Плазматическая мембрана клеток эукариот формирует тонкие границу между потенциально грубой внеклеточной средой и клеточными составляющими. Она позволяет устанавливаться ионным градиентам, которые необходимы для клеточной возбудимости и функции и содержит широкий набор трансмембранных белков для распознавания, адгезии, потребления пищи и передачи сигналов. Однако состав белков плазматической мембраны никогда не являются постоянным - скорее он постоянно ремоделируется в ответ как на внеклеточные, так и внутриклеточные сигналы.
Покрытые
clathrin пузырьки, которые формируют цитозольный листок клеточной поверхности, являются архетипом для событий сортировки, ассистируемых оболочками, поскольку, в целом, фундаментальные молекулярные механизмы пузырьками обеспечиваемого транспорта между компартментами органелл , по-видимому, сходны. Во время биогенеза пузырьки переносчики проходят через серию общих ступеней: ограничиваясь сборкой компонентов оболочки в предназначенных местах на мембране доноре, связанной с деформацией мембраны и концентрацией груза, чтобы создать покрытую оболочкой почку, отпочкование от мембраны и раздевание (Box 1) и, наконец, прикрепление и слияние высвобождаемого везикулярного посредника с компартментом акцептором. Разнообразие трансмембранных грузов, скапливающихся в покрытых clathrin носителях на плазматической мембране вызывает необходимость в использовании некоторых несхожих сортинг-сигналов, чтобы предупредить конкуренцию за вступление и чтобы сделать возможной гибкость во временной регуляции поступления. Сортирующие сигналы варьируют в пределах от внутренне присущих линейных пептидных последовательностей до целых упакованных белков, которые обратимо добавляются к грузам
1-4 (Fig. 1). Существенно также гарантировать, что компоненты (такие как
SNAREs), которые необходимы для успешного закрепления и слияния прибывающих пузырьков с эндосомными элементами, будут собраны в возникающей почке. Др. современные обзоры имеют дело с участием phosphoinositides в сборке оболочек
5, механикой сборки клатриновой оболочки и отпочкования
6, и с ролью цитоскелета
7, а также с различными clathrin-независимыми путями интернализации
8.
The core sorting adaptor: AP-2
Термин 'adaptor' был предложен, чтобы наделить дополнительным значением функциональную единицу, которая связывает трансмембранный груз с лежащей поверх клатриновой оболочкой9. Поскольку AP-2 принципиально не является составляющим клатрина из очищенных эндоцитических покрытых клатрином пузырьков, он является прототипом и всё ещё лучше всего изученным адаптором. AP-2 является стабильным комплексом. представленным 4 неидентичными полипептидными цепочками: ~100 kDa α-субъединица, 100 kDa β2-субъединица, 50 kDa μ2-субъединица и kDa σ2-субъединица10, 11. Целенаправленное разрушение генов, которые кодируют AP-2 или AP-2, с помощью RNA interference (RNAi) является летальным в нескольких metazoan моделях, включая Caenorhabditis elegans12, 13. Жизненно важная роль AP-2 также подтверждается избирательным caspase-зависимым протеолизом крупных субъединиц в апоптических клетках14. Однако у Saccharomyces cerevisiae, делеция AP-2 субъединиц не является летальной и оказывает минимальное влиние на функцию clathrin15, 16.
YXXØ sorting signals. Предпочтительное вступление в покрытые клатрином почки регулируется ступенью, которая нуждается в позитивном сортинг-сигнале, должным быть представленным на белке грузе (Table 1). Субъединица μ2 была первой идентифицированной субъединицей AP-2, предназначенной для распознавания грузов
17. Доказательства показали, что YXXØ-типа сортирующие сигналы (где X любая аминокислота, а Ø объёмная гидрофобная аминокислота), присутствующие на грузовых молекулах (Table 1), декодируются посредством С-терминального расширенного β-sandwich субдомена &mu2;-субъединицы
18. В контексте гетеротетрамерных AP-2 стержневых комплексов этот β-sandwich субдомен μ2-субъединицы д. быть мобильным и его движения д. зависеть от состояния фосфорилирования остатка Thr156 (Ref. 19, 20).
AAK1-обеспечиваемое фосфорилирование этого остатка сдвигает равновесие конформации μ2-субъединицы к открытому, YXXØ-связывающему состоянию. Открытое состояние далее стабилизируется с помощью соседней phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2)-связывающей поверхности на μ2-субъединице, это позволяет μ2-субъединице одновременно использовать YXXØ сигнал и бислой
21. Соответственно, высвобождение AP-2 из отпочковывающихся пузырьков облегчается за счет конкурентного дефосфорилирования μ2-субъединицы и PtdIns(4,5)P2 (Ref. 22).
Структурно YXXØ-содержащий пептид соединяется в качестве антипараллельной β-нити, связанной водородными мостиками, с нитью beta16 субъединицы μ2 и с Y и Ø боковыми цепочками, приспособленными к химически совместимым карманам, расположенными на любой из сторон beta16 (Ref. 18) (Fig. 1b). Направленный мутагенез пар остатков в μ2-субъединице (D176A и W412A23 или F174A и D176A24) нарушает целостность YXXØ-воспринимающей поверхности и избирательно вмешивается в прием грузов с использованием этого сигнала. Основной паттерн взаимодействия может быть усилен за счет дополнительных пептидных контактов. Напр., P-selectin, эндотелиального типа I
transmembrane protein, который действует как рецептор лейкоцитов, внедряет свой Leu777 остаток в положение Y-3 (три остатка выше Tyr в позиции 0 сортирующего сигнала) (Table 1) во вдавление, соседствующее с Y-аккомодирующим карманом в μ2-субъединице
25. Др. последовательность, 365YGYECL из GABAA (gamma-aminobutyric acid type A) рецепторной γ2-субъединицы, соединяется с μ2-субъединицей действительно идентичным способом
26 (Fig. 2a). Эти дополнительные якорные остатки в грузе могут создавать вариант YXXØ сигналов в меньшей зависимости от определяющего Tyr остатка, это может приводить к высокому сродству и дифференциальной регулировке. Фосфорилирование Tyr365, Tyr367 или обоих препятствует GABAA рецепторной γ2-субъединице соединяться с AP-2 (Ref. 26). Существует также гибкость в распознавании на дистальном конце YXXØ-типа последовательности; напр., ионотропный P2X4 ATФ рецептор использует YXXGØ сигнал
27. Поскольку изменено пространственное положение в этом примере Ø, то остаток (Leu381) проецируется в реципрокный карман μ2-субъединицы под др. углом, это облегчает гибкость, вызываемую с помощью предсуществования Gly380 (Ref. 27). Следовательно, несмотря на дополнительный остаток, основные свойства вовлечения μ2-субъединицы законсервированы. Кажущаяся пластичность в способе задействования может отражать просто границы конвергентной эволюции мотивов пептидов, которые способны к вставлению родственных адапторных контактных сайтов с соотв. сродством.
