Посещений:
РАЗВИТИЕ СТРОМЫ РОГОВИЦЫ

Структура и Функция

Development of the corneal stroma, and the collagen-proteoglycan associations that help define its structure and function
Andrew J. Quantock , Robert D. Young
Developmental Dynamics 237:2607-2621, 2008. © 2008 Wiley-Liss, Inc.

The cornea of the eye is a unique, transparent connective tissue. It is comprised predominantly of collagen fibrils, remarkably uniform in diameter and regularly spaced, organized into an intricate lamellar array. Its establishment involves a precisely controlled sequence of developmental events in which the embryonic cornea undergoes major structural transformations that ultimately determine tissue form and function. In this article, we will review corneal developmental dynamics from a structural perspective, consider the roles and interrelationships of коллагенs and proteoglycans, and comment on contemporary concepts and current challenges pertinent to developmental processes that result in an optically clear, mature cornea.


Рис.1.  |  . Ultrastructure of early stage embryonic chick cornea showing basal epithelium (E), primary stroma (PS), and underlying secondary stroma with an invading mesenchymal cell (M). The outer primary stroma is acellular and composed of layers of orthogonal коллаген fibrils. Reprinted from Linsenmayer et al. ([1998]), with permission from Elsevier.


Рис.2.  |  Immunogold colocalization of кcollagen types I and V (10- and 5-nm gold particles, respectively) in embryonic day 11 lathyritic chick cornea. All fibrils are positive for the type I коллаген antibody. Only disrupted fibrils are labeled for both коллаген типаs (arrows) showing that the type V collagen epitope is concealed inside the hybrid type I-типа V fibril. Reprinted from Birk et al. ([1990]), with permission from The Rockefeller University Press.


Рис.3.  |  Immunofluorescence labeling of the keratan sulfate proteoglycan, keratocan, with KER-1 antibody and Alexa 488-labeled secondary antibody (green), is localized to the anterior stroma (arrow) of chick cornea at embryonic day 15; labeling is absent immediately below the epithelium (e) in presumptive Bowman's layer (pB). Scale bar = 20 m.


Рис.4.  |  Collagene fibrils aligned within two membrane involutions at the surface of a keratocyte in corneal stroma of 14 day embryonic chick cornea. Scale bar = 300 nm. Reprinted from Birk et al. ([1984]), with permission from The Rockefeller University Press.


Рис.5.  |  Stroma of chick cornea at embryonic day 15 showing a keratocyte with nucleus (n) in transverse section, cell processes (p), and коллаген fibril bundles (cf) deposited in various orientations with respect to the cell. коллаген fibrils are labeled with 10-nm gold particles indicating high sulfated keratan sulfate proteoglycan, detected by monoclonal antibody 5D4. Scale bar = 1 m.


Рис.6.  |  Ciollagene fibrils in chick corneal stroma at embryonic 15 show dense labeling with gold particles indicating sites of high sulfated keratan sulfate proteoglycan detected by antibody 5D4. Scale bar = 200 nm.


Рис.7.  |  Collagene fibrils in transverse (top) and longitudinal section (lower left) appear well preserved in mid-stroma of embryonic day 18 chick cornea, prepared without chemical fixation by high-pressure freezing, freeze-substitution, and low temperature resin embedding. Scale bar = 100 nm.

Роговица образует глянцевидное, оптически проницаемое переднее окошко в фиброзной наружной тунике глаза. Она выполняет несколько важных функций, включая защиту деликатных внутриглазных структур, но наиболее важно, её уникальная структура и состав позволяют передавать и преломлять свет. Происхождение развитие и структура этой удивительной соединительной ткани зачаровывала исследователей уже свыше 100 лет с самых ранних исследований Kessler ([1877]), и до сих пор ещё множество вопросов остаются без ответа.
Ранние исследования использовали эмбрионов кур в качестве модели развития, и многие из фундаментальных событий морфогенеза коллагеновой стромы были установлены впервые (Coulombre and Coulombre,[1958],[1961]; Anseth,[1961]; Hay and Revel,[1969]; Conrad,[1970]; Trelstad and Coulombre,[1971]; Toole and Trelstad,[1971]). Детальные анатомические исследования Hay с сотр. составили основу для нашего сегодняшнего понимания двухступенчатого процесса отложения коллагеновых фибрилл в глазах эмбрионов. Сформированный матрикс роговицы, сначала в виде первичной стромы, секретируемой эпителиальными клетками, как полагает большинство, действует как матрица для последующего биосинтеза вторичной стромы путем проникновения в неё клеток нервного гребня, которые предназначены стать постоянными кератиноцитами роговицы (Hay and Revel,[1969]). Успехи последних 20 лет в нашем знании роговичных коллагенах и межфибриллярными протеогликанами, которые совместно продуцируют строму, вместе с продукцией мутантных линий мышей, дефицитных о специфическим компонентам роговицы, обеспечили быстрый прогресс в идентификации потенциальных регуляторов сборки и организации стромы роговицы.

OVERVIEW OF THE EVENTS IN THE GROWTH OF THE CHICK CORNEAL STROMA


Первые доказательства внеклеточного матрикса в развивающейся роговице кур появляются между днем эмбриогенеза (E) 3 и E3.5 в виде слоя толщиной в 1-&mico;m тонких коллагеновых волокон. Эти ранние стадии биосинтеза cornea propria хорошо документированы (Kessler,[1877]), и Hay and Revel ([1969]), после детального исследования с помощью ЭМ, назвали её первичной стромой и, как сегодня общепринято, является продуктом эктодермальных клеток. На этой ранней стадии происходит две волны миграции мезенхимных клеток с периферии в первичную строму. Как было показано Hay and Revel ([1969]), большинство, если не все, мезенхимные клетки, присутствующие на краю оптического бокала на ст. E3.5, предназначены для образования роговичного эндотелия, а мезенхима, предназначенная стать роговичными фибробластами возникает вторично. Презумптивные эндотелиальные клетки становятся уплощенной формы, готовясь к миграции внутрь вдоль задней поверхности первичной стромы со скоростью в 10 µm/hr (Hay and Revel,[1969]). На E5, растущая строма приблизительно 10 µm толщиной в центе и представлена 20 или более слоями или ламеллами (Laguesse,[1926]) и всё ещё не содержит клеток. Она удваивается в толщине к E5.5, затем быстро набухает до 30-50 µm, это совпадает с началом экстенсивной инвазии мезенхимных клеток, предназначенных стать кератиноцитами роговицы, ведущий край которой, как было подсчитано Hay and Revel ([1969]) , мигрирует ~50 µm/hr. Презумптивные кератиноциты заполняют строму на ст. E7 и затем начинаю синтезировать огромную массу вторичной (т.e., зрелой) стромы путем отложения коллагеновых фибрилл в виде грубых ламелл, утолщенных проксимально (Fig. 1). Мезенхимные клетки, пронизывающие строму на ст. E5.5 имеют вид покрытых ресничками фибробластов и проникают наиболее быстро в глубину задней части стромы, приводя к формированию приблизительно 20 слоев клеток на E10 и 25 слоёв на E14. В это время морфология клеток изменяется из округлой в уплощенную форму, наиболее типичную для кератоцитов зрелой роговицы (Hay and Revel,[1969]; Connon et al.,[2003]). Процесс клеточной миграции и дифференцировки сопровождается существенными изменениями в экспрессии интегринов клетками (Doane and Birk,[1994]). Предполагается, что проникшие кератиноциты используют первичную строму в качестве матрицы, однако точная последовательность притока клеток, миграции и направленного отложения ламелл, чтобы сформировать хорошо знакомую, высоко организованную в виде ортогональных массивов зрелую строму, остаётся неясной.
Строма достигает максимальной толщины на ст. E10, а между E14 и E19 подвергается драматическому процессу компакции, когда теряется вода, матричные компоненты становятся более сконцентрированными и одновременно увеличивается прозрачность ткани, в результате прозрачность для света изменяется примерно с 40% до более 95% как у взрослых (Coulombre and Coulombre,[1958],[1961]; Hay and Revel,[1969]). Несколько мощных механизмов лежат в основе компакции матрикса, включая изменения в синтезе сульфатированных, связывающих воду компонентов межфибриллярного матрикса, т.е. протеогликанов, и в активности двууглекислых насосов в эндотелиальном монослое, которые обусловливают сохранение влажности в строме.

