Посещений: 
ОРГАНЫ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА
Развитие: Эпителиально-Мезенхимные Взаимодействия
|
|
Molecular analysis of endoderm regionalizationSadao Yasugi  and Takeo Mizuno Develop. Growth Differ. (2008), V. 50, S79-S96 Article
|
We have engaged in a number of studies in our laboratory that have focused on the molecular mechanisms underlying gut formation, with particular attention being paid to the establishment of regional differences found in the entire gut and within each digestive organ. We have found from our analyses that the presumptive fate of the endoderm in the embryos of vertebrates is determined quite early during development, but the realization of this fate often requires molecular cues from the neighboring tissues such as the lateral plate mesoderm and the mesenchyme derived from it. The mesenchyme seems often to exert instructive or supportive induction effects and, in some cases, a completely inhibitory role during the differentiation of the endodermal epithelium. In addition, many reports on the formation of the stomach, intestine, liver and salivary gland in vertebrates, and of Drosophila gut, all indicate that the morphogenesis and cytodifferentiation of these organs are regulated by the regulated expression of genes encoding growth factors and transcription factors. We have further shown that the epithelium can regulate the differentiation of the mesenchyme into the connective tissue and the smooth muscle layers, thus demonstrating the occurrence of literally interactive processes in the development of the digestive organs.
Рис.1. | The development of the digestive organs in vertebrates. (a) General structure of the embryonic digestive organs of vertebrates. (b) Development of the digestive organs in chick from the simple digestive tract of a 3 day old embryo to the differentiated organs of a 12 day old embryo. On day 12, the organs are depicted in cross-section.
Рис.2. | Expression patterns of genes and some proteins in the epithelium of the developing chick proventriculus from days 5–9 of development. The black area represents the parts of the epithelium in which each of these genes is expressed.
Рис.3. | Summary of the molecular events leading to the functional differentiation of the proventricular epithelium. Upper panel, day 6 of development; lower panel, day 9 of development. +, expression of gene. The arrows after the gene names indicate upregulation or downregulation of gene expression. pr. luminal ep., presumptive luminal epithelium; pr. gland ep., presumptive gland epithelium.
Рис.4. | Genetic pathways involved in the determination of the endoderm and hindgut during Drosophila embryogenesis (modified from Okumura et al. 2005). On the top is the gradient for Tor and Ras which determines the anterior–posterior axis of the egg. tailless (tll) mediates activity of Tor and Ras to byn.
|
Kimiko Fukuda, Yutaka Kikuchi yutaka@cc.nagoya-u.ac.jp
(2005)
Endoderm development in vertebrates: fate mapping, induction and
regional specification
Development, Growth & Differentiation 47 (6), 343–355.
doi:10.1111/j.1440-169X.2005.00815.x Article
The formation of the vertebrate body plan begins
with the differentiation of cells into three germ layers: ectoderm,
mesoderm and endoderm. Cells in the endoderm give rise to the
epithelial lining of the digestive tract, associated glands and
respiratory system. One of the fundamental problems in developmental
biology is to elucidate how these three primary germ layers are
established from the homologous population of cells in the early
blastomere. To address this question, ectoderm and mesoderm development
have been extensively analyzed, but study of endoderm development has
only begun relatively recently. In this review, we focus on the
‘where’, ‘when’ and ‘how’ of
endoderm development in four vertebrate model organisms: the zebrafish,
Xenopus, chick and mouse. We discuss the classical fate mapping
of the endoderm and the more recent progress in characterizing its
induction, segregation and regional specification.
Рис.1. | Comparison of endoderm fate maps of vertebrates. Presumptive endoderm cells develop from common progenitor cells of both the mesoderm and endoderm in zebrafish, chicken and mouse embryos. In Xenopus embryos, some endodermal cells arise from marginal cells which give rise to both endoderm and mesoderm. Endoderm cells are located very close to the node or blastopore (*) at the onset of gastrulation and invaginate into the deep layer.
Рис.2. | Molecular pathway leading to endoderm in the zebrafish and Xenopus. In the zebrafish, all hierarchical cascades are based on genetic studies. In contrast, most of the regulatory pathways in Xenopus have been elucidated using animal cap assays and knockdown experiments. (1) Maternal factor (X) upstream of Nodal (Cyc, Sqt) is unknown. (2) squint is a maternal transcript. (3) Tar; Taram-a, type-I TGF? receptor (Renucci et al. 1996) (4) Xnrs; Xnr1, Xnr2, Xnr4, Xnr5 and Xnr6 (5) Mix-type homeobox proteins; Mixer, Mix.1, Mix.2, Bix.1, Bix.2 (Milk), Bix.3 and Bix.4.