CD317 (также известный как bone marrow stromal antigen 2, tetherin и HM1.24) клинически родственный белок поскольку он противодействует высвобождению HIV-1 частиц с клеточной поверхности
28, 29. Это необычный
type II transmembrane protein, который циклически перемещается между клеточной поверхностью, эндосомами и trans-Golgi network (TGN)
30, 31, и он содержит YDYXXV последовательность в цитозольной части. Но в отличие от P-selectin и близко родственного YGYECL эндоцитического сигнала в GABAA рецепторе
26, CD317 может использовать AP-2 α-субъединичный придаток, который позиционируется вне гетеротетрамерного стержня (Box 2), для включения в покрытые клатрином почки
31. Эти данные выявляют удивительную приспособленность AP-2 адаптора в распознавании различных Tyr-based сортинг-сигналов.
Dileucine recognition. Др. нуждающийся в AP-2, постоянно активный сортинг-сигнал это [DE]XXXL[LIM]-типа кислая diLeu последовательность, которая структурно отлична от YXXØ и не конкурирует с ней за вступление в покрытые клатрином пузырьки32. Хотя данные первоначально указывали, что эта diLeu последовательность соединяется или с β2- или μ2- субъединицей, но интерфейс взаимодействия прежде всего позиционируется на σ2-субъединице в AP-2 сердцевине, соседствующей с PtdIns(4,5)P2-связывающим сайтом на α- субъединице 33. Последовательность [DE]XXXL[LIM] соединяется в расширенной конформации, но подобно YXXØ сайту на μ2- субъединице, поверхность контакта на σ2-субъединице не является свободно доступной в базовой конформации AP-2. N-конец ассоциированной β2-субъединицы, особенно остатки Tyr6 и Phe7, упакован против сайта связывания, который закупоривает два Leu-связывающих кармана в σ2-субъединице33 (Fig. 2b). Этот сегмент β2-субъединицы должен поэтому смещаться, чтобы сделать возможным использование diLeu и может регулироваться с помощью фосфорилирования Tyr6 (Ref. 34). интересно. что хотя связывание diLeu сигнала ассоциирует с конформационным изменением в соответствии с AP-2 сердцевиной, субъединица μ2 может оставаться в закрытой конформации, т.к. [DE]XXXL[LIM] пептид связан33. Субъединица β2, таким образом, защищает оба AP-2 груз-связывающих сайта в растворимой. неактивной конформации. Существуют биохим. доказательства позитивной связи между YXXØ- и diLeu-связывающими сайтами35, но молекулярные детали остаются неуловимы.
Цитозольная часть основного комплекса гистосовместимости класса II ко-рецептора на T клетках,
CD4, содержит атипический diLeu сигналов в последовательности SQIKRLL, эндоцитическая активность которой зависит от фосфорилирования Ser остатка в -5 позиции
36. Однако неожиданно кристаллы фосфорилированного CD4 пептида, связанные с AP-2, не могут объяснить непосредственно активирующий эффект модификации Ser
33; фосфорилирование возможно позволяет CD4 вступать в эндоцитические пузырьки путем разрушения взаимодействия CD4 с p56-LCK, Src-family нерецепторной Tyr киназой, экспрессируемой в лимфоидных клетках
37. CD4 является также ко-рецептором для HIV-1 на иммунных клетках, вскоре после инфекции HIV-1 early viral protein negative factor (Nef) соединяется с CD4, чтобы способствовать очистке с клеточной поверхности хозяев. Подавление CD4 связано со сборкой временного комплекса CD4-Nef-AP-2 и нуждается в каноническом EXXXLL diLeu сигнале в Nef
38, который соединяется с AP-2. Дистальная DD пара остатков также делает важным вклад во взаимодействие Nef с AP-2 (Ref. 39), поскольку соединение Nef с alpha-sigma2 полукомплексом AP-2 ингибируется одинаково мутациями или Leu-Leu или Asp-Asp дублетов в Ala
39. так, diacidic мотив в Nef привлекает AP-2 посредством электростатических взаимодействий, но он не является автономным сортинг-сигналом
39. реципрокный контактный сайт на AP-2 расположен на α-субъединице и представляет собой основной участок, формируемый с помощью Lys297 и Arg340 (Ref. 40). Отметим. что этот участок находится по соседству с [DE]XXXL[LIM]-связывающим сайтом на σ2-субъединице (Fig. 2b), а Lys297 и Arg340 необходимы
in vivo для Nef-обеспечиваемой интернализации CD4 и для образования CD4-Nef-AP-2 трехсоставного комплекса
40.
