CPCs | HSCs |

Протоколы картирования судеб устанавливают клональные взаимоотношения между родоначальниками, несущими репортёрный ген и их производныме (1, 2), но не предоставляют информацию о свойствах самообновления и клоногенности клеток предшественников или клональном происхождении дочерних клеток in vivo (3). Из-за этих ограничений, viral gene-tagging остается наиболее аккуратной стратегией для анализа роста стволовых клеток (3-8). Полу-случайные инсерции ретровирусных и лентивирусных векторов представлю собой эффективный инструмент для генетического маркирования, делающим возможным идентификацию потомков, генерируемых после дифференцировки стволовых клеток. Ретровирусы и лентивирусы интегририованы постоянно в геноме клеток хозяев; сайт инсерции вирусного генома наследуется популяцией, происходящей из родительской клетки (6) и может быть амплифицирован с помощью PCR. Т.о., обнаружение сайтов интеграции составляет уникальный подход к выявлению самообновления, клоногенности и мультипотентности стволовых клеток in vivo. Пока эта методология применялась к костному мозгу (4-6) и головному мозгу (3, 7, 8), но не использовалась для характеристики механизмов, регулирующих кардиальный гомеостаз и патологию.

Реализация этой техники во взрослом сердце важна для неоспоримой демонстрации резидентных кардиальных стволовых клеток и способности миокарда к спонтанной регенерации. Более того, считается, что кардиомиоциты имеют длительную продолжительность жизни и что их оборот медленный и зависим от возраста (2,9) , это становится спорным (10-12). Это мнение не согласуется с серией сообщений, показавших критическую роль, которую апоптоз играет в удалении поврежденных миоцитов и необходим для замещения погибших клеток новыми кардиомиоцитами у животных и человека (13). Недавняя переоценка immortal strand гипотезы деления стволовых клеток (14) вместе с необходимостью интерпретировать по-новому методы долговременного сохранения метки для оценки кинетики роста стволовых клеток, потребовала использование комплементарных стратегий для измерения оборота кардиальных клеток. В данном исследовании мы комбинировали viral tagging с BrdU пульс-чейзом in vivo, чтобы охарактеризовать биологию c-kit-positive cardiac progenitor cells (CPCs) сердца мыши и человека (11, 15, 16).

Результаты

Анализ клональности cardiac progenitor cells (CPCs) и оборота миоцитов in vivo требует генетического мечения недифференцированных клеток, так чтобы маркер индивидуальной материнской клетки передавался специализированном потомкам. Ниши CPC в предсердиях и верхушке сердца мыши инфицировали лентивирусом, несущим EGFP, а судьба меченных клеток определялась спустя 1-5 мес. Идентифицирован общий сайт интеграции в изолированных CPCs, кардиомиоцитах, эндотелиальных клетках (ECs) и фибробластах, демонстрируя самообновление и мультипотентность CPC и клональное происхождение популяций дифференцированных клеток. Затем, степень EGFP-lentiviral инфекции CPCs была оценена равной 2-4 дням после инъекции, а количество миоцитов, экспрессирующих репортерный ген измеряли спустя 6 мес.,. BrdU пульс-чейз протокол также использовался в качестве дополнительного метода для анализа оборота миоцитов. В период 6 мес. каждая EGFP-позитивная CPC клетка делилась приблизительно 8 раз, генерируя 230 кардиомиоцитов; это значение согласуется с количеством вновь формируемых клеток, меченных с помощью BrdU. Чтобы определить, являются ли человеческие CPCs (hCPCs) самообновляющимися и мультипотентными, эти клетки трансдуцировали EGFP-лентивирусом и инъецировали после острого инфаркта миокарда иммуносупрессированным крысам. hCPCs, миоциты, ECs и фибробласты, собранные их регенерированного миокарда обнаруживали общие сайты интеграции вирусов в геноме человека. Т.о., полученные результаты указывают на то, что взрослое сердце содержит пул стволовых клеток, которые регулируют кардиальный гомеостаз и репарацию.

