Designing customized cell signalling circuits  Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, 393-403 (June 2010) | doi:10.1038/nrm2904 | |
|
Living cells have evolved a broad array of complex signalling responses, which enables them to survive diverse environmental challenges and execute specific physiological functions. Our increasingly sophisticated understanding of the molecular mechanisms of cell signalling networks in eukaryotes has revealed a remarkably modular organization and synthetic biologists are exploring how this can be exploited to engineer cells with novel signalling behaviours. This approach is beginning to reveal the logic of how cells might evolve innovative new functions and moves us towards the exciting possibility of engineering custom cells with precise sensing–response functions that could be useful in medicine and biotechnology.
 Рисунки к статье. | FURTHER INFORMATION Wendell A. Lim's homepage Cell Propulsion Laboratory NSF Synthetic Biology Engineering Research center |
Живые клетки являются динамичными системами, которые используют сложные circuits сигнальных молекул, чтобы отслеживать внешние и внутренние состояния и осуществлять соотв. физиологические реакции. Подобно любой сенсорной машине, развившейся или созданной человеком эти клеточные сигнальные циркуиты содержат принимающие решения субсистемы, которые действуют как сенсоры и процессоры (такие как рецепторы и их эффекторы), которые в конечном итоге контролируют различные реакционные субсистемы (такие как транскрипция генов и динамика цитоскелета) (Fig. 1a). Главной целью современной клеточной биологии является понимание как эти молекулярные сигнальные системы осуществляют свои сложные ответы, которые являются оптимальными в отношении их физиологической роли. Нам интересно понять, как эти системы работают, что привело к возникновению радикально нового подхода - к попыткам спроектировать и построить искусственные сигнальные circuits1, 2.
Здесь я сфокусировался на синтетической биологии передач сигналов, чтобы посмотреть, как сигнальные циркуиты в эукариотических клетках может быть созданы искусственно, чтобы сконструировать клетки с желаемым поведением. Эукариотические клетки используют сети сигнальных белков, чтобы ощущать своё окружение и обеспечивать быстрые ответные реакции. Т.к. сети, преобразующие сигналы в клетке функционируют в трехмерной окружающей обстановке, поэтому они также контролируют сложные пространственные или морфологические клеточные ответные реакции. Я обсуждают, как сигнальные дуги (circuits) с точными поведенческими реакциями могут быть сгенерированы, рассматривая, как детерминируется специфичность реакций (т.е. какой набор результирующих продуктов связан со специфическим входящим сигналом), насколько точно настраиваемые дозовые реакции или временные динамические профили реакций оптимизированы для определенных физиологических функций и как сложный пространственный и морфологический контроль может быть достигнут (Fig. 1b). Я также рассматривают, почему возникли усилия создать и построить синтетические сигнальные circuits, как они могут повлиять на дальнейшие перспективы в создании принципов и механизмов молекулярных сигнальных систем и как искусственно созданные поведенческие реакции могут найти применение в медицине и биотехнологии. Наконец Я обсуждают как в будущем инструменты и методы могут быть разработаны, чтобы с лёгкостью воссоздавать клеточное поведение. Why engineer cell signalling? До рассмотрения специфических примеров создания сигнальных путей, необходимо обсудить мотивации создания передач клеточных сигналов. Попытки создания новых сигнальных поведений в клетках выглядят подобно дерзновенным целям, учитывая, что мы ещё не обладаем полным или надёжным предсказуемым пониманием природы естественных сигнальных circuits (петель обратной связи) клеток. Однако искусственное создание передачи клеточных сигналов это не просто процесс для воссоздания уже хорошо известного понимания - это предложение подхода для 'понимания путем построения'. В то время как биология традиционно является наукой анализа и deconstruction, чтобы идентифицировать гены и молекулы, которые важны для определенных процессов, синтетическая биология открывает противоположные подходы, концентрируясь на том, как индивидуальные молекулярные части могут собираться в системы, чтобы обеспечивать сложные поведенческие реакции3-7. Мы смогли полностью секвенировать геном и получили огромное количество протеомных данных, но мы не смогли завершить список молекулярных частей и понять как эти части согласуются др. с др. в функционально связанном пути. Искусственное создание новых сигнальных клеточных сетей открывает нам возможность тестирования и расширения нашего понимания организационных принципов сложных молекулярных систем.
В этом смысле синтетическая биология передач сигналов не просто ориентирована в направлении достижения прикладных целей, таких как построение клеток с целенаправленными функциями, но она также является исследовательской наукой, для которой важно понимание, как проекты 'работают' и как они связаны с проектами, которые 'не могут работать'. Напр., для естественной сигнальной сети, обеспечивающей интересующее сложное поведение, может быть использована традиционная генетическая deconstruction для идентификации молекул и связей, которые необходимы и важны для функции (Fig. 2a). Однако синтетические подходы могут затем использоваться для систематического исследования многих типов изменений, таких как альтернативные сетевые сцепления, настройка силы сцепления и добавление новых сцеплений, чтобы тестировать какие сети сопоставимы с интересующим поведением. Путем вычленения естественной сети или искусственного создания одиночного успешного circuit, вряд ли возможно углубление нашего понимания функционального ландшафта, которое может быть достигнуто путем исследования более полного и системного синтетического circuit5-7 (Fig. 2b). В этом смысле попытки искусственного создания клеточных поведений сродни ранней истории синтетической органической химии, где синтез новых или модифицированных молекул предоставил комплементарный подход для химического анализа при развитии фундаментальных теорий химических связей, структур и реактивности8.