Пока нет доказательств, что клеточные последовательности [DE]XXXL[LIM] также используют базовые участки на α-субъединице. Nef поэтому использует уникальный и расширенный контактный сайт на α-σ2 полукомплексе. Вообще-то diacidic мотив используется для усиления ассоциации с AP-2, поскольку EXXXLL сигнал в Nef, по-видимому, соединяется с AP-2 более слабо, чет др. diLeu остатки
40. Напротив, тандемное вовлечение α-субъединицы и σ2-субъединицы с помощью Nef-CD4 может эффективно вытеснять белки клеточного груза и сайт поэтому случайно эксплуатируется как точка вторичного контакта на сердцевине, когда сигнал diLeu в Nef управляет интернализацией CD4. Однако явная филогенетическая консервация базового участка на α-субъединице, а не аналогичных γ-субъединице или δ-субъединице в
AP-1 или
AP-3, указывает на то, что этот регион может действительно быть связан с груз-связывающим интерфейсом, вообще-то для кислого кластера сортин-сигналов
40 (Table 1).
Cargoes drive successful coat assembly and budding. Доступные структурные данные показывают, что распознавание груза вряд ли является инициальной ступенью для расположения AP-2 на плазматической мембране. В самом деле, AP-2 не образует ансамблей на эндосомах, где большая часть cycling рецепторов часто располагается в устойчивом состоянии. Сильная избыточная экспрессия рецепторов не увеличивает плотности клатриновых оболочек на поверхности41, 42 и AP-2 с непригодным грузом избирательно всё ещё собираются в покрытых клатрином пузырьках19, 23, 24. Очевидно, что захват груза происходит одновременно с полимеризацией и инвагинацией клатриновых оболочек и что загружаемый груз динамично отслеживается, чтобы предупредить сборку и отпочкование пустых пузырьков43. Доказательства получены с помощью time-resolved анализа огромного количества покрытых клатрином структур в BS-C-1 клетках, избыточно экспрессирующих transferrin рецепторы41. В контрольных клетках лишь около 40% клатриновых (и AP-2)-позитивных структур продуктивно отпочковываются в клетки. Приблизительно 20% неспособны отпочковываться с периодом полу-жизни (t1/2) приблизительно в 15 сек, представляют собой поздние абортивные события 41, 43. Если уровень поверхностных transferrin рецепторов увеличивается больше чем в 30 раз, то эти поздние абортивные события более не обнаруживаются. Захват груза, следовательно, склоняет к формированию оболочки в направлении продуктивных событий почкования41. Ранняя абортивная популяция (приблизительно 40% событий, с t1/2 приблизительно в 5 сек) нечувствительна к уровням transferrin рецепторов и скорее всего представляет собой временное закрепление AP-2 на мембране, возможно за счет использования PtdIns(4,5)P2 (Ref. 41).
Единообразие как размеров. так и динамики покрытых клатрином структур в BS-C-1 клетках удивительно
41, 43. В большинстве др. культивируемых клеток видны гетерогенные покрытые клатрином структуры на поверхности в пределах от динамичных, диффракцией-ограниченных объектов до крупных, кажущихся закрепленных участков, которые часто достигают диаметра более 500 nm. Крупные, долго-живущие участки содержат груз благодаря плавлению (fluxing through)
44 (Fig. 3): интенсивные флюктуации
45 и компоненты оболочки или грузы, исходящие с периферии этих регионов, могут обнаруживаться с помощью imaging живых клеток
44, 46, 47. Эти участки, по-видимому, соответствуют небольшим почкам, соседствующими с плоскими построениями клатрина (clathrin arrays), которые могут быть видимы с помощью freeze-etch электронной микроскопии (Fig. 3c). Учитывая позитивную модулирующую роль, которую груз играет в успешном образовании почек, устойчивые покрытые клатрином участки могут появляться как способ стабилизации клатрином-обеспечиваемого эндоцитоза перед лицом варьирующей эндоцитической активности и флюктуирующей потребности в передаче сигналов.
Additional sorting adaptors
Различные классы сортирующих сигналов определенно не конкурируют с др. за интернализацию32, 48, но концентрация в клетках AP-2 может быть уменьшена сильнее или быть равной 90% при потреблении определенных лигандов (таких как low-density lipoprotein (LDL)) в покрытых клатрином пузырьках, что едва сказывается49-53. Однако то же самое неверно для клатрина49, 50, 54. Это указывает на то, что оперируют адапторы adaptors помимо AP-2 в клатрином-обеспечиваемом эндоцитозе и мириады мономерных адапторов, обозначаемых как clathrin-associated sorting proteins (CLASPs), чтобы отличать их от AP-2, ещё не охарактеризованы. CLASPs почти неизменно соединяются с AP-2 и clathrin посредством коротких пептидных взаимодействующих мотивов, расположенных в беспорядке в C-терминальной области55. Это создает сильно заполненную сеть взаимодействий, в которой AP-2 придатки и терминальный домен клатрина действуют в качестве организационных соединительных структур (hubs)6, 55 (Fig. 4a). Многочисленные одновременные контакты, которые AP-2 может устанавливать с CLASPs и др. дополнительными белками, объясняют, как AP-2 может ассоциировать с плазматической мембраной до соединения с грузом. Кроме того, поскольку существуют множественные связи между CLASPs, то эти альтернативные адапторы всё ещё способны вызывать сборку более мелких, но операционных покрытых клатрином структур, когда уровни AP-2 снижены за счет RNAi47, 49, 51, 52, 56. Итак, CLASPs могут занимать зарождающиеся сайты почек явно в отсутствие AP-2.