Рис.3. | Cell movement of the endoderm in Xenopus and chicken embryo. (a–c) Xenopus embryo. (a) lateral view of stage 10+. (b) ventral view of stage 10+ and c; medial section of stage 18. (d–g) Ventral view of the chicken embryo. (d) stage 4, (e) stage 5, (f) stage 7, and (g) stage 11.
| |
В обзоре детально описываются исследования по регионализации энтодермы, проведенными основными членами лаб., руководимой авторами с 1970, цитируя и остальные публикации.
У позвоночных энтодермальные и мезодермальные клетки происходят из клеток эпибласта за счет проникновения через Гензеновский узелок у птиц или гомологичные ему структуры у др. позвоночных и эти клетки в конечном счете мигрируют в соотв. им местоположение. Энтодермальные клетки вскоре создают эпителиальные структуры, тогда как некоторые мезодермальные клетки формируют спланхническую мезодерму, которые позднее становится мезенхимными клетками желудочно-кишечного тракта. Эпителий формирует тубулярную структуру, наз. пищеварительным трактом или кишкой, которая вскоре подразделяется на переднюю кишку, среднюю и заднюю кишку спереди назад и окружается мезенхимными клетками. Глотка, пищевод и желудок происходят из передней кишки, основная часть тонкого кишечника и желточный мешок из средней кишки и толстый кишечник и аллантоис из задней кишки. Кроме того, многие дополнительные железы, такие как слюнные железы, печень, поджелудочная железа и респираторные органы, такие как трахеи и легкие формируются как проецирующиеся структуры из основного тракта. У птиц, эмбрионы которых являются основной системой позвоночных, использованной нами в работе, желудок состоит из двух частей, proventriculus (железистый желудок) и gizzard (мышечный желудок). Первый продуцирует и секретирует проформу (pepsinogen) пищеварительного фермента pepsin, тогда как последний мышечный, развивается, чтобы выполнять потребности механического переваривания (Fig. 1). состоит из недифференцированной энтодермы и мезенхимы. В частности, исследования нашей лаб. сконцентрированы на путях, которые детерминируют региональную специфичность в пищеварительном тракте и в каждом из пищеварительных органов. Наши более ранние исследования были сконцентрированы в основном на птичьих эмбрионах и методологиях, влючая тканевые рекомбинации и трансплантации. Мы также использовали морфологические и биохимические маркеры в качестве критериев клеточной дифференцировки. В последних проектах мы расширили наши исследования на животных до млекопитающих, амфибий и Drosophila. Дополнительно увеличили количества молекулярных маркеров дифференцировки и молекулярный анализ по генной трансфекции.
A. Regionalization of the early endoderm
A. 1 Self-differentiation potency of the endoderm
Первой ступенью в изучении органогенеза является анализ процесса образования органов, включая детерминацию времени и расположения, когда презумптивные клетки предположительно позднее вносят вклад в эти органы. Эмбриональные пищеварительные органы позвоночных состоят из энтодермального эпителия и мезодермальной мезенхимы (Fig. 1).
Общепринято, что изолированный энтодермальный эпителий неспособен развиваться, если культивируется один без мезенхимы. Однако мы установили, что энтодермальные части эмбрионов кур могут не только выживать, но и могут дифференцироваться до определенной степени, если покрыты фрагментом вителлиновой мембраны и культивируются in vitro в соответствии с методом Wolff (Wolff 1961). Т.к. мезенхимные клетки не присутствуют в этих эксплантах, то мы обозначили этот феномен как потенциал само-дифференцировки. С помощью использования метода Wolff к более молодым эмбрионам мы также оказались способны установить время и локализацию первого появления этого потенциала само-дифференцировки (Mizuno & Sumiya 1974; Sumiya & Mizuno 1974). Было показано ранее, что эпителий пищеводного типа, эпителий желудочного типа секретируют слизь, а эпителий типа тонкого кишечника является простым столбчатым и дифференцируется из энтодермы со стадии Hamburger and Hamilton (HH) 4 (Hamburger & Hamilton 1951). Далее было установлено, что тироидного типа эпителий с фолликулярной структурой и colloid дифференцируется в передней области на HH стадии 6 и что эпителий типа толстого кишечника дифференцируется из задней области на HH стадии 8 (Sumiya & Mizuno 1976; Sumiya 1976a,b; Mizuno & Sumiya 1977).