Исследование пластичности сигнальных путей и того, как их функции могут настраиваться, имеет также отношение к патологии и лечению болезней. Многие раковые опухоли обладают онкогенными мутациями, которые эффективно 'заменяют заново' клеточные сигнальные сети, которые контролируют баланс между клеточным ростом, дифференцировкой и гибелью9.Сходным образом многие внутриклеточные патогены, включая бактерии и вирусы, продуцируют специфические белки, которые перенастраивают эндогенные сигнальные пути10-12. Многие бактериальные патогенные белки вмешиваются в сигнальные пути хозяина, часто супрессируя иммунный ответ хозяина или усиливая инфекцию (see Supplementary information S1 (box)). Т.о., путем использования синтетической биологии для понимания пластичности путей и того, как их поведение изменяется при пертурбациях сети, мы сможем получить лучшую основу для понимания стратегий, используемых патогенами для эксплуатации присущей хрупкости сигнальных сетей. Более того, мы можем разработать стратегии возвращения назад измененных болезнью сетей, чтобы стабилизировать не-патологическое поведение. Большинство стабилиных, базирующихся на сети, терапий может использовать не просто блокирование первичного онкогенного белка лекарством, а возобновлением сетей так, что они приобретут новое, но стабильное поведение.
Искусственное создание клеточных сигнальных поведений может также позволить нам конструировать клетки, запрограммированные исполнять точно соотв. приложения (Fig. 2b). Представим себе, что если бы мы могли воспроизводить и превосходить эволюцию путем использования набора инструментов из молекулярных частей для генетически преобразованных клеток, которые несут искусственно созданные ответные реакции. По мере созревания биологии стволовых клеток13-15 и техник, таких как разработка адоптивной иммунотерапии15, 16, возможности использования базирующихся на клетках терапий станут ближе, но будут нуждаться в сложном клеточном преобразовании, чтобы в точности контролировать поведение клеток. Напр., без нового контроля того, как можно собственно миграцию и дифференцировку стволовых клеток приспособить для регенеративной медицины, учитывая отсутствие нормальных онтогенетических сигналов? Более того, поскольку процессы индустриальной продукции, такие как продукция биотоплива и материалов, базируется на биологических организмах17, может оказаться возможным искусственно создавать более пригодные линии, которые, подобно средствам макроскопической продукции, обладают клеточными контрольными системами, которые отслеживают наружное и внутреннее состояния, чтобы оптимизировать продукцию. Это может быть особенно важным, поскольку мы используем ферментацию организмов, таких как дрожжи, чтобы продуцировать широкий круг материалов, которые могут иметь токсические эффекты.
Хотя искусственно созданные терапевтические клетки дело будущего, важно думать о том, какие поведения по детекции и ответной реакции будут ценны, поскольку они представлют направляющие вехи в разработке инструментов и стратегий замены путей в клетках.
Designed anti-cancer cells. Если мы сможем искусственно создавать терапевтические клетки, которые воспринимают болезненные сигналы и осуществляют высоко целенаправленные и в точности откалиброванные терапевтические программы в ответ, то какое поведение было бы желательно? Иммунные клетки, такие как T лимфоциты или natural killer клетки могут быть модифицированы, чтобы идентифицировать и убивать опухолевые клетки. Такие клетки уже используются в адоптивной иммунотерапии18, 19. Противо-раковые клетки могут быть созданы, чтобы выявлять комбинацию сигналов, ассоциированных с опухолями, включая специфические опухолевые антигены, гипоксию, орган-специфические антигены, ростовые факторы и цитокины, которые секретируются опухолями, чтобы сделать опухоли способными ускользать от нормальной иммунной реакции и создавать микроусловия, способствующие опухолям20 (Fig. 2b). Искусственно созданные клетки, которые распознают такие факторы, но сцепленные с противо-опухолевыми реакциями могут быть идеальными. Также очень важно создание внешнего контроля (напр., с помощью малых молекул) или надежного переключения в этих терапевтических клетках, так чтобы их поведение можно было выключать или ослаблять в зависимости от нежелательных побочных эффектов.
Искусствено созданные клетки, которые распознают эти специфические для опухолей сигналы могут быть преобразованы, чтобы вызывать несколько разных реакций, такие как продукция радиофармацевтических средств, которые предназначены для идентификации опухолей и метастазов и для контроля эндогенных иммуноклеточных реакций, таких как хемотаксис, фагоцитоз и убийство клеток. Вообще-то более важно, что эти клетки могут быть запрограммированы к секреции факторов, которые нарушают локальные опухолевые микроусловия, такие как про-воспалительные цитокины и анти-ангиогенные факторы, делающими непригодными для жизни и подержания опухолевого роста. Это может быть эквивалентно созданию искусственных иммунных клеток, которые делают непригодными опухолевые клетки и микроусловия на множественных уровнях.
Targeted immunosuppression. Иммунные клетки могут быть также предназначены для блокирования аутоиммунных заболеваний или отторжения трансплантированных органов (Fig. 2b). Обычная иммуносупрессивная лекарственная терапия показывает многочисленные и серьёзные системные эффекты. Искусственно созданные клетки могут быть запрограммированы, чтобы реагировать локальным иммуносупрессивным способом, вообще-то в ответ на специфические аутоиммунные или трансплантационные антигены в комбинации с цитокиновыми сигнатурами сильного аутоиммунного ответа. Такие клетки может быть запрограммированы к хемотаксису к источникам этих сигналов и реакции путем секреции анти-воспалительных цитокинов, которые делают непригодными воспалительные позитивные петли обратной связи, которые обычно ведут к полностью сформированному аутоиммунному ответу и реакции отторжения. Can signalling networks be engineered? Существует расхождение во мнении, могут ли клетки быть сконструированы. Клеточные сигнальные системы настолько тонко оптимизированы, что наше вмешательство д. приводить к катастрофическому нарушении функций или настолько сильными созданы с помощью эволюции, что добавление новых генов и сетевых связей не будет заметно изменять функцию? Ясно, что эволюция способна перемонтировать схему клеточных сигнальных путей, чтобы давать разные ответные реакции - на некотором уровне, следовательно, они относительно пластичны и способны к развитию. Т.о., прежде чем пытаться создать новые клеточные поведения, было бы полезно рассмотреть, как эволюция создаёт новаторские новые функции.
