Улитка млекопитающих содержит первичные сенсорные клетки для системы слуха. Зрелый орган Корти содержит один ряд ВВК и три ряда НВК, а также различные типы поддерживающих клеток. Улитка мыши формируется первоначально из отпочковавшегося кармана из вентромедиальной части отоциста на день эмбриогенеза Е11-12 (Morsli et al., 1998). Предшественники волосковых клеток и ассоциированных с ними поддерживающих клеток выходят из клеточного цикла между Е12 и Е16 в виде апикально-базального градиента, п большинство их генерируется на ст. Е14 (Ruben, 1967). После того как клетки в сенсорной области заканчивают свои последние деления, они начинаю свою дифференцировку в волосковые и поддерживающие клетки в срединной и базальной части улитки; волосковые и поддерживающие клетки продолжают дифференцироваться в виде временного градиента, который распространятся как в базальном, так и апикальном направлении улитки, так что полный набор волосковых и поддерживающих клеток возникает у мышей между Е17-Е18 (Ruben, 1967; Sher, 1071, Lim, Anniko, 1985).

Многочисленные исследования показали важность fibroblast growth factors (FGFs) и их рецепторов на разных ст. развития улитки. 23 различных Fgfs и 4 FGF рецептора (Fgfr1-4 идентифицированы у мыши и человека (Ащкв-Perriss et al., 2001, Itoh, 2001; Ornitz, Itoh 2001; Itoh, Ornitz 2004, 2008; Zhang et al., 2006). У мыши FGF3, FGF10 и FGF8 ) участвуют в ранниъх индуктивных событиях слухового пузырька (Mansour et al., 1993; Alvarez et al., 2003; Wright, Mansour, 2003; Ladher et al., 2005; Martin, Groves, 2006 Ohyama et al., 2007). Мыши, дефцитные по Fgf3 и Fgf10 не способны формировать слуховой пузырёк. Сходные дефекты на ранних стадиях развития слухового пузырька обнаруживаются у мышей с целенаправленной делецией специфической изоформы Fgfr2 (FGFR2 IIIB; Pirvola et al., 2000) и было предположено, что FGF10 и FGF3 действуют как лиганды для FGFR2 при образовании и формировании паттерна слуховой плакоды (Pauley et al., 2003; Wright et al., 2003). В фазе сенсорной спецификации органа Корти FGF20 и АПАК1 играют ключевую роль (Pirvola et al., 2002; Hayashi et al., 2008). Тканеспецифичная делеция Fgfr1 вызывает тяжелые дефекты в развитии как волосковых, так и поддерживающих клеток, при этом сенсорные клетки, которые развиваются, обнаруживаются в виде маленьких кластеров (Pirvola et al., 2002). Ингибирование FGF20 на этой стадии вызывает уменьшение количества волосковых и поддерживающих клеток точно также как при делеции Fgfr1 (Hayashi et al., 2008). На более поздних стадиях эмбрионального и неонатального развития кортиева органа FGF8, действуя посредством FGFR3, необходим для дифференцировки pillar (столбчатых) клеток (Colvin et al., 1996; Hatashi et al., 2007; Jaques et al., 2007; Puligilla et al, 2007).