коллагенS IN THE DEVELOPING CORNEAL STROMA


28 различных коллагенов идентифицировано сегодня, больше половины, как сообщается находятся в роговице, где они в основном выполняют структурную роль во внеклеточном матриксе (Kielty and Grant,[2002]). Классические исследования в лабораториях Linsenmayer, Birk, и их современников создали фундаментальное знание о составе и структуре разных типов коллагенов во время развития роговицы у кур ( Linsenmayer and associates ,1998).
Типы коллагенов, ранее рассматривались как ткане-специфические, сегодня оказались более широко распространенными в тканях. Предыдущие исследования показали, что первичная строма роговицы кур состоит из коллагеновых фибрилл из коллагенов типа I и типа II, последняя молекула рассматривалась ранее как специфическая для хряща (Linsenmayer et al.,[1977]; Hendrix et al.,[1982]). Коллаген типа I является центральным для образования нормальной организации стромы, это доказывается те фактом, что у мутантных мышей Mov13, у которых не продуцируется коллаген типа I, строма состоит из тонких фибрилл с отсутствием ортогонального расположения (Bard and Kratochwil,[1987]). Коллагены типа I и II сосуществуют на ранних стадиях развития роговицы кур, при этом гибридизация in situ демонстрирует экспрессию типа I and II как эпителием, так и эндотелием на ст. E3 (Hayashi et al.,[1988]). Дифференциальное иммуноокрашивание роговицы эмбрионов кур антителами против telopeptide или тройных спиральных доменов коллагена типа II осуществлено Chen and colleagues ([1993]) , чтобы подтвердить, что коллаген типа II, синтезируемый эпителием роговицы, быстро собирается в фибриллы первичной стромы. Биосинтез коллагена типа II с помощью эпителия продолжается несколько дней после инвазии мезенхимных клеток с градиентом коллагена типа II инкорпорируемого в развивающуюся вторичную строму. Эпителиальные клетки, ассоциированные с типа II мРНК и белком обнаружимы в местах латеральных по отношению к развивающейся строме после инвазии клеток, указывая тем самым, что они могут функционировать в качестве матрицы для роста роговицы по ходу развития (Linsenmayer et al.,[1990]; Fitch et al.,[1988]). Исследования с использованием иммуногистохимии, также как и гибридизация in situ показали, что эпителиальные клетки и в меньшей степени эндотелиальные клетки, но не проникающие мезенхимные клетки являются источником коллагена типа II в первичной и вторичной строме (Linsenmayer et al.,[1990]; Hayashi et al.,[1988]; Chen et al.,[1993]). Синтез коллагена типа II вытесняется синтезом коллагена типа I мезенхимными клетками в строме после E10, во всяком случае существуют ди эти два коллагена как уникаьные гибридные фибриллы остается открытым вопросом. Hendrix and associates ([1982]) провели детальное исследование коллагенов типа I и II в развивающейся роговице кур и представили строгие, хотя и неубедительные доказательства присутствия обоих коллагенов в одной и той же фибрилле. Насколько известно существование гетеротипических типа I/типа II фибрилл всё ещё остается недоказанным. Частично причиной этого является маскирование коллагеновых эпитопов, это общая проблема, которая предупреждает иммунолокализацию. Преодолев эти трудности, Linsenmayer and co-workers ([1984]) продемонстрировали, что инвазия набухшей первичной стромы кур с помощью мезенхимы совпадает с быстрым появлением коллагена типа V по всей ткани. Birk and colleagues, в последующей серии элегантных экспериментов использовали ЭМ и убедительно показали, что коллаген типа V, который может составлять 10-20% от общего числа коллагенов роговицы в зрелой ткани, внедряется в коллаген типа I, возможно формируя гетеротипические структуры во время фибриллогенеза и помогая регулировать диаметр филрилл (Birk et al.,[1986],[1988],[1990]; Fig. 2). Последующие исследования кожи и роговицы у мышей, гетрозиготных по целенаправленной инактивирующей мутации в col5a1 привлеи к идее. что коллаген типа V инициирует образование гетерофибрилл и что редукция коллдагена типа V приводит к меньшему количеству мест nucleation и к меньшему количеству фибрилл (Segev et al.,[2006]; Wenstrup et al.,[2006]).
Коллагеновые фибриллы в развивающейся роговице кур взаимодействуют с несколькими не формирующими фибрилл FACIT (fibril-associated коллагенs with interrupted triple helices) коллагенами (Svoboda et al.,[1988]; Gordon et al.,[1996]). Один из них, коллаген типа IX, является главным FACIT в развивающейся роговице кур (Fitch et al.,[1988]; Svoboda et al.,[1988]). Коллагеновая типа IX мРНК экспрессируется эпителиальными клетками роговицы, когда откладывается первична строма, но её уровни снижаются до неопределимых на ст. E11. Типа IX коллагеновый белок обнаруживается с помощью иммунофлюоресценции на E5 и E6, но не E8 (Svoboda et al.,[1988]). В отличие от хряща, где коллагены типа II и IX также обнаруживаются, экспрессия коллагена типа IX в роговице, по-видимому, генетически не связана с экспрессией коллагена типа II; мРНК для коллагена типа IX обнаруживает временное присутствие в первичной строме, тогда как экспрессия коллагена типа II персистирует. В развивающейся роговице кур также коллаген типа IX лишен non-triple-helical, N-терминального 1(IX)NC4 глобулярного домена, присутствующего в 1 цепи хрящевого коллагена типа IX, структурной модификации, которая может вносить вклад в функциональные различия между хрящевым матриксом и ранней стромой роговицы (Svoboda et al.,[1988]). Идентификация перекресно-связывающихся сайтов между коллагенами типа IX и II в хряще подтверждает концепцию, что эти молекулы формируют гибридные структуры (Wu et al.,[1992]). В развивающейся роговице кур большая часть типа IX коллагена, как полагают, ассоциирована с фибриллами, присутствие несвязанного с фибриллами коллагена типа IX также возможно (Fitch et al.,[1994]). Непосредственно перед проникновением в строму презумптивных кератиноцитов роговица быстро теряет коллаген типа IX из первичной стромы (Fitch et al.,[1988]; Cai et al.,[1994]), это управляется, как полагают, совместным действием двух ферментов matrix metalloproteinase, MMP-2 и MT3-MMP (MMP16; Fitch et al.,[2005]; Huh et al.,[2007]). Было предположено, что типа IX коллаген может функционировать как стабилизирующий фактор, участвующий в поддержании первичной стромы в виде компактного матрикса и что, когда он ферментативно удаляется, то мезенхимные клетки становятся способны проникать до этого непроницаемую ткань и начинать синтезировать вторичную строму (Cai et al.,[1994]). Онтогенетически регулируемый протеолиз коллагена типа IX может , т.о. запускать клеточную инвазию (Fitch et al.,[1998]), а не из-за каких-то молекулярных стимулов. Скорее всего возможно, что экспансия матрикса сама по себе является критическим фактором, который делает возможным клеточную инвазию. Эта концепция подтверждается экспериментами, которые показывают, что ингибирование поперечных связей коллагена достаточно, чтобы сделать возможной проникновение клеток в культуру роговицы, даже когда дестабилизирующий эффект ферментативного удаления коллагена типа IX блокирован с помощью MMP ингибиторов (Fitch et al.,[2005]).