Критерием сигнальных белков является их модулярная структура, которая, как полагают, играет большую роль в эволюции. Эти модулярные домены могут выполнять каталитическую функцию или специфическую регуляторную функцию или функцию взаимодействия21, 22, и они обнаруживаются в высоко варьирующих комбинациях в разных сигнальных белках. Это ведет к модели, что разнообразие сигнальных функций может осуществляться за счёт рекомбинации доменов. Т.о., в принципе, если мы хотим понять, как работает эволюция с этими модулями, мы д. быть способны эксплуатировать тот же самый набор инструментов, чтобы найти регионы поведения, которые эволюция, согласно нашим знаниям, ещё не использовала.
Почему сигнальные белки и системы столь модулярны? Большинство соглашается с тем, что на эволюционной временной шкале организмы находятся под давлением на пригодность, чтобы развивать новаторские клеточные сигнальные реакции, которые могли бы приводить к преимуществам в изменяющихся условиях и в отношении конкурирующих организмов. При такого типа изменениях в давлении отбора на пригодность модулярные системы могут спонтанно развиваться как способ для облегчения более быстрой диверсификации функции23. Alon с сотр. стимулировали эволюцию биологической сети, используя эволюционные алгоритмы для поиска простых компьютерных сетей, которые решали бы поставленную цель24. Когда они повторно меняли поставленные цели, то возникающие в результате сети спонтанно развивали более модулярные решения - сети содержали функциональные подсети внутри них. Эти заранее сформированные подсети, модули, могут быстро воссоединяться в новые пути путем сдвига от одной целенаправленной функции к др. По сути модули, по-видимому, предоставляют способ быстро перемещаться от одной пространственной функции к др., перепрыгивая при этом через огромные регионы не функциональных сетей. Т.о., модулярная организация сигнальных белков и сетей может отражать давление на эти системы, чтобы генерировать поведения (behaviours), которые соответствуют нуждам постоянно изменяющейся среды.
Важность модулярности в облегчении эволюции новых функций согласуется с общими представлениями в эволюции и развитии, согласно которым выдвигаются аргументы, что большинство диверсификаций функций и морфологии организмов развивается посредством альтернативной регуляции существующих компонентов скорее, чем изобретение радикально новых компонентов25. Хотя многие из этих идей были разработаны путем концентрации прежде всего на регуляции генов с помощью разных цис-действующих модулей, они могут быть также приложимы к регуляции ключевых каталитических сигнальных модулей путем разной локализации и регуляторных модулей26, 27. Неудивительно, что в этих попытках создавать новые сигнальные характеристики, представленных ниже, использовались стратегии рекомбинации модулярных функциональных единиц в новые пути; тем самым в сущности использовались эволюционные стратегии для создания новых функций. Engineering new sensor systems Одним из критических инструментов для создания новых клеточных характеристик (behaviour) может быть способность создавать новые сенсоры и рецепторы для намеченных входящих импульсов. Однако, это возможно наименьший из охарактеризованных элементов в преобразовании передачи клеточных сигналов, поскольку возможных входящих сигналов огромное количество и они часто вызывают затруднения работы с довольно сложными мембранными белками. Ниже описан недавний прогресс в модификации ли конструировании разных рецепторных молекул (Fig. 3).
Redirecting the output of natural receptors. Имеется несколько примеров нативных рецепторов, которые были переориентированы на дачу новых результатов (output). Один из подходов использовал модулярную структуру Notch трансмембранных рецепторов, которые детектировали белки Delta, присутствующие в соседних клетках (Fig. 3Aa). Это критический канал межклеточного общения в развитии и дифференцировке. Когда Delta соединяется Notch, то трансмембранная область Notch расщепляется с помощью мембранной протеазы, высвобождая Notch С-терминальный домен в цитоплазму, откуда он поступает в ядро и активирует транскрипцию генов. Struhl et al. показали, что модуль Notch транскрипционного фактора может быть замещен с помощью синтетического транскрипционного фактора, так что когда он активируется in vivo, то химерный Notch может активировать гены, обнаруживаемые с помощью нового транскрипционного фактора28, 29. Хотя эта конструкция была использована в качестве репортера активации Notch, она легко может использоваться для связи детекции нативного Delta с совершенно новым набором не-нативных генов мишеней.
Barnea et al. расширили эту Notch-инспирированную модулярную стратегию с помощью искусственного создания новых транскрипционных результатов для рецепторов, которые обычно не используют этого типа механизм активации protease30 (Fig. 3ab,ac). Когда G protein-coupled receptors (GPCRs) активируются с помощью своих специфических лигандов, они часто рекрутируют β-arrestin, который используется для подавления передачи сигналов GPCR. Barnea et al. слили β-arrestin с высоко специфической протеазой их вируса табачной мозаики (TEV), так что он ко-рекрутировался в ответ на активацию GPCRs. Синтетический транскрипционный фактор был слит с цитоплазматическим хвостом GPCR, сцепленный с помощью сайта расщепления TEV. Т.о., когда искусственно созданный GPCR слитый белок активировался с помощью своего эндогенного лиганда, то он рекрутировал β-arrestin-TEV protease партнера, который отщеплялся и высвобождал домен транскрипционного фактора от GPCR, так что он мог вступать в ядро и активировать гены мишени (Fig. 3ab). Эта система была использована успешно для связи новых транскрипционных репортеров с активацией широкого круга GPCRs. Реакция была высоко специфичной благодаря специфичности TEV расщепления. В принципе эта стратегия может быть использована для связи любого эндогенного GPCR-обеспечиваемого сигнала с экспрессией желаемых генов мишеней.