Многие линии доказательств показывают важность передач сигналов FGF при развитии улитки. Хотя Wright et al., анализировали экспрессию FGF рецепторов на ранних стадиях развития слухового пузырька (Wright et al., 2003), не было исследовано систематически детальные паттерны экспрессии 4-х рецепторов на более поздних стадиях развития улитки. Мы предприняли попытку проанализировать с помощью гибридизации in situ экспрессию Fgfr1-4 на эмбриональной, неонатальной и на взрослой стадии развития улитки. Эти паттерны экспрессии подтвердили и расширили имеющиеся данные (Peters et al., 1993; Pirvola et al., 1995,2000,2002; Colvin et al., 1996; Prickles 2001; Hayashi et al., 2007) и подчеркнули множество критических ролей этих рецепторов в развитии улитки. RESULTS AND DISCUSSION На ст. E13.5, канал улитки ещё не достиг окончательной длины и типичные три витка ещё отсутствуют. На этой ст. развития улитки происходит постепенное прекращение пролиферации в просенсорной области и спецификация предшественников волосковых и поддерживающих клеток в презумптивном кортиевом органе. Канал улитки экспрессирует и Fgfr1 и Fgfr2 на этой стадии (Fig. 1A,B), тогда как Fgfr3 и Fgfr4 не экспрессируются в эпителии (Fig. 1C,D). Выявляются обе сплайс-формы рецепторов. Экспрессия Fgfr1, по-видимому, диффузна по всему эпителию канала улитки и соседней мезенхиме. Несмотря на диффузный паттерн окраски эта экспрессия специфична, что доказывается высоко специфичными паттернами экспрессии у эмбрионов (see Supp. Fig. S1A, which is available online). Экспрессия Fgfr2 ограничивается несенсорными регионами канала улитки (Fig. 1B) и экспрессируется также в развивающейся отической капсуле. Экспрессия рецепторов такая же на ст. E14.5, хотя теперь уже очевидны три витка (Fig. 1E,F). Кроме того, на этой ст. экспрессия Fgfr1 наивысшая в вентральном аспекта канала; это особенно очевидно в апикальной части канала улитки (Fig. IE, 3). Экспрессия Fgfr2 на ст. E14.5 напоминает таковую на ст. E13.5, а Fgfr3 и Fgfr4 не экспрессируются в эпителиальных клетках канала (Fig. 1C,D,G,H). Мы подтвердили, что все зонды выявляют специфические паттерны (Supp. Fig. SI). Мы используем термин "ventral" для обозначения той части эпителия канала, который содержит просенсорный домен, а "lateral" and "medial" для обозначения позиции относительно modiolus улитки, который является центральной осью улитки.

Экспрессия Fgfr1 в презумптивном сенсорном домене согласуется с предыдущими данными, демонстрируя критическую роль этого рецептора в спецификации просенсорного домена. Группа Pirvola's продемонстрировала, что мыши с условной делецией mice Fgfr1 в развивающейся улитке обнаруживают тяжелые дефекты в развитии волосковых и поддерживающих клеток (Pirvola et al., 2002). Ранее мы описали сходные дефекты, когда передача сигналов FGF была ингибирована с помощью SГ5402, a pan-FGFR ингибитора. Более того, ингибирование FGF20, лиганда, специфически экспрессируемого в просенсорном домене на этой стадии, обнаруживало сходные эффекты как и при ингибировании передач сигналов FGF генетически или малыми молекулами (Hayashi et al., 2008). Поскольку ни один из др. FGF рецепторов не экспрессируется в презумптивном сенсорном домене на этой стадии, то скорее всего, что FGF20 действует посредством Fgfr1 в процессе просенсорной спецификации.

Во время следующей стадии развития улитки происходит переход от фазы сенсорной спецификации к фазе созревания. Волосковые и поддерживающие клетки начинают свою дифференцировку в средне-базальном витке улитки на ст. E15.0 и дифференцировка расширяется в направлении верхушки. а также в направлении самой базальной её части. На ст. E15.5 паттерн экспрессии рецепторов начинает меняться. Fgfr1 всё ещё экспрессируется на наиболее высоком уровне в вентральном аспекте канала в более апикальных завитках (Fig. II), но в направлении основания улитки экспрессия становится сконцентрированной в кластере клеток в латеральном аспекте просенсорного домена в области развития НВК (Figs. II, 2A'). Экспрессия Fgfr2 сходна с паттерном экспрессии на ст. E14.5 (Fig. 1J). Начинается экспрессия Fgfr4 на ст. E15.5, , однако, этот рецептор не экспрессируется в эпителии, а скорее в мезенхимных клетках соседних с и окружающих канал (Fig. 1L, arrowheads). Figure 2 показывает взаимоотношение между экспрессией Fgfr1 и Fgfr2 и доменом сенсорного эпителия (меченного р27^kiр1) и первыми развивающимися ВВК (мечены Math1-GFP). Math1-GFP волосковые клетки непосредственно соседствуют с медиальным аспектом клеток более высоко экспрессирующих Fgfr1+ (Fig. 2A,A'), и столь же обширно с р27^kiр1+ доменом на этой стадии (Fig. 2B,B'). Напротив, Fgfr2 экспрессируется в клетках непосредственно латеральнее домена сенсорного эпителия (Fig 2C,C'). Сравнение паттернов экспрессии Fgfr1 и Fgfr3 с Sox2 показывает, что Fgfr3 экспрессируется на латеральном крае домена экспрессии Sox2 (Fig. 3А,A',C,C', тогда как Fgfr3 существенно перекрывается с экспрессией Fgfr1 (Fig. 3B,C,B',C').