[FY]XNPX[YF]-selective CLASPs. PhosphoTyr-binding (PTB) домен содержащее подсемейство CLASPs декодирует [FY]XNPX[YF] класс сигналов, которые, несмотря на наличие якорной Tyr боковой цепочки, обычно не распознаются с помощью μ2-субъединицы AP-2 (Table 1). Складка PTB домена использует [FY]XNPX[YF] сигнал для β-augmentation - временная β-нить с NP остатком стабилизирует β-tight виток, который реориентирует основную цепь, чтобы предоставить [YF] боковую цепь воспринимающему карману
57 (Fig. 1c). Одновременно PTB домен связывает PtdIns(4,5)P2 посредством соседнего базового контактного сайта
57. Обнаруживая явную избирательность груза, эктопическая экспрессия
disabled 2 (
DAB2) избирательно усиливает приём [FY]XNPX[YF]-содержащих, но не YXXØ-содержащих, грузов
47. Реципрокно, трансляционное молчание как DAB2 , так и белка autosomal recessive hypercholesterolemia (ARH) (также известного как
LDLRAP1) супрессирует потребление low-density lipoprotein (LDL), не затрагивая сходным образом transferrin
51-53. DAB2 и ARH, следовательно, являются функционально перекрывающимися CLASPs, которые интернализуют членов семейства LDL рецепторов в некоторых тканях
51-53.
β-цепочки
integrins содержат активирующие NPX[YF] последовательности в цитозольной части, которые соединяются с
FERM domain из
focal adhesion белка talin
58. Та же самая последовательность или дистальная фланкирующая [FV]XN[PIV]X[YF] последовательность в некоторых β-integrins, может соединяться с PTB доменами без активации inside-out integrin (т.е., стимулированные внеклеточные адгезии обусловливаются связыванием talin)
58 и поэтому оперировать как сортинг-сигнал. Некоторые недавние исследования задокументировали вовлечение PTB домен-содержащих CLASPs в эндоцитозе integrins
47, 59-61. нарушение трафика integrin ведет к дефектам клеточной адгезии, распластыванию и локомоции . DAB2,
NUMB, AP-2 и clathrin оказываются совместно расположенными с фокальными адгезиями перед разборкой
59, 60, а RNAi этих компонентов оболочки нарушает оборот фокальных адгезий
60. Соответственно избыточная экспрессия DAB2 ускоряет распластывание клеток на
fibronectin матриксе
47. Здесь роль DAB2 и NUMB заключается в управлении эндоцитической ремобилизации диссоциированных integrins на ведущем крае подвижных клеток, делая возможной поляризованную сборку новых адгезий. Несмотря на некоторые расхождения, относительно того, где в точности на клеточной поверхности DAB2 и NUMB сортируют β-integrins
59-62, очевидно, что NPX[FY] сигнал позволяет различать между связыванием talin, чтобы индуцировать фокальные адгезии, и связыванием CLASPs, чтобы мобилизовать integrins поляризованным способом. В отличие от потребления LDL рецепторов, интернализация integrin медленная и зависит сильно от AP-2 (Refs 59, 60, 61, 62), указывая тем самым, что может быть необходимым распознавание дополнительных сортинг-сигналов, вообще-то в α-субъединице. Некоторые патогены, включая rheovirus
62, adenovirus,
Yersinia pseudotuberculosis, Staphylococcus aureus и uropathogenic
Escherichia coli62, используют β1 integrin в качестве рецептора внедрения, делая PTB домен-содержащие CLASPs клинически важными компонентами.
Ubiquitin-selective CLASPs
Не все clathrin-зависимые грузы размещаются конституитивно. Многочисленные сигнальные рецепторы, ионные каналы и транспортеры персистируют на клеточной поверхности и интернализуются лишь избирательно, зависимым от времени способом. Обычно для этого необходимы пост-трансляционные модификации трансмембранных грузов, чтобы пометить их для использования. У одноклеточных
S. cerevisiae, доминирующим сигналом интернализации является обратимая конъюгация ubiquitin. Подсемейство CLASPs, включая epsins и epidermal growth factor receptor substrate 15 (
EPS15), которое обладает общим архитектурным сходством и способностью связывать PTB домен-содержащие CLASPs, надзирают за упаковкой ubiquitylated грузов в эндоцитические клатриновые оболочки
64, 65 (Fig. 4a). Избирательность грузов обеспечивается тандемно расположенными ubiquitin-interacting motifs (UIMs) (Fig. 1d). Дрожжевые белки
Ent1,
Ent2 и
Ede1 являются функциональными ортологами epsin 1, epsin 2 и EPS15 метазоа, хотя у Ede1 C-терминальный
UBA domain замещен двумя UIMs. доказательство, что эти белки избыточно сортируют ubiquitylated грузы. получены в экспериментах по делециям генов у
S. cerevisiae. Эндоцитоз Ste2 блокирован в линии, которая дефицитна по Ent1, Ent2 и Ede1. но может быть восстановлен с помощью повторной экспрессии Ent1 (Ref. 66). Чтобы оперировать как адаптор Ent1 д. быть способен связывать PtdIns(4,5)P2, ubiquitin и clathrin
67. Ent1, Ent2 и epsins имеют складчатый
ENTH domain который способствует ассоциации с плазматической мембраной. И EPS15 и epsins строго соединяются с AP-2 придатками, epsins ассоциирует с EPS15 благодаря соединению с
NPF motifs с
EH domains, и epsins использует также clathrin (Fig. 4a,b). Эти свойства epsins, как и в случае с DAB2, делают возможной сборку клатриновых оболочек в отсутствие AP-2.
The ubiquitin signal. Если первоначально казалось, что одиночная молекула ubiquitin может эффективно направлять поверхностные белки на участки кортикального актина, которые представляют собой место клатрином-обеспечиваемой загрузки у S. cerevisiae, была сформулирована заманчивая дихотомия: polyubiquitin цепочки передают сигнал к протеосомной деградации, тогда как monoubiquitin управляет эндосомным трафиком68. Верна ли эта идея. У дрожжей синтетически monoubiquitylated Ste2 интернализуется, но дикого типа белок обычно множественно ubiquitylated69. В культивируемых клетках одиночный ubiquitin, слитый с цитозольным доменом различных трансмембранных репортерных белков, является плохим сигналом интернализации по сравнению с линейно сцепленным tetra-ubiquitin70, 71.