Barnea et al. также использовали эту стратегию для связи эндогенной передачи сигналов рецепторной Tyr kinase (RTK) с новым результатом транскрипции30 (Fig. 3ac). Большинство RTKs, будучи стимулированными, активируют свои киназные домены, которые обеспечивают аутофосфорилирование по цитоплазматическим Tyr остаткам, чтобы рекрутировать SH2 домен-содержащие белки. В этом исследовании, TEV protease была слита с рекрутируемыми SH2 доменами и синтетический транскрипционный фактор был слит с цитоплазматическим хвостом RTK посредством сайта расщепления TEV protease. Итак, активация RTK приводила к рекрутированию слитого SH2 domain-TEV, высвобождению с RTK-ассоциированного транскрипционного фактора и к преобразованию генной транскрипции. Удивительно, что эта простая модулярная стратегия может быть приложима к нескольким классам рецепторов, поскольку они рекрутируют специфический белок партнер в ответ на активацию.
Howard et al. использовали модулярность передачи сигналов RTK, чтобы перенаправить сигнал онкогенного роста на апоптическую реакцию31 (Fig. 3ac). Они создали SH2 адапторный белок, в котором SH2 домен, который распознаёт активированную RTK был слит с death effector доменом из FAS-associated death domain (FADD) белка. Т.о., активация RTK приводила к рекрутированию на мембрану death домена, который индуцировал реакцию клеточной гибели. Возможность связи др. новых выходных продуктов с этими ключевыми событиями рекрутирования пока не была использована.
Receptors that detect novel small-molecule inputs. Выше приведенные стратегии используют рецепторы, которые детектируют эндогенные сигнальные молекулы, а преобразование их ведет к новым реакциям. Однако в большинстве случаев клеточные преобразования могут нуждаться в рецепторах, которые детектируют новые, ортогональные сигналы, для которых нет эндогенных рецепторов, таких как малые молекулы, которые могут обеспечивать внешний контроль над преобразованной системой.
Довольно неплохой успех был достигнут с использованием GPCRs в качестве платформы для преобразованных рецепторов, контролируемых малыми молекулами. Определенные GPCRs, такие как opioid рецепторы, могут быть активированы специфическими малыми молекулярными агонистами в дополнение к их эндогенным лигандам. Conklin, Roth с сротр. создали молекулы, известные как RASSLs (receptors activated solely by synthetic ligands)32-34 (Fig. 3ba). Эти рецепторы мутировали так, что они не могут связывать свои эндогенные лиганды, но активируются с помощью молекулярных агонистов.
GPCRs отличаются по своим конечным результатам, частично из-за того, что индивидуальные рецепторы общаются со специфическими гетеротримерными G белками. Дальнейшие преобразования создают версии RASSLs, которые специфически купированы с каждым из этих различающихся нижестоящих путей, позволяя тем самым малым молекулам контролировать сильно отличающиеся наборы конечных продуктов. Эти RASSLs были успешно использованы в трансгенных мышах - особенно в преобразовании передачи сигналов у полностью жизнеспособных организмов - в основном в качестве диагностических и аналитических инструментов. Применение было разнообразным, учитывая широкое использование GPCRs в совершенно разных тканях. Напр., мыши, несущие вкусовые нейроны, экспрессирующие RASSLs обнаруживали реакции восприятия сладкого (attractive) или горького (aversive) на воду, смешанную с агонистом (spiradoline), в зависимости от того, какого типа нейроны они экспрессируют35. Кроме того, экспрессия RASSLs в клетках сердца делала возможным контроль за скоростью сердцебиений с помощью применения spiradoline36. То, что эти рецепторы работают столь мощно in vivo, указывает на потенциал их использования в более сложных клеточных преобразованиях.
Химически димеризованные формы это др. стратегия для достижения контроля с помощью малых молекул, контролирующих передачу сигналов. Такие стратегии описаны в др. месте37, 38 и не будут обсуждаться здесь.
Receptors that detect user-specified antigens. Было бы идеальным преобразовывать рецепторы, которые могут ощущать ассоциированные с болезнью антигены, такие как белки, строго экспрессируемые в опухолях, или в инфекционных агентах. Если рецепторы могут достигать того же самого разнообразия и избирательности в распознавании как антитела, то широкий круг входящих сигналов мог бы детектироваться и связываться со специфическим ответными реакциями. Chimeric antigen receptors (CARs) - рецепторы, созданные с одиночной цепью антитела в качестве части их механизма детекции - были разработаны как такого типа многоцелевые конструкции (Fig. 3Bb). Эта стратегия исходит из модулярности рецепторов иммунных клеток, таких как рецепры T клеток. Хотя рецепторы T клеток являются сложными мультибелковыми комплексами, поперчного связывания цитоплазматического региона субъединицы CD3ζ цепи достаточно, чтобы индуцировать передачу сигналов T клетками39. Цепь CD3ζ содержит мотивы, которые фосфорилируются в ответ на активацию с помощью Tyr kinases, таких как LCK, чтобы вызывать рекрутирование SH2 домен-содержащих белков, таких как ZAP70 kinase. Слияние цитоплазматического региона CD3ζ цепи с внеклеточной одиночной цепью антитела даёт рецептор, часто обозначаемый как 'T body', которое, если экспрессируется в T клетках, то вызывает целенаправленную гибель клеток, экспрессирующих распознаваемый антиген (предположительно поверхностные антигены поперечно связываются и активируют химерные рецепторы)40, 41. Слияние одиночной цепи антитела с внутриклеточным регионом Fc receptor (? chain) может приводить к подобному типу химерных чувствительных к антигенам рецепторов. Эти исследования подчеркивают модулярность этих рецепторов: сцепление нового внеклеточного элемента распознавания с нижестоящими внутриклеточными сигнальными элементами ведут к новым input-output сенсорам.