Также на ст. Е15.5, Fgfr3 начинает экспрессироваться в развивающейся сенсорной области, особенно в в базальных двух витках улитки (Fig. IK, arrows). Экспрессия Fgfr1 и Fgfr3 перекрывается на этой стадии. Это можно лучше всего наблюдать при проверке экспрессии этих рецепторов в связи с развивающимися ВВК, меченными Math1 (Fig. 4). На рис. видно перекрывание между регионами с наивысшей экспрессией Fgfr1 и Fgfr3 и кажется, что Fgfr3-экспрессирующие клетки гнездятся в субнаборе из кластера клеток, экспрессирующих на высоком уровне Fgfr1. Положение этих клеток в непосредственной близости с первыми Math1-экспрессирующими клетками (ВВК) указывает на то. что презумптивные столбчатые клетки, НВК и Дейтеровские клетки экспрессируют эти два рецептора на этой ст. развития.

Начиная с Е15 обнаруживается возможность того, что Fgfr3 может оказаться способным компенсировать потерю Fgfr1, поскольку имеет существенное перекрывание их экспрессии. Потеря функции Fgfr1 ведет к дефектам как волосковых, так и поддерживающих клеток и, следовательно, Fgfr3 не может замещать раннюю функцию Fgfr1 . Фактически, скорее чем снижение в количестве волосковых и поддерживающих клеток целенаправленная делеция Fgfr3 ведет мышей к избыточной продукции волосковых и поддерживающих клеток в апикальных двух третях улитки (Hayashi et al., 2007; Puligilla et al., 2007), подтверждая, что FGFR3 может в действительности взаимодействовать, чтобы уменьшать передачу сигналов посредством FGFR1. Одним из способов обеспечения этого может быть то, что активация FGFR3 ведет к усилению экспрессии Sprouty2, которая может затем снижать эффективность передачи сигналов посредством FGFR1 и FGFR3; , однако, мы не нашли изменений в экспрессии Sprouty2 у мутантов Fgfr3 (Hayashi et al., 2007). Альтернативная возможность заключается в том, что FGFR1 и FGFR3 конкурируют за FGF лиганды.

На ст. Е16.5 экспрессия Fgfr1 продолжается на самом высоком уровне в клетках латеральной части просенсорного домена, области, которая д. давать НВК, столбчатые и Дейтерсовы клетки. Однако этот рецептор всё ещё экспрессируется в большинстве оставшихся клеток эпителия канала (Рис. 5А,А'). Fgfr2, напротив, экспрессируется в очень сходной области эпителия, что и на более ранних стадиях эмбриогенеза, в латеральной части просенсорного региона (Рис. 5B,B'). На ст. Е16.5 экспрессия Fgfr3 более не ограничивается основанием, но распространяется на большую часть улитки, хотя всё ещё отсутствует в апикальном витке. В каждой точке вдоль оси основание-верхушка Fgfr3 экспрессируется в субнаборе клеток сенсорного домена, дифференцирующегося в НВК, столбчатые клетки и клетки Дейтерса. На ст. Е18.5 большинство волосковых и поддерживающих клеток дифференцировано (и метится соотв. Myosin6 и Prox1), за исключением апикального кончика. Рис. 5Е-Н показывает экспрессию рецепторов на этой стадии, Myo6 метит волосковые клетки. На ст. Е18.5 Fgfr1 экспрессируется очень слабо в сенсорном регионе, хотя экспрессия сохраняется и даже усиливается в др. регионах эпителия, наиболее заметно в большом эпителиальном гребне (greater epithelial ridge (GER)) и клетках Гензена (Рис. 5A,A', E). Экспрессия Fgfr3 всё ещё значительна в сенсорном эпителии (Рис. 4С,C', G ) и теперь более чётко ограничивается столбчатыми клетками и клетками Дейтерса. Fgfr2 обнаруживает тот же паттерн экспрессии, что и на более ранних стадиях (Рис. 5B,B',F), а Fgfr4 не экспрессируется в эпителии, но поддерживается в окружающей мезенхиме (Рис. 5D,D', H).

