В пути митохондриального апоптоза, клеточный стресс индуцирует mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). Это ведет к высвобождению белков из межмембранного пространства митохондрий и к активации caspase cysteine proteases. Т. наз. инициатор расщепляет каспазы и активирует нижестоящие каспазы, которые последовательно расщепляют др. клеточные субстраты, чтобы запустить апоптоз. Однако один инициатор каспаз, caspase 2, действует не таким способом. В точности неизвестно, где и как caspase 2 активируется на этом апоптическом пути, частично из-за отсутствия технологий мониторинга её активации. Douglas Green с коллегами представили bimolecular fluorescence (BiFC) подход, который позволяет визуализовать активацию caspase 2 одиночных клетках в реальном времени. Используя BiFC , они впервые установили, что caspase 2 активируется выше MOMP, в клеточной цитоплазме в ответ на тепловой шок.

Димеризация caspase 2 вызывает её активацию. Bouchier-Hayes et al. слили С-терминальную и N-терминальную части venus, производного yellow fluorescent белка, с молекулой caspase 2 и ко-экспрессировали их в клетках человека. Димеризация caspase 2 dimerization приводит в контакт части белка venus, в результате флюоресцентный сигнал отражает активацию в реальном времени caspase 2. Используя эту технику, авт. продемонстрировали активацию caspase 2 в ответ на тепловой шок, химические воздействия. которые разрушают цитоскелет, метаболические стрессы и повреждения ДНК. Т.к. тепловой шок стимулирует наиболее мощную реакцию BiFC, поэтому авт. охарактеризовали активацию caspase 2 в ответ на хит-шоковый стресс.

Хотя в нескольких сообщениях утверждалось, что caspase 2 активируется в ядре, трехмерные картинки клеток, экспрессирующих caspase 2 BiFC молекулы, показали, что активация caspase 2 происходит в цитоплазме в ответ на тепловой шок. Более того, цейттраферная микроскопия показала, что активация caspase 2 предшествует появлению флюоресцентно меченного omi - одного из белков, высвобождаемых из митохондрий во время MOMP - примерно в 2 ч. Это помещает активацию caspase 2 выше MOMP.

Наконец, авт. попытались идентифицировать события, которые регулируют активацию caspase 2. Теплом индуцированная транскрипция белков теплового шока, таких как хитшоковый белок 90alpha (HSP90alpha), который способствует выживанию клеток. Авт. установили, что ингибирование HSP90alpha с использованием химических соединений или за счет редукции его экспрессии, используя short hairpin RNA, увеличивает количество BiFC-позитивных клеток в ответ на тепловой шок. Т.о., HSP90alpha может негативно регулировать активацию caspase 2.

Авт. продемонстрировали и ценную технику для изучения активации инициатора caspases в реальном времени и используя этот подход показали, что тепловым шоком индуцированная активация caspase 2 происходит выше MOMP в митохондриальном апоптическом сигнальном каскаде.