The epidermal growth factor receptor (
EGFR) часто используется в качестве примера белка, который подвергается ubiquitin-зависимому эндоцитозу, но но существенные возражения и смущения окружают способ интернализации EGFR. EGFR содержит как YXXØ , так и diLeu сигналы в цитозольном домене и его интернализация чувствительна к нокдауну AP-2 с помощью RNAi
72, 73. Однако очевидно, что ubiquitin достаточен для загрузки kinase-дефектного мутантного EGFR
74. В течение 5 мин активации EGFR обычно polyubiquitylated, с большим числом добавлений к Lys63-сцепленным цепочкам
75. UIMs из epsin 1 соединяются с ubiquitylated EGFR
76 и с Lys63 (и Lys48)-сцепленными polyubiquitin, но не с monoubiquitin
70, 71. Это указывает на то, что epsin 1 и EPS15 преимущественно распознают Lys63-сцепленные ubiquitin цепочки в качестве сортинг-сигнала. В самом деле, пара Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-encoded transmembrane
E3 ubiquitin ligases (K3 (также известная как MIR1) и K5 (также известная как MIR2)), которые управляют очищением некоторых трансмембранных иммунорецепторов с поверхности инфицированных клеток, чтобы устранить детекцию с помощью цитотоксических T или natural killer клеток, синтезируют Lys63-сцепленный polyubiquitin
77. Lys63-зависимая система загрузки груза у дрожжей
78-80 и млекопитающих
91 была выявлена первой.
Основой избирательности epsin 1 и EPS15 в отношении Lys63-сцепленных цепочек, по-видимому, является длина вставляемого линкера между тандемно расположенными UIMs
82, 83. UIMs используют ubiquitin в качестве α-спирали (Fig. 1d), а короткие линкеры с высокой склонностью к спирализации позволяют тандемным UIMs конфигурироваться в виде одной непрерывной спирали. в которой остатки, которые важны для связывания ubiquitin расположены на поверхности
82. При такой ориентации UIMs с линкерами приблизительно в 7 остатков обладают конформационной избирательностью в отношении Lys63-сцепленных ubiquitin цепочек
82. Более того, хотя уже давно считается, что monoubiquitylation является главным сигналом к интернализации у дрожжей,
Rsp5 (HECT семейство E3 лигаз. которое участвует в доставке большинства трансмембранных белков
84) фактически используется для синтеза Lys63 сцеплений из более 12 молекул ubiquitin вне зависимости от партнерного
E2 enzyme85. Склонность эндоцитических E3 лигаз в отношении сцепления Lys63 и определение молекулярной основы для 'linkage-specific avidity'
82 указывает на то, что Lys63-сцепленный polyubiquitin в целом является привилегированным сортинг-сигналом, а не исключением. Более того, некоторые E3 лигазы используются в интернализации, происходящей в макромолекулярных комплексах с
deubiquitylating enzymes86, 87, что делает возможным динамический синтез и отрезание polyubiquitin цепочек, происходящие локально
88. В частности, основной ubiquitin рецептор на
26S proteasome, регуляторная субъединица S5a (также известна как Rpn10 и PSMD4), распознает Lys63-сцепленный
89 , а также Lys48-сцепленный ubiquitin. Поскольку большое количество клеточных реакций, которые зависят от ubiquitin, крепко регулируются, а локализованные циклы ubiquitylation и разборки скорее всего предупреждают разнородные или несоответствующие события. Будучи предназначенным груз сортируется и собирается в кластеры в глубоко инвагинировавшие почки, геометрия мембраны в сужающемся основании делает невозможным диффузионный выход трансмембранных белков. Следовательно, обратимые сортинг-сигналы могут быть удалены в этом месте, это делает биохимическую детекцию массы ubiquitylated груза затруднительной.
Intermediate E3 adaptors in S. cerevisiae . Хотя Rsp5 имеет три
WW domains, а некоторые эндогенные субстраты используют PPXY-типа мотивы, чтобы связать эти домены, трансмембранный груз, по-видимому, не использует Rsp5 непосредственно в ходе такой интернализации
90, 91. Вместо этого др. пост-трансляционная модификация, фосфорилирование, необходима для интернализации многочисленных рецепторов и транспортеров
80, 84, 92. Будучи фосфорилированным, транспортер марганца Smf1 связывается с помощью двух функционально перекрывающихся белков (extracellular mutant protein 21 (Ecm21) и Chs5 Spa2 rescue protein 2 (Csr2))
90. Удивительно, что эти белки являются членами сверхсемейства arrestin superfamily, которые лишь удаленно родственны по последовательностям с β-arrestins (see below)? но скорее всего имеют законсервированную складку
90, 91, 93. Девять структурно родственных белков, наз. arrestin-related trafficking (ART) адапторами
91 (также известны как α-arrestins
93), закодированы в геноме
S. cerevisiae, каждый с одним или более PPXY мотивами взаимодействия на С-конце. PPXY мотивы необходимы для α-arrestins, чтобы связывать груз с Rsp5 (Refs 90, 91); слияние PPXY последовательности с Arg транспортером Can1 обходит потребность в ART для загрузки
91. ARTs, следовательно, оперируют как промежуточные адапторы E3 лигазы, чтобы рекрутировать Rsp5, который может затем ubiquitylate как трансмембранную грузовую молекулу, так и ART белок внутри трехсоставного комплекса
90, 91. Синхронное и обширное ubiquitylation α-arrestin
90 может поддерживать расщепление комплекса груз-ART в кортикальных актиновых сруктурах, чтобы оптимизировать интернализацию.