Типа VI коллаген с распределением по всей строме появляется во время отложения вторичной стромы в роговице кур (Linsenmayer et al.,[1986a]) и обнаруживается в роговице 24-дневных плодах кроликов (Cho et al.,[1990]). Хотя эта молекула, образующая 100-nm нанизанные бусинками филаменты, совершенно отделена от интерстициальных окаймленных фибрилл, она присутствует повсюду на последующих стадиях развития и персистирует в зрелой строме роговицы. Описано ассоциированное с типа VI коллагеном и происходящее в то же самое время с быстрым разбуханием первичной стромы и проникновением клеток, удлинение и иррадиация стромальных структур, часто обозначаемых как и стромальные струны (strings), которые иммунометятся антителами к типа IV коллагену (Fitch et al.,[1991]). Эти структуры увеличиваются в числе между E6.5 и E7.5, как полагают, стабилизируют строму во время быстрого изменения объема и исчезают примерно на ст. E15. Типа IV коллаген также появляется как компонент базальной ламины вдоль проксимальной мембраны эктодермальных клеток во время отложения первичной стромы; он дополнительно присутствует как прерывистый ковер, ассоциированный с эндотелием на ст. E5, сохраняется в течение всего развития Descemet's мембраны, чтобы сформировать нерегулярные бляшки вдоль стороны, обращенной к задней части стромы на E15 (Fitch et al.,[1990]). Иммунодетекция типа IV коллагена в зрелой Descemet's мембране остается спорной (Grant and Leblond,[1988]; Fitch et al.,[1990]), и хотя отсутствует специфическая информация по роговице кур, имеются многочисленные доказательства, что решетчатое распределение коллагена в Descemet's мембране в основном обеспечивается типа VIII коллагеном (Labermeier and Kenney,[1983]; Sawada et al.,[1990]). Типа VIII коллаген, по-видимому, важен для развития самой стромы, т.к. целенаправленное нарушение у мышей генов, кодирующих полипептиды субъединиц этого коллагена, делает строму тонкой с немногими кератиноцитами и уменьшенной толщиной Descemet's мембраны (Hopfer et al.,[2005]). Небольшие количества типа III коллагена, обычного компонента интерстициальных фибрилл, также, по-видимому, синтезируются эндотелиальными клетками в развивающейся роговице кроликов, чтобы быть отложенными внутри растущей Descemet's мембраны, и персистируют во взрослой тканиa (Cintron et al.,[1988]).
Имеется несколько и др. минорных компонентов коллагенов, которые синтезируются во время развития и могут функционировать, интегрируя строму роговицы. Коллаген типа XIII широко экспрессируется в клеточных мембранах, его функция неизвестна, он идентифицируется в ассоциации с кератоцитами в задних двух третях стромы роговицы на 12 и 17 день глаз плодов человека (Sandberg-Lall et al.,[2000]).
Как типа XII, так и типа XIV коллагены существуют в виде длинных и коротких, альтернативно сплайсирумых вариантов, чтя экспрессия в развивающихся глазах может детерминировать специфические взаимодействия, важные для образования фибрилл, меж- и внутри-фибриллярных взаимодействий и сборки на уровнях высокого порядка внеклеточного матрикса (Young et al.,[2002]). Типа XII коллаген, который обнаруживает гомологию с типа IX коллагеном, был идентифицирован в роговице кур, кроликов и человека. Эти высоко интерактивные молекулы в принципе могут связывать протеогликаны, включая decorin и biglycan, и типа I коллаген. К кур уровни типа XII коллагеновой мРНК постоянны с E10 до взрослой стадии, с сегрегацией на субэпителиальную и субэндотелиальную строму во время эмбриональных стадий. Локализованный на ст.E6 белок считается эпителиального происхождения (Gordon et al.,[1987]), тогда как фибробласты вносят вклад в его синтез у взрослых (Young et al.,[2002]). Marchant and colleagues ([2002]) идентифицировали короткую изоформу коллагена типа XII в Bowman's слое эмбрионов кур, ассоциированную с областью повышенной концентрации кератоцитов в поверхностной строме. Временные изменения в локализации длинной формы коллагена типа XII ранее были вызваны Nishiyama and associates ([1994]) , чтобы подтвердить роль в компакции стромы, но эта изоформа недавно была обнаружена субэпителиально на ст. E3, расширялась в строму на ст. E5 и оказывалась более локализованной в презумптивном Bowman's слое и Descemet's мембране во время синтеза вторичной стромы (Akimoto et al.,[2002]). Дифференциальное распределение изоформ типа XII коллагена было описано в эмбриональной роговице кроликов (Anderson et al.,[2000]). Коллаген типа XII, следовательно, скорее всего играет роль в развитии как Bowman's слоя, так и Descemet's мембраны и в стабилизации интрефейса между регионами этой ткани и собственно стромы. Обе зоны, как было установлено. обладают повышенной стабильностью к температуре и протеазному перевариванию и как показывает иммунолокализация обогащены этими молекулами (Linsenmayer et al.,[1986b]; Gordon et al.,[1996]). В противоположность коллагену типа XII, коллагеновая типа XIV мРНК в роговице кур экспрессируется гомогенно в строме с наивысшими уровнями на E10-E14, после чего происходит снижение (Young et al.,[2002]). Соответственно, коллаген типа XIV обнаруживается в первичной строме кур на E6 (Gordon et al.,[1987]), с обоими коллагеновыми NC1 сплайс-вариантми, присутствующими на высоких уровнях между E12 и E14, и снижающимися к E17 и отсутствующими при вылуплении (Young et al.,[2002]).
Сходная роль в морфогенезе Bowman's слоя и Descemet's мембраны была предположена для типа XXIII коллагена (Koch et al.,[2006]), члена подсемейства трансмембранных коллагенов или MACITs (membrane-associated collagens with interrupted triple helices). Он экспрессируется в развивающейся и взрослой роговице кур, мышей и человека в ассоциации с эпителием и эндотелием, хотя из-за небольших количеств его в строме, было предположено, что он не играет непосредственной роли в организации и прозрачности стромы. Типа XIV коллаген обнаруживается повсюду во вторичной строме, когда роговица растет и может играть роль в компакции стромы, т.к. его экспрессия существенно увеличивается по ходу этого процесса. Экспрессия коллагена типа XXIV, минорного фибриллярного коллагена, обнаруживается в роговице мышей на E14.5 развития и как предполагают, влияет на фибриллогенез основного типа I интерстициальных фибрилл (Koch et al.,[2003]). На ст. E18.5 у эмбрионов мышей обнаруживается эпителиальная и стромальная экспрессия типа XV коллагена, не-коллагеновый домен которого кодирует endostatin, который может функционировать, влияя на отсутствие сосудов в роговице (Saika et al.,[2004]). Коллаген типа XVIII, который структурно связан с коллагеном типа XV, также генерирует endostatin с помощью протеолиза C-терминального домена (Marneros and Olsen,[2005]), и был идентифицирован в роговице человека, где он локализован в эпителии, эпителиальной базальной мембране, и в Descemet's мембране (Lin et al.,[2001]), хотя пока нет доступных данных о его проявлении во время развития. Коллаген типа XXVII, недавно открытый фибриллярный коллаген с новой доменовой структурой, обнаруживается временно в развивающейся роговице мышей на ст. E14.5 , после чего его локализация становится ограниченной суставным хрящом, где он формирует тонкие, 10-nm в диаметре. не связанные в пучки фибриллы (Plumb et al.,[2007]). Этот коллаген, вместе с типа XXIV, является необычным укороченной длиной своей α-цепи и дважды прерванным triple-helical доменом и его роль в фибриллогенезе интерстициального матрикса пока неизвестна.