Discussion

Признание, что сердце содержит пул клеток предшественников, ставит вопросы, связанные с функциональным значением этого. Несколько лабораторий идентифицировали CPCs в постнатальном и взрослом сердце, места их хранения (11, 18), механизмы их дифференцировки (18, 20. 21) и их способность восстанавливать миокард после инфаркта (15, 16, 20-22). Неожиданно, мнение, что сердце обладает самое большее минимальной способностью репарировать самого себя, осталось неизменным (23). Исследования по отслеживанию клонов у мыши рассматриваются как золотой стандарт для выявления примитивных клеток в различных органах и их роли в формировании детерминированного потомства (1. 2). Однако эта стратегия не способна продемонстрировать самообновление и клоногенность клеток предшественников in vivo. Сходным образом, присутствие репортерного гена в зрелых клетках не может быть приписано одиночной клетке основательнице, это оставляет без ответа вопрос о мультипотентности стволовых клеток (3). Эти проблемы были разрешены в данном исследовании, где было использованы вирусная трансдукция для клонального отслеживания индивидуальных CPCs мыши и человека, чтобы определить их судьбу физиологически и после повреждения in vivo.

Генетическое мечение ретровирусами было предложено ботлее 20 лет тому назад (24) для характеристики in vivo мультипотентности гематопоэтических стволовых клеток (HSCs). Метод дифференцировки клонов стволовых клеток in vitro имеет прирожденные ограничения, включая возможность, что протоколы культивирования ведут к преимущественному приобретению селективного клонального фенотипа, маскирующего полный потенциал клетки основательницы. Сходным образом, идентификация множественных типов клеток в потомстве трансплантированных неклоногенных стволовых клеток не предоставляет прямых доказательств мультипотентности каждой доставляемой клетки. Эти проблемы были преодолены вирусным клональным маркированием, которое разработано для анализа HSCs костного мозга и производных кровяных клеток (4-6, 24). Отслеживание ретровирусом-обусловленных судеб и BrdU мечение были использованы для характеристики мультипотентности нейральных стволовых клеток в гиппокампе с субвентрикулярной зоне взрослых мышей (3, 7).

Вирусное мечение неприменимо к паренхиматозным органам, таким как сердце без возражений. Ограничения связаны с низкой эффективностью инфекции CPC и невозможностью собрать серийные выборки трансдуцированного потомства у мелких животных. Более того, место инсерции, которое наделяет селективными преимуществами или мешает росту одиночных клеток, легко преодолевается кровяными клетками (5), но не применимо к сердцу. Ограниченное количество инфицированных клеток в данном исследовании становится препятствием трансплантации трансдуцированных CPCs вторичным и третичным реципиентам. Это может представлять собой идеальную методологию для выявления самообновления CPC. Однако сохранность пула CPCs в атриальной и апикальной нишах в течение более 6 мес. строго указывает на то. что эти клетки сохраняют свою способность к самообновлению и делятся.

EGFP, широко используемый репортерный ген для анализа судеб клеток предшественников in vivo. Однако иммуногенный потенциал этого чужеродного белка ставит вопросы о пригодности его использования в долгосрочных опытах. Преобразованные пептиды из EGFP могут быть презентированы с помощью major histocompatibility complex на клеточной поверхности, индуцируя иммунную реакцию T клеток против меченных клеток (25). Величина иммунологического отторжения клеток, несущих EGFP, остается противоречивой и скорее всего она зависит от контекста (25). Действует ли этот феномен и в нашей системе предстоит определить. Мы имеем заниженные количества EGFP-позитивных CPCs и миоцитов, присутствующих спустя 6 мес. после инфекции лентивирусом. Дополнительная изменчивость, которая может влиять на оценку формирования миоцитов из CPCs связана с инсерцией провирусного integrant в репрессивных регионах мышиного генома (26). Однако молчание трансгена вмешивается в распознавание меченных клеток с помощью иммуноцитохимии, но не влияет на анализ сайтов интеграции с помощью PCR.

Как и в головном мозге (3, 7), внесение двух маркеров кардиомиогенеза, интеграции EGFP в геном мыши и BrdU мечения, указывало на то, что активация и дифференцировка CPCs является поступательным процессом, который приводит к достоверному обороту кардиомиоцитов в сердце молодых взрослых мышей. Этот феномен усиливается с хронологическим возрастом сердца, чтобы компенсировать прогрессивное увеличение гибели миоцитов у старых животных (12) и людей (27). Однако усиленная регенерация клеток не противодействует постоянной клеточной гибели в миокарде, приводящему к уменьшению числа паренхимных клеток в старом сердце. Дисбаланс между гибелью клеток и регенерацией с возрастом наблюдается и в др. органах, включая головной мозг, костный мозг, печень, поджелудочную железу и кожные меланоциты (28).