β-arrestins in multicellular organisms
У позвоночных CLASPs arrestin сверхсемейство обладает хорошо известной ролью в интернализации многих, но не всех,
G protein-coupled receptors (GPCRs)
94. Стимулирование лигандом ведет к гиперфосфорилированию GPCRs, часто в C-терминальном цитозольном домене. Высокая плотность прикрепленных к рецептору фосфатных групп рекрутирует растворимые β-arrestins, тем самым отсоединяет активированные GPCR от соотв.
heterotrimeric G protein или белков. Относительно использования цитозольного аспекта активированных GPCRs, AP-2-связывающий мотив в β-arrestin, который иначе стабилизирует базовое, неактивное состояние, становится доступным
95, 96. Путем прохождения перехода нить-спираль, этот мотив взаимодействует с β2-субъединичным придатком AP-2, приводя тем самым GPCR-β-arrestin комплекс в предсуществующие покрытые клатрином структуры
97, 98. Клатрин-связывающая последовательность присутствует на С-терминальном отрезке β-arrestin, который реструктуируется, когда GPCR связи также вносят вклад в ассоциации с оболочкой
56, 96. Этот способ использования clathrin аппарата эффективно интернализует стимулированные рецепторы с поверхности, выявляя иную вариацию селекции груза: временная активация дремлющего цитозольного CLASP управляет быстро и избирательно загрузкой. В этом случае рецепторы безусловно являются первичным контактом для инициального отложения β-arrestin на плазматической мембране, хотя сердцевина β-arrestin обнаруживает соотв. сайт связывания PtdIns(4,5)P2
99.
Интересно. что имеется ограниченная. но строгая консервация последовательности (arrestin мотив
91) между β-arrestins и ARTs. Эта область соотвествует остаткам phospho-воспринимающей полярной сердцевины, которая поддерживает β-arrestin в закрытой, базовой конформации, указывая тем самым, что ARTs могут аналогично распознавать использование фосфорилированных рецепторов, вообще-то собственно ориентируя дистальные PPXY мотивы для отлавливания Rsp5. Почему множество, по-видимому, груз-избирательных ARTs
91 S. cerevisiae оказалось увеличенным у позвоночных с батареей CLASPs, которые все непосредственно задействуют принципиальный оболочечный аппарат, возможно это связано со сложными потребностями многоклеточной жизни.
Recognition of membrane fusion factors
Сегодня мало известно об упаковке SNAREs, которые в общем лишены известных сортинг-сигналов и, по-видимому, не ubiquitylated в поверхностные оболочки. Структурным контрапунктом типичного распознавания коротких полипептидных сигналов с помощью модулярных доменов распознавания в адапторах является сортировка vesicle-associated membrane protein 7 (
VAMP7) SNARE комплекса в клатрином покрытые почки. VAMP7 является
longin domain-содержащим SNARE, который сортируется с помощью HIV-1 Rev-binding protein (HRB; также известным как AGFG1) на плазматической мембране
100. Архитектура
HRB напоминает таковую DAB2 и epsins: складчатый N-терминальный ArfGAP домен сопровождается в основном неструктуированным треком, который содержит AP-2-, clathrin- и EPS15-связывающие мотивы (Fig. 4a). HRB локализуется на поверхности клатриновых пор, а RNAi HRB ведет к стагнации VAMP7 на плазматической мембране
100, 101. Для сортировки отрезок приблизительно в 20 остатков HRB располагается вокруг глобулярного longin домена VAMP7, проецируя 5 Leu остаток в расширенную гидрофобную борозду
100 (Fig. 2c). Процесс распознавания совершенно противоположен каноническому процессу, при котором сложенный в складку домен распознает расширенный сортинг-сигнал. Здесь неупорядоченный сегмент CLASP контактирует со складчатым груз-сортирующим детерминантом. Очень важно, что нескомплексованная VAMP7 longin-HRB связывающая поверхность оккупируется интрамолекулярно с помощью спирали SNARE. Это означает, что нескомплексованный VAMP7 не будет распознаваться и тем самым HRB будет восстанавливаться только термодинамически стабильными cis-SNARE-парными комплексами с поверхности
100.
SNAREs играют критическую роль в нервных окончаниях, работая совместно с synaptotagmin 1, который накладывает чувствительность к Ca
2+ на SNARE-обеспечиваемое слияние синаптических пузырьков. Вследствие экзоцитоза нейротрансмиттеров synaptotagmin 1 сразу же реинтернализуется с помощью клатриновых оболочек, обеспечивая рециклинг синаптических пузырьков
102. Предназначенный нейрональный CLASP, stonin 2, сортирует synaptotagmin 1; μ-homology домен в stonin 2 соединяется с краем организованного в складку C2A домена synaptotagmin 1 (Ref. 102). Структура μ-homology домена очень близка с μ2-субъединицей AP-2, но несмотря на это загрузка груза исползует поверхностную β-нить, распознавание при этом молекулярно отлично и происходит на другом субдомене μ-складки
102. Обогащение stonin 2 в клатриновых порах зависит от соединения с AP-2. Т.к. расширенный репертуар грузов зависит от CLASPs, которые контактируют с AP-2, то как предупреждается конкуренция на AP-2 hub? Ответ, по-видимому, заключается в множественности поверхностных взаимодействий, которые картируются на двух придаточных доменах (Box 2).
Multiplexed sorting signals
Белки, которые повторно поддерживают циклы между TGN, эндосомами и плазматическими мембранами, такие как mannose 6-phosphate рецепторы, имеют несколько дискретных trafficking сигналов в цитозольном домене
103. Каждый сигнал оркестрирует событие сортировки на разных компартментах мембраны, направляя рецептор на AP-1, AP-2 или
retromer сортирующие оболочки. Др. рецепторы, обнаруживают очевидную перекрываемость сигналов вхождения. Ala-сканирующий мутагенез P-selectin выявляет лишь минорную роль для Tyr777 в мотиве LXXYXXF, тогда как дистальные F780A и N782A мутации обнаруживают строгие эффекты
25. Очевидно, что вариант [FY]XNPX[YF]-типа сортирующего сигнала, декодируемый с помощью NUMB, предоминирует в P-selectin
104. LDL receptor-related protein 1 (LRP1) является крупным мультифункциональным рецептором, который участвует в метаболизме липопротеина и др. сигнальных процессах. LRP1 имеет YXXØ, [FY]XNPX[YF] и diLeu сигналы в цитозольном домене, при этом YXXØ остается главным детерминантом интернализации
105. Сходным образом цитозольный домен hyaluronan рецептора, который участвует в печеночном очищении от glycosaminoglycan, имеет несколько излишних сигналов
106. Множественные сигналы могут загружать быстрее
105, сильнее и менее зависят от одиночного CLASP.