PROTEOGLYCANS IN THE DEVELOPING CORNEAL STROMA


Протеогликаны молекулы внеклеточного матрикса, которые давно подозревались в участии в морфогенезе роговицы (Smelser and Ozanics,[1957]; Coulombre and Coulombre,[1958]; Anseth,[1961]; Hart,[1976]; Hahn and Birk,[1992]; Conrad et al.,[2006]). В роговице протеогликан составлет стержневой белок, несущий варьирующие количества боковых цепочек glycosaminoglycan с сульфатированными группами. Благодаря взаимодействиям с коллагенами, протеогликаны, как полагают, помогают управлять размером и устройством коллагеновых фибрилл в строме роговицы. Широко распространено мнение, что коллаген-протеогликановые взаимодействия соперничают, какая ассоциация возникнет посредством доменов стержневого белка из протеогликанов с судьфатированными glycosaminoglycan цепочками, оккупирующими межфибриллярное пространство, где они помогают приобрести свойства гидрофильности и набухания матрикса роговицы (Bettelheim and Plessy,[1975]) . а также пространственную организацию коллагеновых фибрилл (Borcherding et al.,[1975]). В роговица протеогликаны, по-видимому, соединяются со специфическими сайтами вдоль интерстициальных фибрилл с учетом D-периодичного паттерна дисков (banding pattern) (Scott and Haigh,[1985]), и в самом деле, накопление и стабильность lumican и keratocan в телячьих кератоцитах in vitro , если стимулируется ascorbate, зависит, частично. от образования стабильной коллагеновой тройной спирали с помощью гидроксилирования (Musselmann et al.,[2006]). In vitro, стержневые белки lumican и decorin, минус их glycosaminoglycan боковые цепочки, обладают способностью ограничивать фибриллогенез коллагенов (Rada et al.,[1993]), а модель, предложенная Chakravarti and associates ([2006]) о развитии роговицы новорожденных мышей, утверждает, что протеогликан, lumican, ассоциирующий со стволами вновь формируемых фибрилл, находится вблизи поверхности кератоцитов, чтобы предупредить рост фибрилл вбок. Т.о., скорее всего протеогликаны помогают обеспечить соотв. диаметр стромальных коллагеновых фибрилл.
Наиболее преобладающим в роговице глюкозаминоглюканом является keratan sulfate, и три типа протеогликанов были идентифицированы, которые несут эти боковые цепочки: lumican (Blochberger et al.,[1992a]), keratocan (Corpuz et al.,[1996]; Liu et al.,[1998]) и mimecan (или osteoglycin) (Funderburgh et al.,[1997]). Др. основным протеогликаном вроговице является decorin (Li et al.,[1992]), чья единственная glycosaminoglycan боковая цепочка, как полагают, является chondroitin sulfate/dermatan sulfate гибридом, хотя существуют некоторые доказательства для этого протеогликана дополнительной замены на keratan sulfate у взрослых, но не в роговице эмбрионов кур (Blochberger et al.,[1992b]).
Почти 50 лет тому назад было открыто, что происходят существенные изменения в химических и физико-химических свойствах glycosaminoglycans в строме роговицы кур во время развития (Anseth,[1961]). Биохимический анализ показывает, что keratan sulfate синтезируется рано в развитии между E5 и E7 (Hart,[1976]; Funderburgh et al.,[1986]), но только после E14 он становится более высоко сульфатированным (Hart,[1976]). Последующая работа показала приблизительно 3-кратное увеличение стержневого белка lumican между E7 и E9 (Cornuet et al.,[1994]), 2-3-кратное увеличение уровней мРНК β-1, 4-galactosyltransferase - энзима с предположительно главной ролью в синтезе keratan sulfate glycosaminoglycan боковых цепочек - между E8 и E13 (Cai et al.,[1996]) и достоверное увеличение в уровне сульфатированных keratan sulfate цепочек между E12 и E15 (Cornuet et al.,[1994]). Опубликованные доказательства также показывают, это указывает на то, что на ст. E18 в стороме кур keratan sulfate протеогликаны несут две-три цепочки приблизительно в 15 kDa каждая (Midura and Hascall,[1989]), и что куриный keratocan, подобно куриному lumican, имеет три из пяти потенциальных N-сцепленных олигосахаридных сайтов, заменяемых на keratan sulfate цепочки (Dunlevy et al.,[1998]).
Keratocan мРНК экспрессируется рано в эмбриогенезе всеми кератоцитами, как только они мигрируют в первичную строму на ст. E6 (Conrad and Conrad,[2003]). Позднее, с E9 по E18, уровни мРНК keratocan постоянно снижаются, тогда как уровни мРНК lumican, хотя они и флюктуируют на этой временной шкале, остаются в несколько раз выше, чем мРНК keratocan (Dunlevy et al.,[2000]). Недавнее иммуногистохимическое исследование в нашей лаб. (Gealy et al.,[2007]) показало, что keratocan белок концентрируется в передней части стромы кур с E10-E18, с четкой не иммунореактивной полосой непосредственно в субэпителиальной области, которая, по-видимому, соответствует Bowman's слою в зрелой роговице (Fig. 3). Bowman's слой это тонкая модификация наиболее передней части стромы, присутствующая у некоторых, хотя не у всех животных, которая отличается от собственно стромы своей сильно сплетенной сетью коллагеновых фибрилл, лишенной клеток. Отсутствие keratocan сигнала в презумптивном Bowman's слое согласуется с концепцией, что коллагенами связанный-keratocan необходим для установления массивов упорядоченных коллагеновых фибрилл в передней части стромы развивающихся кур. Матричное распределение keratocan иммунометки в передней части стромы с E10 по E18 не униформно. На E10-E13, точечное окрашивание указывает на ассоциацию белка с клетками, а также на то, что он присутствует в матриксе. На ст. E14, с др. стороны, keratocan белок преимущественно внеклеточный, формирует линейные ансамбли внутри передней части стромы.
C ранних пор исследований в этой области было отмечено, что сульфатированные glycosaminoglycans накапливаются неравномерно в роговице кур во время эмбриогенеза. Coulombre and Coulombre ([1958],[1961]), напр., сообщали, что повышенно метахроматическое окрашивание, обнаруживаемое на E14 первоначально в pre-Descemet's регионах и что лишь позднее оно обнаруживается в остальной части стромы. Эти авт. подчеркивают, что это может быть следствием увеличения региональной концентрации метахроматического материала, первоначально в задней части стромы из-за компакции матрикса. Smelser and Ozanics ([1957]) также обнаружили корреляцию распространения metachromasia с потреблением радиомеченного сульфата во время развития. Недавнее исследование нами с использованием моноклональных антител 5D4 против минимально pentasulfated эпитопов на keratan sulfate glycosaminoglycan подтвердило - в отличие от ранних сообщений (Funderburgh et al.,[1986]; Takahashi et al.,[1999]) - отложение сульфатированного keratan sulfate до E14 происходит в первую очередь в передней части роговицы и затем распространяется на всю толщину стромы (Young et al.,[2007]). Учитывая сходное тканевое распределение (Gealy et al.,[2007]), мы предположили, что keratocan стержневой белок скорее всего несет некоторые из этих сульфатированных keratan sulfate цепочек, хотя пока невозможно собственно определить и разделить роли lumican и keratocan в морфогенезе роговицы кур. Этот вопрос осложняется ещё тем фактом, что биосинтез keratocan транскрипционно регулируется с помощью lumican (Carlson et al.,[2005]).
Как упоминалось, в дополнение к keratan sulfate, роговица также обладает протеогликанами с glycosaminoglycan боковой цепочкой, которая является chondroitin sulfate/dermatan sulfate гибридом. Chondroitin sulfate glycosaminoglycan был идентифицирован иммуногистохимически в строме как до, так и во время миграции презумптивных кератоцитов в развивающуюся строму кур (Doane et al.,[1996]). На ст. E18, chondroitin sulfate/dermatan sulfate протеогликаны в роговице кур обладают одиночной glycosaminoglycan цепочкой приблизительно в 65 kDa (Midura and Hascall,[1989]). Было предположено. что эти молекулы нацелены на коллагеновые фибриллы, чтобы скользить от одной к др. во время развития и реструктуирования роговицы (Bard et al.,[1988]). В самом деле, эксперименты с само-сборкой коллагеновых фибрилл in vitro подтвердили, что decorin облегчает фибриллярное относительное скольжение во время деформации (Pins et al.,[1997]). Определенно кажется, что роль dermatan sulfate проявляется в морфогенезе роговицы у кур, т.к. когда его биосинтез нарушен инъекцией β-D xyloside в воздушный мешок на ст. E10-E14, то роговица обнаруживает ограниченный набор dermatan sulfate и характеризуется структурно дезорганизованным стромальным матриксом, но неизменным диаметром фибрилл на ст. E17 (Hahn and Birk,[1992]). Недавние исследования, сконцентрированные на детекции и количественной оценке высвобождения chondroitin sulfate/dermatan sulfate с помощью chondroitinase ABC из срезов роговицы кур с E8 до вылупления, открыли изменения в дифференциально сульфатированных дисахаридах из этой молекулы по ходу развития (Zhang et al.,[2005]). Эти эксперименты открыли, что пропорция chondroitin-4-sulfate увеличивается с увеличением сроков эмбриогенеза, тогда как пропорция chondroitin-6-sulfate снижается, возможно из-за дифференциальных активностей sulfotransferase. Точкой пересечения, когда концентрации в тканях оказывались приблизительно равными, соответствовала E14, началу прозрачности, это позволило авт. предположить, что chondroitin-6-sulfate может быть более важным для морфогенеза стромы в раннем развитии, т.к. chondroitin-4-sulfate более важен для установления и стабилизации компактизованной и прозрачной стромы, которая персистирует от вылупления до созревания (Zhang et al.,[2005]).
Заодно с оказанием влияния на ультраструктуру коллагена, было высказано предположение, что вариации в природе протеогликанов вместе с коллагенами и др. матричными компонентами могут быть важными для регуляции миграции и дифференцировки клеток во время развития роговицы (Doane et al.,[1996]).