Эти первой генерации CARs относительно примитивны и давали смешанные результаты. T клетки, экспрессирующие CARs, направлялись к опухолевым антигенам и обладали умеренной сигнальной способностью по сравнению с эндогенными реакциями T клеточных рецепторов, умерено пролиферировали ex vivo и in vivo и обладали плохой жизнеспособностью после повторных воздействий антигенами18, 19. Улучшение подобного поведения было достигнуто с помощью внедрения дополнительных модулярных доменов во внутриклеточные регионы CARs, включая домены от ко-рецепторных молекул, которые являлись частью нормальной активации T клеточных рецепторов, тем самым воспроизводили более полный активированный внутриклеточный ансамбль42, 43. Клетки, содержащие эти следующего поколения CARs более эффективно контролировали ксенотрансплантант опухоли у мыши и теперь используются в клинических испытаниях18. Более сложно преобразованные CARs могут приводить к дальнейшему улучшению их терапевтической функции.
Сенсоры, которые воспринимают физические сигналы, такие как свет. Это др. увлекательная область исследования, связанная с разработкой генетически кодируемых сенсоров, которые воспринимают свет и трансдуцируют его в специфические биологические ответные реакции (optogenetics). Естественно возникшие фоточувствительные белки у растений, водорослей и бактерий могут быть модифицированы для использования у высших организмов, включая млекопитающих. Эти инструменты чрезвычайно пригодны в качестве пространственно-временных показателей для контроля и анализа сложного клеточного и организменного поведения, особенно когда они экспрессируются с промоторов, специфичных для определенного типа клеток. spatiotemporal dials to control and analyse complex cellular and organismal behaviour, especially when they are expressed from cell-type specific promoters. В перспективе ортогенетические инструменты могут быть использованы для удаленного контроля клеток при терапевтическом их использовании - свет может быть использован для точной активации избирательных клеток у живых пациентов. Тем не менее, остаются крупные технические затруднения, такие как доставка света в организм. Наиболее часто используемые сегодня ортогенетические инструменты - это микробные каналы белков rhodopsin и halorhodopsin, которые активно используются для контроля функции нейронов. По этой теме имеется обзор44, поэтому мы не будем вдаваться в детали.
Недавно появились оптогенетические инструменты, которые распространяются за пределы ионных каналов, позволяя контролировать широкий круг клеточных сигнальных систем. Airan et al. сконструировали набор активируемых светом GPCRs, которые могут общаться как с нижестоящими Gs, так и Gq гетеротримерными G белками45. Получен химерный, чувствительный к свету в зрительной системе GPCR, rhodopsin (bovine), который содержит внутриклеточные петли от Gq- и Gs-сцепленных адренергических рецепторов. Эндогенные молекулы сетчатки являются чувствительными к свету хромофорами. Эти новые инструменты существенно расширяют сигнальный 'словарный запас', который может контролироваться с помощью света, учитывая важность Gq и Gs сигнальных путей в разных типах клеток.
Даже более генерализованная стратегия для светового контроля связана с использованием взаимодействий светом контролируемых белков. Преходящее взаимодействие специфических партнерских белков является основой многих внутриклеточных сигнальных событий (see below), а рецепторы могут быть обойдены так, что свет будет непосредственно контролировать такие внутриклеточные взаимодействия. Levskaya et al. использовали происходящую из растений систему взаимодействий phytochrome - соединение этого фоторецептора с его партнерским PIF доменом может включаться и выключаться специфическими длинами волн света - чтобы рекрутировать специфические блеки на мембрану в виде точного пространственно-временного паттерна46 (Fig. 3bc). В случае guanine nucleotide exchange factors (GEFs), которые контролируют из семейства Rho GTPases, это можно использовать для запуска активации GTPase и нижестоящих цитоскелетных изменений, приводя к формированию под действием света клеточных выпячиваний. Хотя эта техника мощная и потенциально применима ко многим сигнальным взаимодействиям, система phytochrome-PIF нуждается в добавлении проникающих в клетку хромофор, которые не являются эндогенными для клеток млекопитающих. Wu et al. использовали чувствительный к свету LOV (light-oxygen-voltage) домен (обнаруженный у растений, водорослей и бактерий), чтобы конформационно закрывать Rac GTPase светом контролируемым способом47. Этот flavin-связывающий домен представляет собой др. потенциально характерный конформационный элемент светового контроля, который может быть использован для контроля разных сигнальных белков.
Engineering signal processing systems В конечном итоге клетки решают, какие программы ответов исполнять, исходя из сетей внутриклеточной передачи сигналов, которые получают и перерабатывают сигналы от сенсорных молекул (see above). Недавние работы по предобразованию клеток стали концентрироваться на понимании того, как эти сети функционируют, чтобы принять решение и как они могут быть преобразованы.