Др. рецепторы используют др. сигналы для загрузки в зависимости от того, следуют они траектории рециклинга или деградации. Proteinase-activated receptor 1 (PAR1) является атипичным GPCR, который стимулируется с помощью thrombin, который катализирует необратимо
PAR1 активацию с помощью протеолиза. В отсутствие лиганда, PAR1 подвергается медленной конституитивной интернализации, чтобы генерировать резервный пул. который может повторно занять поверхность после очищения активированного, расщепленного PAR1. Эта конституитивная загрузка нуждается в deubiquitylation Lys421 и Lys422, которые вплетены в YKKL сортинг-сигнал
107. Однако интернализация PAR1, который обязательно переносится на лизосомы, поскольку он не может быть возвращен к неактивному состоянию, не зависит от AP-2 и β-arrestin
107. Разные permutation возникают в type 1 interferon-alpha/beta receptor. При этом фосфорилированием индуцированное ubiquitylation некоторых Lys остатков в цитозольном домене необходимо для экспозиции YVEF сигнала для продуктивной интернализации посредством AP-2 (Ref. 108).
Dedicated sorting stations?
Поскольку нет четкой диверсификации сортирующего аппарата на поверхности покрытых клатрином структур, то логичным обобщением является возможность дифференциальных груз-селектирующих сортирующих станций. Возможными причинами пре-сортировки грузов на плазматической мембране являются избегание конкуренции, кинетическая сегрегация вступающих типов грузов или генерация специализированных эндосом с разными функциями на разных внутриклеточных местах
109, 110. Этому имеются прецеденты: на ER существуют сайты у
S. cerevisiae, три разные популяции
COPII пузырьков, безусловно сформированных,чтобы упаковывать различные субнаборы грузов
111. TGN является ложной сортирующей станцией, которая направляет разные грузы в разные транспортные промежуточные образования, предназначенные для пространственно дискретных акцепторов мембран, особенно в поляризованном эпителии. Некоторые группы документировали, что разные конституитивно интернализуемые рецепторы
112, конституитивные и сигнальные рецепторы
113, 114 или разные типы сигнальных рецепторов
115, 116 обнаруживают тенденцию сегрегировать в пространственно установившиеся участки сортировки на плазматической мембране. Однако идея композиционно самостоятельных клатриновых оболочек сегодня чрезвычайно спорный вопрос, т.к десятилетиями накапливаются данные показывающие, что широкий круг из разных грузов заполняет клатрином покрытые пузырьки и что входящие компоненты пузырьков быстро гомогенизируются за счет повторяющихся раундов гомотипических слияний ранних эндосом
117, 118.
Эндогенный β-arrestin 2 занимает только субнабор клатрином покрытых структур вследствие активации GPCR, но избыточно экспрессируемый β-arrestin 2 может оккупировать большинство покрытых клатрином структур
116. Принимая во внимание, что β-arrestin 2 может достигнуть всех клатриновых пор на плазматической мембране, вне зависимости от постоянно идущей конституитивной эндоцитической активности
56, 96, β-arrestin д. достигать безусловно привилегированной поверхности на AP-2 (Box 2). Активированные EGFR также движутся в предсформированные клатриновые участки
73. Широко распространенная ко-локализация EGFR с AP-2 указывает на то, что epsins и EPS15 д. быть генеральными составляющими клатриновых оболочек на поверхности, что пока не подтверждено. Также поскольку Delta-LDL рецепторные химеры у
Drosophila melanogaster могут обходить потребность в ubiquitin, а гомолог epsin Liquid facets (Lqf) в
Notch signalling в
imaginal discs119, то PTB домен содержащие адапторы д. регулярно позиционироваться в оболочках, обычно сортирующих Delta.
Regulation of CLASPs. В дополнение к μ2-субъединице of AP-2, AAK1 фосфорилирует остаток Thr102 в NUMB, который располагается в PTB домене122. избыточная экспрессия AAK1 ведет к драматической релокализации NUMB с плазматической мембраны на околоядерные эндосомы, тогда как T102A мутанты обнаруживаются на поверхности пор122. NUMB также фосфорилируется с помощью calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CAMK) или atypical protein kinase C (aPKC). CAMK-обеспечиваемое фосфорилирование Ser264 или Ser283 остатков в NUMB рекрутирует 14-3-3 (регулятор phosphoSer/Thr-связывающих белков), инактивируя тем самым связывание AP-2123. Сходным образом, aPKC фосфорилирует Ser264 и Ser283, а также Ser7, а избыточная экспрессия aPKC ведет к исчезновению NUMB с поверхности клатриновых пор59. Это указывает на то, что существуют несколько сигнальных путей, которые регулируют присутствие NUMB в покрытых почках; для P-selectin, инактивация NUMB д. позволять накопление на поверхности и усиление адгезии лейкоцитов. Дифференциальное фосфорилирование с помощью киназ, которые расположены в ограниченных внутриклеточных местах, д. тем самым приводить к асимметричному включению CLASPs на поверхности клатриновых оболочек59. NUMB, по-видимому, более ответственен за этого типа регуляцию. поскольку он имеет очень ограниченную врожденную способность связывания AP-2 (Fig. 4a).
