space? The distributions of VEGF and FGF and the temporal and spatial control of signalling in tip cells (probably regulated by other cues such as neuronal axon guidance systems) probably specify most of the branching patterns in the trachea and vasculature. The molecular and cellular logic of lung, kidney and mammary gland branch point specification remains to be unravelled. At present, it seems that tight spatial control is at work during lung branching, reiterative branching in the kidney and a space-filling mechanism during mammary gland branching morphogenesis. Similar mechanisms might, however, control the branch generator; that is, control the tips of the outgrowing epithelial buds. Second, how is branching morphogenesis correctly terminated? Feedback loops regulating termination of branching morphogenesis have been uncovered for the trachea and vasculature. Hypoxia induces ligands (BNL and VEGF, respectively) to induce new branches or sprouts, which, in turn, cause a reversion of the hypoxia by in-growing vessels that deliver oxygen, and thereby terminating the response. Similar self-regulatory epithelial–mesenchymal feedback loops also induce the termination of limb bud outgrowth (Box 3), and it will be interesting to determine whether there are great mechanistic similarities between this and the termination of kidney and lung branching morphogenesis.
    It will take many more genetic and reverse genetic analyses, combined with live imaging studies, mosaic analyses and cell ablation experiments, to formulate a comprehensive model for lung, kidney and/or mammary gland branching morphogenesis. Helped by complementary analyses in simpler branching systems or budding structures (Box 4), we expect to soon see the first attempts to model branching in mammalian organs, taking into account the wealth of experimental data gathered. Although this might uncover interesting feed-forward and feedback mechanisms, it will take more time to link these signalling interactions to the cell behaviours that control the different aspects of branching morphogenesis discussed here. Mechanical forces will have to be taken into account in the morphogenetic processes, and physical constraints such as growth constraints and physical barriers, exerted by the extracellular matrix or by adjacent organ structures, will undoubtedly constitute key aspects of branching control mechanisms. It is important to realize that branching morphogenesis is integral to the proper formation and growth of all organs, as they all have to be sufficiently vascularized. This is a major unsolved problem of in vitro engineered tissues and organs. Therefore, the elucidation of the molecular mechanisms controlling branching morphogenesis will contribute to a much better understanding of organogenesis in general and might unravel mechanisms that are relevant to other, less spectacular morphogenetic processes.
    Сайт создан в системе uCoz