STROMAL MATRIX BIOASSEMBLY


В раннем развитии роговицы кур коллагеновые фибриллы уже в ортогональном регистре (Hay and Revel,[1969]; Conrad,[1970]; Trelstad and Coulombre,[1971]). На ст. E6, первоначально бесклеточная строма увеличивается в толщине до приблизительно 110µm. В это время, задняя часть в 100µ m занимается мезенхимой и находится на пути становления вторичной стромой, тогда как передняя часть стромы в 10µ m остается незанятой клетками. Каждый последующий слой ортогонального коллагена обнаруживает небольшое угловое смещение приблизительно на 1-2 градуса по часовой стрелке, если смотреть с эндотелиальной стороны (Trelstad and Coulombre,[1971]). Эта прогрессирующая ротация ортогональных массивов коллагена продолжается в ходе развития, так что последовательно более поверхностные ламеллы откладываются в последовательности позади бесклеточной зоны, расположенной под эпителием. Интересно отметить, что направление ротации одно и то же в обоих глазах, т.о., независимо от др. свойств глаз угловой сдвиг в ориентации коллагенов в развивающейся строме не является симметричным по отношению к срединной линии тела (Coulombre and Coulombre,[1961]; Trelstad and Coulombre,[1971]). Такая асимметрия ведет к идее, что развитие стромы у кур может , по крайней мере, частично быть процессом самосборки, при которой матрикс сам себе помогает руководить развитием своей собственной архитектуры. Разумно предположить, что т.к. молекула коллагена является right-handed суперспиралью, то коллагеновые фибриллы также д. обладать некоторой наследуемой харальностью (handedness), с взаимодействиями коллаген-коллаген, вызывающими угловой сдвиг в ориентации фибрилл первичной стромы, которая оказывается одной и той же в обоих глазах (Coulombre and Coulombre,[1961]; Trelstad and Coulombre,[1971]).
Природа факторов, влияющих на ориентацию отложений коллагена во время морфогенеза роговицы, остается неизвестной, но была рассмотрена Trelstad and Coulombre ([1971]), которые рассмотрели несколько возможностей, включая сами базальные эпителиальные клетки, биомеханические стрессы на строму, индуцируемые внутриглазным давлением, а также прямые взаимодействия между компонентами матрикса.
Ортогональная организация коллагеновых фибрилл в первичной строме возникает благодаря сложным процессам сборки. Ортогональные пучки фибрилл скорее, чем листки, откладываются в первую очередь в существующей первичной строме по мере увеличения толщины ламелл во вторичную строму (Bard and Higginson,[1977]). Birk и Trelstad [1984] в своём исследовании использовали трансмиссионную ЭМ для изучения роговицы эмбрионов кур и установили, что фибриллогенез происходит внутри небольшого разрыва поверхности кератоцитов, первоначально в виде небольших пучков из 5 - 12 коллагеновых фибрилл униформного диаметра и пространственного расположения (Fig. 4). Эти небольшие пучки сливаются, сначала в более крупные, пучки, которые всё ещё ассоциированы с клеточной поверхностью, и в конечном итоге в ламеллы. Гаше недавнее исследование с помощью иммунноэлектронной микроскопии (Young et al.,[2007]) показало, что высоко сульфатированные keratan sulfate ко-ассоциируют с коллагеновыми фибриллами очень тесно на клеточной поверхности, возможно как только они выталкиваются. Birk и Trelstad ([1984]) также использовали ЭМ высокого напряжения, чтобы исследовать срезы толщиной в 500-nm развивающейся роговицы кур, сделанные параллельно поверхности роговицы. Это показало, что фибробласты роговицы и их отростки расположены вдоль двух основных осей, перпендикулярно один другому и что складки клеточной поверхности , в которых откладывается коллаген были расположены вдоль клеточных осей, тем самым создавали ортогональность откладываемых ламелл. Наши ЭМ исследования срезов тканей менее 100 nm толщиной роговицы эмбрионов кур обнаружили ламеллы, состоящие из коллагеновых фибрилл, декорированных иммуномеченными keratan sulfate, которые шли в нескольких направлениях, особенно на ст. E14, когда матрикс всё ещё довольно рыхлый (Young et al.,[2007]; Figs. 5, 6).
Несмотря на наблюдения, упомянутые выше, механизмы, с помощью которых стромальные клетки откладывают коллагеновые фибриллы во внутриклеточное пространство, чтобы создать ортогональную trans-lamellar архитектуру, всё ещё не известны. Недавние исследования Canty and colleagues (Canty et al.,[2004]; Canty and Kadler,[2005]) с использованием трехмерных реконструкций из серийных срезов эмбрионального сухожилия, установили, что фибриллы формируются внутри клеток в связанных со внутренней стороной мембраны включениях, названных Гольджи как plasma membrane carriers. Фибриллы проводятся во внеклеточное пространство с помощью fibripositor выпячиваний клеточной мембраны, которые выравниваются вдоль оси клетки и сухожилия. Выталкивание фибрилл может происходить, когда клетки мигрируют, так что ориентация фибрилл диктуется прямыми линиями клеточных движений. Клетки в развивающейся роговице кур, с др. стороны, по-видимому, одновременно высвобождают фибриллы, принимая различные матричные ориентации (Young et al.,[2007]), указывая тем самым на строгий клеточный контроль над откладкой рудиментарных ламелл. В то время как фибриллы сухожилий откладываются в параллельном регистре вдоль одной геометрической оси, в роговице скоординированное отложение нескольких ламелл, содержащих фибриллы происходит в разных ориентациях, это значительно сложнее и может использовать приращение компонентов в мембранных каналах на поверхности мигрирующих клеток роговицы.
Существует альтернативное механистическое мнение на фибриллогенез коллагена и сборку стромы, что этот процесс не нуждается в скоординированном перемещении клеток. Было показано, что фибробласты могут работать скоординировано, чтобы создавать высоко сконцентрированные мономерные решения из коллагена, которые ведут к супрамолекулярным порядкам посредством cholesteric эффектов (Giraud-Guille,[1996]; Giraud-Guille at al.,[2003]). Исходя из экспериментов с культурами человеческих фибробластов при высоких плотностях клеток и при высоком соотношении объёмов клетка-матрикс было установлено, что коллагеновые мономеры секретируются во внеклеточное пространство в достаточно высоких концентрациях , чтобы заставить их принять организованные паттерны, которые отражают, на локальном уровне, расположения клеток (Guo et al.,[2007]). Вообще-то сходные механизмы могут существовать и в развитии. в
Было предположено несколькими исследователями, что мезенхимные клетки мигрируют в строму, используя первичную строму и др. клетки в качестве субстрата (Bard and Hay,[1975]). Однако рассмотрение онтогенетических процессов, которые устанавливают роговицу кур, ставят несколько вопросов, которые ещё решены не полностью. Представляет ли первичная строма собой матрицу для проникающих кератоцитов, чтобы расположить их и соответственно откладывать коллаген организованным способом? Действует ли первичная строма как каркас или ядро для последующей самосборки вновь откладываемого коллагена независимо от выравнивания клеток в линии? Обладают ли проникающие кератоциты сами по себе врожденным пространственным знанием как популяция не нуждающаяся в структурном поводыре? В [1971], Trelstad and Coulombre рассмотрели первые две возможности и пришли к выводу, что имеющиеся данные на тот момент не позволяют выбрать между этими или др. возможностями. Т.к. в то время. по нашему мнению, не было определяющих экспериментов, чтобы с определенностью объяснить морфогенез стромального матрикса, хотя сегодняшние эксперименты, такие как работы по fibripositor и cholesteric механизмам, упомянутым ранее (Canty et al.,[2004]; Canty and Kadler,[2005]; Guo et al.,[2007]), обещают углубление нашего понимания. Эксперименты Doane and Birk ([1991]) также представляют существенный интерес, если рассматривать ультраструктуру стромы в развитии. Культура изолированных кожных, сухожильных и роговичных фибробластов в трехмерном коллагеновом геле демонстрируют, что в то время как дермальные клетки не обнаруживают очевидной ориентации при конфокальной флюоресцентной микроскопии после 3 или 7 дней культуры, то фибробласты сухожилия растут параллельно один др. в пучках в лой из временных точек. Фибробласты роговицы. с др. стороны, ориентируются перпендикулярно один др. на 3 день и формируют ортогональные листы на 7 день. Принимая во внимание, что in vitro матрикс, в котором клетки растут, не содержит направляющих сигналов, то имеющие данные подтверждают обладание дифференцированными фибробластами внутреннего и ткане-специфичного знания организации