Modular logic of signal processing. Внутриклеточные сигнальные белки высоко модулярные (see above). Большинство модулей относится к одному из двух классов (Fig. 4a). Первый класс это ферментативные домены, такие как киназы и фосфатазы, которые катализируют пост-трансляционные модификации или конформационные изменения, с помощью которых сохраняется информация. В большинстве случаев эти каталитические домены идут в паре: 'пишущие' энзимы (такие как киназы), вызывающие модификацию, и 'стирающие' энзимы (такие как фосфатазы) удаляющие модификацию. Второй класс содержит регуляторные или взаимодействующие домены, которые модулируют активность каталитических доменов или нацеливают их на специфических партнёров или сайты в клетках. Эти модули могут обеспечивать специфические межбелковые взаимодействия (или конституитивные взаимодействия или взаимодействия, зависящие от пост-трансляционных модификаций, таких как фосфорилирование) или взаимодействия белков с мембранами. Т.о., это преимущественно регуляторные и взаимодействующие домены, которые определяют, когда и где каталитические домены будоу активированы и каким партнерам они передадут информацию5.
Эти отличающиеся классы модулей обнаруживаются в разных комбинациях и расположении в сигнальных белках (Fig. 4b). Каталитические домены, слитые доменами мишенями могли бы рекрутироваться на специфические комплексы или места мембран, где они смогли бы модифицировать специфические мишени. Часто такие каталитические домены обладают присущей им высокой константой Michaelis (Km) и поэтому нуждаются в наведении с помощью дополнительных взаимодействующих доменов для эффективного катализа. Иногда эти наводящие взаимодействия регулируются; напр., когда взаимодействие зависит от пост-трансляционой модификации, такой как нацеливание SH2 доменовых белков на аутофосфорилируемые Tyr сайты активированных RTKs. Белки с двумя взаимодействующими доменами могут действовать как адапторы, которые трансформируют одно взаимодействие в др., приводя к увеличению гибкости ответных реакций, зависимых от адапторных белков, которые экспрессируются в определенных типах клеток. Большинство белков с взаимодействующими доменами экспрессируются в определенных типах клеток. Многие белки с взаимодействующими доменами могут также функционировать как каркасные белки, которые организуют множественные белки на пути в комплекс. Эти взаимодействия могут быть конституитивными или заранее сформированными или индуцируются с помощью факторов. таких как фосфорилирование или конформационное изменение, которые экспозируют места взаимодействия. Т.о., каркасные белки могут , в принципе, предопределять сцепление в сеть сигнальных белков и контроль когда или где будет происходить передача сигналов22, 26.
Вторая важна роль для взаимодействующих и регуляторных доменов - это непосредственный контроль активности каталитических доменов. Во многих случаях взаимодействующие домены участвуют во внутримолекулярных аутоингибирующих взаимодействиях, которые стерически закрывают каталитический домен или конформационно искажать его - тип регуляции, обозначаемый как модулярная аллостерия (modular allostery)48. Соединение конкурирующих межмолекулярных лигандов с взаимодействующими доменами вызывает каталитическую активность белков. Часто множественные взаимодействующие домены участвуют в аутоингибировании каталитического домена кооперативным или иерархическим способом49, 50. Эти белки могут действовать как сложные мульти-импульсные переключатели, которые нуждаются в специфической комбинации входящих сигналов для собственно активации. Кроме того, поскольку внешние лиганды также управляют локализацией, то такие белки переключатели непосредственно связывают наведение с аллостерической активацией.
Engineering new protein switches. Lim с сотр. исследовали, может ли модулярная аллостерическая логика многих естественных сигнальных белков эукариот использоваться для создания новых сигнальных переключателей с помощью рекомбинации доменов51, 52 (Fig. 5a). В самом деле, каталитические домены актин регулирующего neural Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP) и GEFs из Rho семейства могут быть сцеплены с новыми аутоингибирующими доменами, давая белки с активностями, которые запускаются новыми лигандами51, 52. Внутримолекулярное сцепление любого из этих каталитических доменов с доменом PDZ приведет к тому, что PDZ лиганд пептид будет вызывать переключение, которое будет активироваться с помощью конкурентного PDZ пептида. Сходным образом многие взаимодействующие домены могут быть использованы для вызывания комбинаторного переключения, которое обладает AND селекторным управлением (gate control). В зависимости от точности конфигурации доменов и внутримолекулярных взаимодействий, типы регуляции могут отличаться в ответ на разные конкурирующие внешние лиганды - один лиганд может активировать белок, др. может репрессировать его. Эти типы разных взаимоотношений между регуляторными доменами напоминают разные поведения, наблюдаемые в природных сигнальных белках, подтверждая мнение, что такого типа архитектура переключения облегчает эволюцию разных комбинаторных регуляторных переключений50. Dueber et al. также показали, что синтетические аутоингибирующие переключения, использующие мультивалентные взаимодействия того же типа, ведут к переключению, активации поведения, которое может тонко регулироваться кооперативно, от линейной до digital-like ответной реакции53.
Scaffold proteins as molecular circuit boards. Внутриклеточные сигнальные circuits могут также непосредственно контролироваться с помощью запуска регуляторных взаимодействий. Напр., harnessing регуляторные взаимодействия, чтобы преобразовать пути соединений. Так, каталитический домен киназы семейства Src, haemopoietic cell kinase (HCK), которая обычно регулируется с помощью SH2 и SH3 доменов, может быть слит с доменом PDZ и управляться in vivo, чтобы специфически фосфорлировать субстраты с мотивом лиганда PDZ54.