После рождения клетки кортиева органа продолжают созревать. Туннель органа Корти, ограничиваемый столбчатыми клетками, открывается впервые в основании приблизительно на 7-й день постнатального развития (Р7) и животные начинают слышать после ст. Р10. На ст. Р0 и Р3 (Рис. 6 и 7) экспрессия Fgfr1 почти отсутствует в сенсорном домене. Однако сигнал усиливается в GER (в презумптивных внутренней борозде и пограничных клетках) и на латеральном крае сенсорного эпителия в клетках Гензена и возможно клетках Клаудиса (Рис. 6,7, А и A'). Экспрессия Fgfr2 сходна с той, что на более ранних стадиях, занимая домен латеральнее развивающегося сенсорного эпителия с высокими уровнями экспрессии в развивающихся клетках Клаудиуса, наружной борозды и спирального возвышения (Рис. 6, 7 В и B'). Этот рецептор, по-видимому, экспрессируется на более низких уровнях в развивающейся сосудистой полоске (stria vascularis) и рейснеровской мембране (Рис. 6, 7, В и B'). На Р0 и Р3 Fgfr3 обнаруживает активную экспрессию в столбчатых клетках и клетках Дейтерса, на ст. Р3 экспрессия, по-видимому, сильнее в столбчатых клетках, чем клетках Дейтерса (Рис. 6, 7, С и C'). После Р7 получение сигнала in situ затруднено из-за кальцификации капсулы улитки. Мы установили лишь, что Fgfr3 активно экспрессируется в столбчатых и Дейтерса клетках у взрослых. Роль Fgfr3 в дифференцировке столбчатых клеток теперь хорошо установлена. FGF8 экспрессируется во внутренних волосковых клетках, активирует FGFR3 в соседних столбчатых клетках и это необходимо и достаточно для их дифференцировки. Избыточная активация передачи этих сигналов или эктопическая экспрессия Fgf8 или добавление АПА17 к эксплантам культивируемой улитки (Jacques et al., 2007) или с помощью целенаправленной делеции ингибитора передачи сигналов FGF Sprouty2? вызывает увеличение количества столбчатых клеток (Shim et al., 2005). Кроме того, мутации в Fgfr3, которые вызывают избыточную активацию также ведут к увеличению количества столбчатых клеток (Mansour et al., 2009). Наши результаты согласуются с этой интерпретацией, поскольку на ст. дифференцировки стол,чатых клеток Fgfr3 является единственным FGF рецептором? экспрессируемым в этих клетках.

Одной из наиболее важных находок нашего анализа стала сильная и последовательная экспрессия Fgfr2 в презумптивной сосудистой полоске и спиральном возвышении ч Е13.5 по Р3. К сходному заключению пришел Pickles, используя микроиссечение и обратная транскриптаза-PCR у новорожденных мышей (Pickles, 2001), и Pirvola's группа, выявившая сходный паттерн на ст. Е16 (pirvola et al., 2000). Хотя роль Fgfr2 в раннем развитии улитки и отической индукции хорошо известна, неизвестно было, выполняет он более специфическую функцию в развитии сосудистой полоски и спирального возвышения. Условные делеции Fgfr2 в миэлинизирующихся глиальных клетках спирального ганглия приводят к прогрессивной потере слуха (Wang et al., 2009). FGF16 экспрессируется очень специфически в области развивающегося спирального возвышения с Е14.5 (Hatch et al., 2009), так что он может быть важным лигандом для FGFR2. Условные делеции этого рецептора особенно в несенсорных регионах канала улитки могут пролить свет на потенциальные дополнительные роли этого рецептора в развитии внутреннего уха. В области развивающегося спирального возвышения рецептор Fgfr2 может быть делетирован с использованием Fgf16-Cre, полученным в лаб. Mansour (Hatch et al., 2009).

Итак, экспрессия рецепторов FGF во время ключевых стадий развития улитки показана на Рис. 8. Очевидно, что два важных рецептора для развития сенсорных клеток это Fgfr1 и Fgfr3. Базируясь на паттернах экспрессии оказывается очень возможным, что Fgfr2 играет роль в развитии наружной борозды, спирального возвышения и сосудистой полоски. Экспрессия Fgfr4 ограничена мезенхимой на всех стадиях развития и морфологическое развитие улитки нормально у Fgfr4-/- животных. Наши результаты вместе с данными др. исследователей идентифицируют несколько ключевых ролей для передачи сигналов FGF во время развития улитки. На рис. 8 Схематическая экспрессия Fgfr в ходе развития. Экспрессия 4-х рецепторов закодирована цветом и показана на 4-х ст. развития. Экспрессия Fgfr1 представлена голубым с темно голубым, обозначающим более сильную экспрессию. Fgfr2 представлен оранжевым с точками этого света, обозначающим меньшую экспрессию. Fgfr3 показан пурпурным, а Fgfr4 представлен серыми линиями по всей мезенхиме, непосредственно окружающей канал улитки. Чёрные пунктирные линии означают развивающуюся сенсорную область в эпителии.