MATRIX COMPACTION AND THE ONSET OF CORNEAL TRANSPARENCY


Эмбриогенез роговицы приводит к появлению на ст. E21 доминирующего внеклеточного стромального матрикса с измененной структурой и составом. Как описывается Trelstad and Coulombre ([1971]) каждый слой первичной стромы продуцируется не в виде непрерывных листков униформно тонких и регулярно расположенных коллагеновых фибрилл. а в виде конгломерата боками соединенных пучков в 1-3 фибриллы толщиной и в 5-25 фибрилл толщиной. Количество и ориентация этих слоев - преимущественно презумптивных стромальных ламелл - устанавливается на ст. E14, с последующим ростом, обеспечиваемом синтезом и добавлением большего числа коллагенов и др. компонентов внеклеточного матрикса в существующие слои. Как было установлено с помощью экспериментов Coulombre and Coulombre ([1958],[1961]), после E14, сухой вес развивающейся стромы у кур продолжает увеличиваться, тогда как масса сырого вещества увеличивается в сокращенном виде. Результатом этого является прогрессивная дегидрация эмбриональной стромы у кур после E14. Это обезвоживание проявляется в истончении или компакции вторичной стромы, это д. сопровождаться структурной перестройкой клеточного и внеклеточного матрикса. Стромальные кератоциты становятся уплощенной формы между E14 и E15 , также и свободные от коллагена пространства между пучками коллагеновых фибрилл становятся прогрессивно всё меньше, т.к. матрикс компактизируется (Hay and Revel,[1969]; Connon et al.,[2003]).
Реорганизация развивающегося стромального матрикса изучалась с помощью рентгеновской дифракции, чтобы оценить количественно среднее расположение коллагеновых молекул и фибрилл (Meek and Quantock,[2001]). High-angle X-ray анализ показал, что среднее между молекулами коллагена внутри коллагеновых фибрилл остается в основном неизменным с E13 по E18 (Quantock et al.,[2003]). Если мы предположим существование одного и того же количества молекул коллагена на фибриллу, то это совпадет с результатами измерений quick-freeze, deep-etch electron microscopy, которая показала, что диаметры коллагеновых фибрилл не меняются между E9-E10 и E15 и остаются теми же самыми и на 8-й день после вылупления (Hirsch et al.,[1999]). Эксперименты по Small-angle X-ray дифракции волокон показали, что пространства между коллагеновыми фибиллами в среднем уменьшаются в строме по всей толщине между E12 и E18 (Quantock et al.,[1998]). Последующие исследования расположения фибрилл, проведенные параллельно с измерениями гидратации ткани, подтвердили, что компакция матрикса между E12 и E14 происходит потому, что регионы стромы с относительно высоким содержанием воды, удаляются и несколькими днями позже с E16по E18 компакция коллагеновых фибрилл становится более гомогенной (Siegler and Quantock,[2002]). Структурные изменения проявляются не униформно на всю глубину стромы,, однако Trelstad and Coulombre ([1971]) сообщили, что компакция матрикса , которая начинается на ст. E14 наиболее выражена в разных слоях роговицы. Работы нашей лаб., между тем, идентифицировали увеличение плотности коллагеновых фибрилл в интервале E14-E18, которое не происходит униформно в отношении глубины стромы (Connon et al.,[2004]). На E14 и E16, плотности ряда фибрилл в передней части стромы были выше, чем в задней части стромы, но на ст. E18 оказывались одинаковыми в передних и задних областях. Точные механизмы, которые управляют компакцией развивающейся роговицы кур понятны неполностью, но скорее всего, что ферментативное удаление hyaluronate из стромы во время инициального периода компакции с E9 и далее играет роль (Toole and Trelstad,[1971]). Эндотелий почти определенно также вносит существенный вклад в дегидрацию развивающейся стромы роговицы, хотя точные детали роли этих клеток остаются неясными. По нашему мнению небольшие стромальные протеогликаны, особенно те с разнообразными keratan sulfate, скорее всего служат для тонкой организации фибрилл на локальном уровне посредством взаимодействий с коллагеном и др. с др. скорее, чем на уровне глобальной компакции матрикса. После этого всего, как описывалось ранее, развивающаяся строма кур накапливает hydrophilic keratan sulfate (Hart,[1976]; Cornuet et al.,[1994]) в течение того же самого интервала, когда она становится все более обезвоженной и компактной.
Как сообщалось в раннем исследовании Coulombre and Coulombre ([1958],[1961]), трансмиссия попадающего белого света через развивающуюся роговицу кур увеличивается приблизительно от 40% на ст. E14 до приблизительно 95% при вылуплении. Т.о., сначала прозрачность сопутствует началу обезвоживания роговицы и оба процесса связаны. Ультраструктура матрикса и способ расположения коллагеновых фибрилл в развивающейся роговице кур важны для тканевой прозрачности, поскольку трансмиссия света роговицей приписывается эффектам интерференции между светом, рассеиваемым коллагеновыми фибриллами, которые организованы до определенной степени регулярно (Maurice,[1957]; Hart and Farrell,[1969]; Cox et al.,[1970]; Benedek,[1971]; Freund et al.,[1986]; Farrell,[1994]). Результатом является то, что образование массива униформных тонких коллагеновых фибрилл с до определенной степени коротко-действующей поперечной упорядоченностью необходимо для трансмиссии света роговицей и что до тех пор, пока эта упорядоченность не будет достигнута у развивающихся кур, роговица не станет прозрачной.
Развивающаяся роговица кур из-за того, что становится естественно прозрачной и естественно реструктуируется в течение определенного периода времени, представляет собой удивительную модельную систему для изучения прозрачности роговицы. Теория прозрачности утверждает, что фракция света, передаваемая без отклонения роговицей F(λ) является функцией (1) общего рассеивания поперечным сечением (cross-section) σ; (2) численной плотности фибрилл в строме, ρ ; and (3) толщины ткани, t (Farrell,[1994]). Взаимоотношения приобретают форму F(λ) = e-σρt. Подсчеты рассеяния света не являются тривиальными, т.к. рассеивание поперечным срезом cross-section, σ , является само по себе функцией длины волны света, диаметра коллагеновых волокон, их способа упаковки и отношения refractive index гидратированных фибрилл к refractive index межфибриллярного матрикса. Т.о., чтобы помочь пониманию прозрачности роговицы, несколько типов экспериментальных данных необходимы, включая репрезентативные измерения архитектуры коллагенового матрикса.