Каркасные белки могут также использоваться, чтобы генерировать новый путь input-output взаимоотношений (Fig. 5b). У дрожжей имеются множественные функционально отличные mitogen-activated protein kinase (MAPK) пути, которые регулируют ответные реакции на феромоны спаривания и осмотические стрессы55, 56. Эти пути обладают общими киназными компонентами, но остаются специфическими, поскольку каждый путь организуется разными каркасными белками57-59. Химерный каркасный белок, который организует выбор членов путей спаривания и осмотического стресса, даёт не естественный путь, в котором феромоны спаривания специфически индуцируют ответную программу в виде осмотического стресса in vivo60. Сходным образом ковалентные слияния, которые подобно каркасам форсируют взаимодействие между двумя сигнальными белками, могут форсировать подавление передачи сигнала одиночного пути61.
Недавно было показано, что каркасные белки не только обеспечивают пути линейных input-output взаимоотношений, но и координируют потребность в модулирующих факторах, которые обеспечивают реакцию, зависимую от дозы и динамику пути ответной реакции62, 63. Воодушевленные этими природными примерами, Bashor et al. показали, что дрожжевой mating MAPK каркас, Ste5, может быть использован как молекулярная монтажная схема для придачи иной гибкой формы количественных характеристик поведения реакции спаривания64 (Fig. 5b). Присоединение дополнительного синтетического сайта взаимодействия к Ste5 каркасу (используя гетеродимерную пару Leu застежки) облегчает рекрутирование новых модулирующих факторов, таких как MAPK phosphatase, которая супрессирует путь ответной реакции. Однако, если экспрессия и рекрутирование phosphatase сцеплены с путем выхода конечного продукта, то генерируется петля обратной связи, которая ведет к адаптации (к преходящей ответной реакции, сопровождаемой автоматическим возвращением к более низким уровням конечного результата), это является ключевым поведением во многих биологических сенсорных системах. Путем сцепления позитивных и негативных путей модуляторов в разных путях, этот небольшой набор инструментов из элементов контроля каркасов, может быть использован для создания очень отличающихся дозовых ответных реакций и динамического поведения, включая высоко кооперативное переключение, ускорение реакций и генерацию пульсовых ответов. Эти исследования показали, как организующие центры, такие как каркасы, являются ценными платформами для процессинга и пластической обработки внутриклеточной передачи сигналов или с помощью эволюции или искусственного создания.
Engineering spatial self-organization. Одним из наиболее слабо понятых аспектов передачи сигналов клетками является вопрос, как circuits образуются из способных к диффузии молекул, придающих точную пространственную организацию клеткам, такую как направленная поляризация и миграция. Такого типа само-организация является типом контролирующих схем (circuitry), которым нет хороших соответствий в электоронике или сконструированных аналогах и этим биология может инструктировать искусственное конструирование.
Принципы конструирования были использованы для понимания механизма поляризации у почкующихся дрожжей, Saccharomyces cerevisiae (Fig. 6). Поляризация контролируется с помощью GTPase Cdc42, которая в конечном итоге располагается в одном месте материнской клетки, приводя к образованию одиночной почки, которая вырастает в дочернюю клетку65. Удивительно, что этот процесс ведет к образованию одиночной почки с почти с 100% реализацией. Позитивный circuit обратной связи, использующий Cdc42, важен для поляризации: активный Cdc42 рекрутирует на мембрану цитоплазматический GEF белок bud emergence protein 1 (Bem1), который активирует и локализует дополнительные (Ref. 66). Эта петля обратной связи ведёт к образованию фокусов Cdc42, а быстрая диффузия и перераспределение Bem1 между конкурирующими фокусами для возникновения доминанты, ведет к образованию единственного места почкования (Fig. 6a). Анализировали эффект торможения диффузии и перераспределения Bem1 за счёт сцепления его с трансмембранным мотивом67. Закрепленный на мембране Bem1 устранял летальность Bem1 нокаута, но не мог подвергаться диффузии в цитоплазме. Вместо этого он высвобождался в плазматической мембране в пузырьки с помощью актиновых кабелей (также координируемых с помощью Cdc42 фокусов) и удаляются из мембранных фокусов с помощью эндоцитоза поэтому перераспределяются медленно. Тяжелые дефекты в singularity, такие как сохранение многих конкурирующих Cdc42 фокусов, были обнаружены , а частота клеток с множественными почками увеличивалась ~5% (Fig. 6b). Исследования, такие как эти, помогают выявлять потребности в точно контролируемой пространственной само-организации и подтверждают, что мы можем понять, как преобразовывать сигнальные circuits, чтобы продуцировать желаемые пространственные результаты с важными терапевтическими характеристиками, такими как регенеративная медицина, которая нуждается в специфической клеточной морфологии и ориентации. Making signal engineering predictable Выше приведенные исследования показывают, что сигнальные системы высоко модулярны пластичны, а рекомбинантные модули, в особенности каталитических доменов с новыми регуляторными доменами могут приводить к разным ответным реакциям, но могут ли они созданы способом, который позволил бы нам предсказать какое поведение будет возникать и насколько успешен будет каждый созданный circuit.
Challenge of unanticipated crosstalk. Один из основных вопросов с искусственно созданными клеточными передачами сигналов это, какие естественные компоненты - инструментальный набор пригодных доменов - может быть использован повторно и может приводить в результате к непредвиденным взаимным влияниям. Могут ли искусственно вызванные взаимодействия приводить к специфическому фосфорилированию желаемых белков или могут ли домены использовать также перекрестное взаимодействие с др. мишенями, конкурентно оттитровывая важные физиологические взаимодействия и приводя к непредвиденным эффектам или неспособности созданных circuit? Часто природные части не обладают абсолютной специфичностью и эволюция скорее всего использует сложные сети перекрестной реактивности, чтобы давать в результате важную скоординированную регуляцию. Хотя такого типа сложные нейральные сете-образные системы могут предоставлять преимущества клеткам, это является проклятием для предикативного конструирования.