Наши наблюдения согласуются с мнением, что кардиальный гомеостаз регулируется с помощью компартмента резидентных CPCs и подтверждают мнение, что, хотя и неадекватное формирование миоцитов является соотв. компонентом регенерации миокарда в перегруженном сердце. Высокий уровень оборота миоцитов, выявленный с помощью вирусного мечения и BrdU мечения, находтся в противоречии с исследованиями картирования судеб (2) и др. анализами синтеза ДНК (17), это указывает на то, что очень незначительные, если вообще, происходят замещения миоцитов с возрастом. Противоположный феномен выявлен недавно с использованием инкорпорации ¹⁴C в сердце человека, в котором обновление миоцитов было обнаружено в основном у молодых людей, но драматически снижалось в старом патологическом сердце с нелеченной гипертензией, гипертрофией и инфарктом миокарда (9). Т.о. ¹⁴С ретроспективное датирование рождения кардиомиоцитов человека противоречит исследованиям по клональному слежению у мышей и предыдущим сообщениям, выявившим достоверную степень делящихся амплифицированных миоцитов, высокий митотический индекс миоцитов и увеличение количества миоцитов после инфаркта миокарда или гипертензивной гипертрофии у стариков (10.29). Стратегия ¹⁴C мечения была осуществлена в ядрах миоцитов, экспрессирующих контрактильный белок troponin I (Tnl). Локализация Tnl в ядрах является неожиданной и может соответствовать специфическому функциональному состоянию ограниченного пула клеток и может не представлять всю популяцию миоцитов.

Отсутствие оборота миоцитов, постулируемое в сердце мышей в возрасте 1 года (2) не согласуется с величиной гибели клеток, выявляемой в миокарде старых крыс. Сердце молодых взрослых мышей обычно обнаруживает степень апоптоза миоцитов ~ 300 клеток на миллион или 1/30 от 1% (30). Хотя это может выглядеть непоследовательно физиологически, продолжительность этой формы клеточной гибели составляет почти 4 ч. Т.о., ~ 1.800 миоцитов/10⁶ клеток теряется ежедневно в сердце. Т.к. имеется около 3.4 million миоцитов в левом желудочке мыши, то ~6.100 клеток в день на весь левый желудочек. В период в 6 мес. ~1.1 миллион миоцитов д. теряться и замещаться новыми клетками для сохранения кардиальной функции. Также исследования по слежению с использованием tamoxifen, чтобы активировать Cre-recombinase, обнаружили негативные эффекты на структуру и функцию сердца, приводящих к transient dilated кардиомиопатии (31), это может влиять на эволюцию стареющего сердца (2). Утечка трансгенов и невозможность выявить скорость оборота в одной пятой популяции миоцитов, не отвечающей на tamoxifen (2) ведет к дальнейшей путанице в интерпретации результатов картирования судеб, ставящей вопросы к заключению об обнаруженном обороте миоцитов с помощью этой генетической стратегии.

Итак, генетическое маркирование CPCs in situ представляет возможность оценить поведение постоянно присутствующих в ткани CPCs в неповрежденном сердце. Хотя степень оборота миоцитов в интактном сердце более медленная, чем скорость, с которой клетки обновляют сами себя в присутствии повреждения, врожденные свойства CPCs лучше всего характеризуются всё-таки в отсутствии повреждений. Критическим вопросом является, происходит ли репарация сердца после повреждения, воспроизводя ступени развития детерминации CPC клона в органе в устойчивом состоянии, при котором инвариантный механизм роста сохраняет пул стволовых клеток и продуцирует адекватное потомство. В данном исследовании также получена информация, касающаяся мультипотентности hCPCs и поликлонального происхождения миокардиальной регенерации после инфаркта. Была разработана стратегия для оценки поведения и функции in vivo стволовых клеток, вносимых в сердце. С помощью этого подхода, могут возникать клинически значимые вопросы клеточной терапии при сердечной недостаточности, включая клонально гетерогенные hCPCs и свойств репопуляции индивидуальных клеток. Получение позитивных результатов подкрепляет возможность, что hCPCs могут использоваться для поддержания при параличе сердца человека.