MAMMALIAN CORNEAL DEVELOPMENT


Превалирующим видом для изучения развития роговицы являются куры. Немногие сравнительные морфогенетические исследования были проведены с развитием стромы роговицы у млекопитающих, при этом выявлено несколько отличий от кур (Haustein,[1983]; Cintron et al.,[1983]; Sevel and Isaacs,[1988]). Характерная субэпителиальная первичная строма с ортогональными коллагеновыми слоями, напр., не обнаруживается у кроликов или грызунов или она не идентифицируется в роговице приматов, где вместо этого присутствует бесклеточный дезорганизованный слой коллагеновых фибрилл (Ozanics et al.,[1977]). Поэтому отличия между первичной и вторичной стромой не столь заметны в эмбриональной роговице не птиц, хотя различия в развитии между наружной и внутренней стромой всё ещё существуют у не птичьих видов и обнаруживаются на 16 день беременности у кроликов (Cintron et al.,[1983]). Клеточные отличия наблюдаются также, а инвазия мезенхимных клеток у не птичьих видов, по-видимому, использует др. структуры для наведения клеток, включая кровеносные капилляры, др. мезенхимные клетки и капсулу хрусталика (Cintron et al.,[1983]). Более того, в развивающейся роговице кроликов и приматов в отличие от кур появление кератоцитов уплощенной морфологии с помощью инвазирующих стромальных клеток происходит до конденсации роговицы.
Основные типы коллагенов в роговице млекопитающих это I и V как и у кур, а Cintron and associates ([1981]) сообщили, что AB коллаген (типа V) увеличивается с 6% у плодов кроликов до 11% в роговице молодых особей. Недавнее исследование было сфокусировано на изменениях в экспрессии генов и транскрипционных факторов, участвующих в созревании эпителия роговицы, при этом обращалось внимание также на контроль развития стромы. Достоверные изменения в экспрессии генов продолжали появляться вплоть до открытия глаз, т.к. периода, который сегодня считается важной стадией в развитии роговицы (Zieske,[2004]; Norman et al.,[2004]). Роговица мышей уже хорошо сформирована при рождении, но подвергается существенному росту постнатально и характеризуется изменениями в толщине ткани, плотности клеток и рассеивании света. Исследования, использующие конфокальную микроскопию установили, что во время неонатального развития примерно во время открытия глаз, мышиная строма испытывает временные изменения в толщине после 8-го дня потнатального развития, пик которых приходится на 12-й день и затем снижается на 14-й день перед возобновлением медленно продолжающегося роста до взрослой толщины (Song et al.,[2003]). Эксперименты по X-ray дифракции подтвердили, что толщина стромы на 12-й день постнатального развития вряд ли обусловлена гомогенным отклонением коллагеновых фибрилл, измеряемым как среднее от толщины всей стромы (Beecher et al.,[2006]). ЭМ показала, что униформно тонкие коллагеновые фибриллы в передней части мышиной стромы прекрасно организованы до открытия глаз, на 10-й день постнатального развития, тогда как задняя часть стромы нуждается в большем времени для достижения этой характерной структуры (Chakravarti et al.,[2006]). Исследования с col5a1 гаплонедостаточными мышами, чьи роговицы имеют уменьшенные количества col5a1 мРНК и коллагена типа V, показали, что крупного диаметра коллагеновые фибриллы видны в возрасте 3-х месяцев характерны также для 10-го постнатального дня (Segev et al.,[2006]). Эта находка указывает на то, что этот структурный фенотип обусловлен дефектным фибриллогенезом в раннем развитии скорее, чем является следствием дефицита стабильности, роста и оборота фибрилл.
Исследования роговицы взрослых кроликов после экспериментально индуцированных проникающих ран, подтвердили предположения, что заживление роговицы может воспроизвести некоторые нормальные события в строме развивающейся роговицы (Cintron and Covington,[1990]). Т.к. у эмбрионов, шрамы экспрессируют различные протеогликаны в передней и задней части стромы с высоко сульфатироваными keratan sulfate замещаемым chondroitin sulfate на ранних стадиях заживления. Спустя 8 недель после ранения паттерн окраски протеогликанов с помощью катионовой окраски, cuprolinic blue, напоминает таковой во время развития (Cintron and Covington,[1990]). Др. работа продемонстрировала, что chondroitin sulfate протеогликаны в непрозраных шрамах роговицы ассоциируют с регионами увеличенных пространств между коллагеновыми фибриллами в строме, которые спустя 1 год возвращаются к нормальными коллагеновым пространствам и протеогликановому составу (Hassell et al.,[1983]). Некоторые доказательства также указывают на то, что типа III коллаген, который появляется в небольших количествах в проксимальных регионах развивающейся роговицы, обнаруживают возобновление синтеза в наиболее задних частях новой рубцовой ткани во время заживления раны роговицы у кроликов (Cintron et al.,[1988]). Напротив, типа VI коллаген, обильный в роговице эмбрионов, обнаруживает существенное снижение в заживающей роговице кроликов (Cho et al.,[1990]). Также устанавливаемые высоко организованные клеточные слои в роговице плодов кроликов отсутствуют в ранних заживающих ранах. Коллаген, быстро откладываемый в ранних ранах, напоминает очень сильно ситуацию в роговице кроликов постнатально скорее, чем у эмбрионов (Cintron et al.,[1983]). Фибробласты в заживающих ранах ориентируются параллельно с регенерируемым эпителием и секретируемыми коллагеновыми фибриллами, выравниваясь вдоль их уплощенной поверхности, но даже спустя несколько лет ламмеллярная организация не восстанавливается до такой степени, которая имеет место в развитии (Cintron et al.,[1982]).