Envisioning the signalling tool kit of the future. Одним из решений этой проблемы является сборка набора инструментов из частей, которые специфически оптимизированы для конструирования. Этот вопрос важен для любого типа сигнальных частей, но фокус здесь в том, как собрать пригодный набор инструментов из белок-взаимодействующих частей (Fig. 7).
Хотя природа повторно использует семейства частей, таких как взаимодействующие домены определенного типа, недавние исследования показали, что в некоторых случаях члены семейств содержат неиспользуемые для распознавания сайты в таких доменах. Это может быть использовано для конструирования домен-пептидных пар, которые одновременно оптимизируются, чтобы взаимодействовать с их корректным партнером при этому избегая перекрёстного взаимодействия с др. членами семейства68, 69. Фактически, были сконструированы PDZ домен-лиганд пара и пары гетеродимеризующихся Leu застёжек, которые оптимизированы избегать перекрёстных реакций с природными доменами того же самого типа70, 71. Избирательность и предсказуемость существующих взаимодействий доменов может быть также улучшена путём конструирования комбинированных взаимодействий. Безусловно, мультидоменовая кооперация является природным механизмом увеличения специфичности, но новым затруднением при этом является конструирование соединения из двух доменов самохватающих (clamshell) взаимодействий. Koide et al. взали PDZ домен и слили его с доменом fibronectin72. Используя фаговую демонстрацию они выбрали варианты этого тандемного домена, которые связывают специфические пептиды так, что он оказывается внутри сэндвича между двумя доменами. Драматически увеличивается область поверхности распознавания, это ведет к взаимодействиям со значительно более высокой специфичностью и сродством. Др. решением вопроса специфичности, который имеет место в природе, является дифференциальная компартментализация. Если наводящий на цель мотив может быть использован для локализации партнерских белков на специфических органеллах или местах в клетке, то взаимодействующие мотивы скорее всего функционируют более специфическим способом, особенно если мало или отсутствуют конкурирующие взаимодействия такого типа в этом месте или органелле.
Альтернативным подходом достижения реальной специфичности является импорт доменов , которые не существуют у хозяина, из др. организмов и их перестройка. Напр., PDZ домены могут быть импортированы в дрожжей (которые лишены большинства таких доменов), при этом возможность удачных перекрёстно реагирующих партнёров не может быть исключена60. Напр., система передачи ортогональных сигналов, которая была успешно импортирована на нового хозяина это бактериальная Cre-Lox recombinase система, которая действительно используется для конструирования сложных хромосомных перестроек у сложных организмов, включая мышей73.
N/j/? вообразим набор инструментов будущего, когда можно будет создать набор из примерно 10 белковых взаимодействующих пар, которые оптимизированы и ортогональны для желаемых организмов (напр., Eschericha coli, S.cerevisiae и млекопитающие). Важно также для этих взаимодействий быть тонко настраевыми, так что серия лигандов для каждого взаимодействующего домена, которые отличаются по сродству на несколько порядков величин, будет идеалом. Это д. позволить планомерное исследование того, как сродство рекрутирования меняет систему поведения.
Combinatorial design versus prediction. Др. отличающийся, но всё ещё комплементарный подход к предсказуемому конструированию клеточной передачи сигналов, это использование комбинаторной видоизменяемости. В природной эволюции рекомбинация сигнальных модулей, чтобы генерировать новые функции, по-видимому, не используется или происходит, но относительно редко, а естественный отбор выявляет события перестройки, которые ведут к преимуществам для выживания. Т.о, очень плодотворный подход, учитывая отсутствие предсказуемости, в клеточном конструировании, может заключаться в конструировании комбинаторных библиотек синтетических circuits и в выборе для желаемой функции27, 74. Более того, этот подход д. комбинироваться с полу-предсказуемым замыслом, при этом общая архитектура конструируемых circuits д. быть соответствующей, но д. использоваться комбинаторные методы для поиска широкого ранга пространственных параметров (использование вариантов каждого модуля из библиотеки). Фокусирование на комбинаторных выборах м. также предоставить пригодную стратегию на первый случай в области синтетической биологии, поскольку она может помочь нам более быстро понять суть принципов построения.
Outlook The goal of understanding how cells communicate and make decisions remains very attractive, especially because understanding the molecular language in a cell may allow us to communicate with cells and instruct them to carry out new programmed functions. Our ability to rewire cell signalling could provide many powerful applications, such as programming therapeutic cells to detect a selective set of disease-related signalling pathways and to locally respond in a precisely tailored way.
Although evolution has achieved this kind of innovation and precise engineering of cellular function, we are only beginning to understand how to execute this kind of goal. We have a good foundational understanding of the logic of cell signalling machinery and the sources of functional plasticity. In addition, big first steps have been made in engineering new receptor (sensor) systems, as well as new or modified intracellular signal processing circuits. Despite these tools, few efforts have been made to link these types of components in new ways to yield larger integrated circuits capable of highly refined, precision responses. Such efforts are underway. For example, the Cell Propulsion Laboratory is a National Institutes of Health nanomedicine centre that is attempting to take the relatively simple anti-tumour immune cells engineered with synthetic CARs and improve their suite of responses, such as their ex vivo expansion, in vivo survival, anti-tumour cytotoxicity and ability to disrupt a hospitable tumour microenvironment. It will be exciting to see how these efforts unfold, and how the challenges will improve the sophistication and reliability of cellular engineering.
|