Альтернативно, преимущественное вступление рецепторов в субнаборы поверхности клатриновых оболочек д. быть обусловлено региональной иммобилизацией или асимметричным подразделением на биофизически отличающиеся микродомены, с высвобождением ограниченным только некоторым и поверхностными порами при активации или может быть обусловлено позитивной кооперативностью115, 116. Также, поскольку имеются множественные опции CLASP оккупации, то рецепторы, которые обладают мультиплексными сортирующими сигналами, могут непосредственно влиять на упаковку др. молекул локально и тем сдвигать плотность или представленность некоторых трансмембранных грузов. Сегрегация, следовательно, может отражать вторичные следствия альтернативных механизмов образования кластеров макромолекул в появляющихся транспортных пузырьках, а не в прирожденные отличия в свойствах клатриновой оболочки.
Др. возможность в том, что избирательная деактивация CLASPs в формирующихся почках локально склоняет к загрузке грузов. Tyr888 остаток в β2-субъежинице придатка из AP-2 фосфорилируется и этот остаток формирует жизненно важную часть привилегированной области платформы, которая соединяет β-arrestin b ARH95, 124. Рецептор-зависимое фосфорилирование Tyr888 может, следовательно, предупреждать эффективную локальную упаковку GPCRs или LDL рецепторов. Сходным образом, региональное фосфорилирование может модулировать склонность в epsin и EPS15 тандемных UIMs воспринимать спиральную конформацию и, следовательно, распознавать ubiquitin цепочки. Самостоятельный механизм негативно регулируемой способности к загрузке у UIMs осуществляется посредством ubiquilin 2 (известного как PLIC2), который имеет N-терминальный ubiquitin-подобный домен и С-терминальный UBA домен125. Ubiquitin-подобный домен, который соединяется с UIMs с более высоким сродством, чем ubiquitin, может конкурировать за доступ к EPS15 или epsin CLASPs и задерживать образование кластеров в клатриновых оболочках125.
Separation precedes congregation? Несмотря на вероятные возможные механизмы для сборки дифференциально избирательных оболочек на поверхности, существуют теоретические возражения к их использованию. Считается, что входящие компоненты пузырьков быстро конвергируют в компартмент ранних эндосом
117, 118. Почему эндосомы обладают специализированными доменами и характерной tubulovesicular морфологией, которая сложным образом связана с их операциями в качестве централизованных сортирующих станций, если разные популяции эндосом могут быть сгенерированы с помощью предсортировки на плазматической мембране? Странно, что два ADP-чувствительных GPCRs, P2Y1 и P2Y12 purinergic рецепторов, первоначально локализуются в разных покрытых пузырьках. но быстро сливаются в периферические ранние эндосомы
115. Более того, если происходит предсортировка на поверхности для доставки определенных эндосом, то как эти разные эндосомные акцепторы распознаются и как это связано с упаковкой необходимых распознающих связей и SNAREs в формирующихся почках? Gurken, связанный с мембраной трансформирующий фактор роста-alpha, который секретируется на разыне поверхности развивающихся ооцитов
D. melanogaster чтобы установить передне-заднюю и дорсо-ветральную оси, экспортируется только с субнабора ER exit сайтов, но это критически зависит от поляризованной локализации мРНК
126. Аппарат COPII в gurken-экспортирующих зонах не отличается от др. COPII exit сайтов на непрерывном ER, а пертурбации локализации gurken мРНК ведут к неограниченному экспорту белка во все ER пузырьки
126. Очевидно, что необходимо установить, является ли очевидная специализация клатриновых пор отражением дифференциальной сегрегации и способности к переносу происходящих с поверхности транспортеров или скорее всего отражением оптимизации сигнальных платформ пространственно и во времени или простоя указывает на разные механизмы концентрации и упаковки различных грузов в покрытые клатрином структуры.
Conclusions
Cargo selection in S. cerevisiae apparently uses a limited set of molecular connection elements. Metazoans have replaced or diversified the family of ARTs, which do not engage core endocytic components and function as intermediate adaptors, with a broad array of additional sorting signals and cognate CLASPs that physically associate with clathrin and AP-2. This variety of adaptors far outstrips anything known for other sorting coats. Current molecular descriptions of sorting mechanisms at clathrin-coated buds are beginning to reveal the logic behind the multitude of internalization signals in endocytosis. An important goal is to obtain a complete inventory of sorting signals and cognate CLASPs. Other signals almost certainly remain to be characterized. For example, Niemann–Pick C1-like protein 1 (NPC1L1) is a polytopic transmembrane protein that regulates dietary cholesterol uptake by enterocytes. When cellular cholesterol levels are low, NPC1L1 translocates from endosomes to the apical surface. As membrane cholesterol levels normalize, NPC1L1 returns to its reserve endosomal location127. The nature of the cholesterol-sensitive sorting signal is completely unknown: are mammalian ART family proteins involved?
Beside the obvious potential to avoid competition, in numerous cases it is still not clear why one signal would be favoured over another. Perhaps the signal specifies a defined sorting itinerary or dictates clustering into a dedicated subpopulation of coats at the cell surface? Clathrin-mediated endocytosis subserves different downstream cellular responses such as migration, transcriptional activation and proliferation. Whether particular sorting signals are tailored to specific receptor concentrations at the cell surface and whether this relates to the kinetic parameters that determine the efficiency of uptake are not known. It will also be important to establish whether the cargo checkpoint that assures productive assembly is restricted to AP-2, or whether the occupancy of other CLASPs is also monitored while the coat polymerizes. Because SNARE loading is crucial for subsequent endosome fusion, it seems likely that successful incorporation of other cargoes must be checked. The fact that coats still bud when AP-2 is almost completely absent is highly suggestive of additional cargo monitoring events. How this proofreading operates at the molecular level and whether selective deactivation of individual CLASPs favours cargo-selective buds need to be investigated. The rapid pace of investigation will undoubtedly provide answers, and continued analysis of clathrin-mediated endocytosis in various model systems such as D. melanogaster and zebrafish is certain to provide greater insight into development and organ physiology.
Сайт создан в системе
uCoz 