На значительно меньшем уровне, чем у кур, исследования проводились на протеогликанах в развитии роговицы млекопитающих. Иммунореактивность с моноклональными антителами, которые распознают keratan sulfate, выявляет ранний синтез сульфатированных форм этой молекулы на 13-й день развития плода и презумптивной области роговицы кроликов (Sundarraj et al.,[1986]). Сульфатированный keratan sulfate персистирует во время развития, при этом предполагается, что задние стромальные слои окрашиваются более интенсивно, чем передние слои. Были идентифицированы в низких концентрациях низкого молекулярного веса и недосульфатированные молекулы в развивающейся роговице кроликов с повышающимися до взрослого уровня между 2 и 6 неделями после рождения (Gregory et al.,[1988]). Dermatan sulfate proteoglycan, напротив. высоко сульфатирован с ранних стадий развития. У мышей исследования иммунофлюоресценции показывают, что keratan sulfate proteoglycan lumican присутствует гомогенно во всей строме роговицы перед открытием глаз в ранний постнатальный период, но позднее, в постнатальные дни 45 и 90, он локализуется почти исключительно в задней части стромы (Chakravarti et al.,[2006]).
Роговицы gene-targeted мышей, дефицитных по основному keratan sulfate proteoglycan, lumican, более тонкие. чем в норме (Chakravarti et al.,[1998],[2000],[2006]), а временные постнатальные утолщения стромы, характерные для дикого типа новорожденных мышей при открытии глаз, не обнаруживаются (Song et al.,[2003]). Было предположено, что роль lumican связана с установлением соотв. образом организованного стромального матрикса в неонатальной фазе развития - преимущественно путем его взаимодействия с коллагеном и др. компонентами матрикса - с вероятностью, что структурные дефекты, наблюдаемые в lumican-нулевой роговице взрослых (Chakravarti et al.,[1998],[2000]; Quantock et al.,[2001]), не будут накапливаться с возрастом, а будут остатками более ранних постнатальных онтогенетических событий (Beecher et al.,[2006]; Chakravarti et al.,[2006]). Увеличение рассеяния света стромой и помутнение роговицы, обнаруживаемые у взрослых lumican-нулевых мышей (Chakravarti et al.,[1998],[2000]) , показывают важность этой молекулы в прозрачности роговицы. Роговицы мышей и др. грызунов, по-видимому, обладают достоверными различиями от др. млекопитающих и от кур - содержанием в роговицах сульфатированных протеогликанов. Иммуноанализ показал, что keratan sulfate в роговице взрослых мышей преимущественно недосульфатирован и идентифицируется 4-sulfated, но не 6-sulfated, chondroitin sulfate/dermatan sulfate (Young et al.,[2005]). Присутствуют филаментозные массивы небольших, ассоциированных с коллагенами протеогликанов, хотя более крупные chondroitin sulfate/dermatan sulfate-rich структуры, по-видимому, уникальные для роговиц грызунов, предоминируют. Возникновение этих структур ещё не было изучено в эмбриональной роговице.

FUTURE PERSPECTIVES


Much has been learned about corneal development since the early anatomical studies of Elizabeth Hay and her peers. Pressing questions remain, however, and it has become well appreciated that the embryonic chick cornea is an exemplary model system for continuing research into corneal development.
From our perspective, understanding structure-function relationships in corneal morphogenesis will lead to a heightened appreciation, not only of the requirements for stromal light transmission and corneal transparency, but of fundamental events in matrix biology and the key links between коллагенs and proteoglycans. In our laboratory technological advances, such as synchrotron X-ray diffraction to probe tissue regions on the micron scale (Quantock et al.,[2007]), along with high-resolution three-dimensional electron microscopic reconstructions of коллаген-proteoglycan associations on the nanometre scale (Lewis et al.,[2008]) are currently being developed to study cornea, and have great potential for application to corneal development.
Preservation of native hydrated structure is difficult in connective tissues like cornea, and conventional procedures of tissue preservation for electron microscopy are known to induce structural alterations, particularly as they ordinarily involve chemical dehydration methods. Thus, the application of new high-pressure freezing regimes to better preserve ultrastructure in cornea for examination by electron microscopy should enable us to gain improved structural information (Fig. 7). In this approach, cooling potentially can convert tissue water to vitreous ice so that a noncrystalline glassy state is achieved in which, ideally, all structural components are preserved in a native hydrated state. In hydrated bulk tissue the only proven approach for achieving vitreous ice is to freeze at pressures in excess of 2Kbar, at which point the physical properties of water are modified, and the formation of hexagonal ice crystals that disrupt tissue ultrastructure is avoided. Measurements of spectral dependence of light transmission through cornea, have also enabled knowledge to be gained about tissue hydration in a noninvasive manner with reference to propagation of infrared wavelengths (Doutch et al.,[2007]). This line of investigation might be very relevant to the study of the developing chick cornea, which undergoes considerable changes in its water-binding properties with embryonic age.
Advances in the understanding of the role of proteoglycans in corneal morphogenesis have been made by a variety of scientific approaches, among them biophysical approaches such as the recent examination of sulfated disaccharides in the developing chick cornea by electronspray ionization tandem mass spectroscopy (Zhang et al.,[2005]; Conrad et al.,[2006]). We now hope to extend the physical analysis of corneal embryogenesis by applying FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) to the developing chick cornea to better elucidate its chemical composition noninvasively (with a focus on sulfated proteoglycans), and to apply polarized reflection absorption infrared spectroscopy to investigate sulfated chain orientation with respect to the ordered коллаген matrix.
Сайт создан в системе uCoz