Исследования с использованием трансмиссионной электронной микроскопии показали, что нижний слой, выделенный из бластодермы позднее стадии HH3 обладает потенциалом дифференцироваться в эпителий типа тонкого кишечника с хорошо развитыми микроворсинками, которые часто формируют типичную исчерченную кайму (Mizuno & Ishizuya 1982; Ishizuya-Oka 1983). С помощью иммунохимии было продемонстрировано, что glucagon впервые появляется в дорсальной панкреатической энтодерме эмбрионов кур на HH ст. 16 во время нормального развития, но потенциал само-дифференцировки изолированной дорсальной энтодермы, который облегчает экспрессию glucagon, появляется на HH стадии 10-11 на уровне 7-15 сомитов (Sumiya & Mizuno 1987). Эти результаты указывают на то, что большая часть области энтодермы приобретает способность само-дифференцироваться на довольно ранних стадиях развития.
Дальнейшие исследования регионализации и событий генной экспрессии в ранней энтодерме описываются в след. разделах. Создание систем первичных культур эпителиальных клеток кишечника млекопитающих описаны в разделе C.4.
A.2 Movement of endodermal cells and regionalization of the early endoderm
Картирование судеб пищеварительных органов у птиц активно исследовалось в успешных работах Vakaet (1970) и Rosenquist (1971), но результат не совсем удовлетворительны из-за ограничений и отсутствия аккуратности используемой техники. В нашей лаб. мы использовали более утонченную технику мечения клеток, чтобы получить более точную карту судеб эмбриональной энтодермы кур на HH стадиях 2-5. Наши результаты отличаются от предыдущих исследований, т.к. мы продемонстрировали, что энтодермальные клетки, предназначенные вступить в вентральную часть передней кишки не проникают непосредственно через узелог Гензена, а мигрируют латерально в средний (endo-mesodermal) слой прежде, чем вступить в дефинитивную энтодерму (Kimura et al. 2006).
У эмбрионов кур пищеварительная трубка начинает формироваться приблизительно на 1.5 день (HH стадия 10-11). На той же самой стадии исследовали онтогенетические судьбы частей энтодермы (Matsushita 1996a) и мезодермы (Matsushita 1995) с помощью мечения небольших групп клеток каждого из слоёв. Интересно, что карты судеб энтодермы и мезодермы не совпадают в это время, т.к. презумптивная область энтодермы каждого пищеварительного органа всегда располагается более кпереди, чем мезодермы. Кроме того, отсутствует непосредственный контакт между энтодермальными и мезодермальными клетками, это указывает на то, что презумптивная судьба энтодермы может детерминироваться за счет своих собственных внутренних механизмов.
Начиная с этой стадии развития и далее мы могли обнаруживать регион-специфическую экспрессию некоторых генов. В передней кишке энтодермальные клетки экспрессируют cSox2 (Ishii etal. 1998), тогда как энтодерма позади переднего кишечного портала экспрессирует CdxA. Как было показано выше энтодерма на этой стадии приобретает некоторый потенциал само-дифференцировки, указывая тем самым, что она уже регионализована и , следовательно, по-видимому, по-видимому, детерминирована (Matsushita et al. 2002). Мы также показали в экспериментах, в которых энтодерма презумптивной передней кишки трансплантировалась в область презумптивной задней кишки или vice versa,что энтодерма перзумптивной передней кишки детерминирована экспрессировать cSox2 во время HH стадий 8-10, и что энтодерма презумптивной задней кишки детерминирована экспрессировать CdxA во время HH стадий 5-8 (Kimura etal. 2007).
A.3 Self-differentiation potency of the endoderm to develop a hepatic epithelium and the distribution of prehepatic cells
У эмбрионов кур первая энтодермальная эвагинация печеночного зачатка может обнаруживаться на краю переднего кишечного портала на ст. 19-сомитов (HH stage 13) (Fukuda 1976). Однако вентральная часть энтодермы кпереди от переднего кишечного портала приобретает потенцию само-дифференцировки, чтобы сформировать печеночный эпителий на ст. 7 сомитов (HH ст. 9) (Sumiya & Mizuno 1976; Sumiya 1976b; Mizuno & Sumiya 1977).
Le Douarin (1964) показал, что две стадии индукции происходят во время дифференцировки гепатоцитов. Первая из них обязательна для дифференцировки печеночной энтодермы и происходит под влиянием кардиальной мезодермы на ст. 5 сомитов (HH ст. 8). Это намного раньше, чем инициация печеночной эвагинации. Второй путь индукции из печеночного тяжа происходит под влиянием печеночной мезенхимы. Энтодерма, которая может отвечать на индуктивное влияние кардиальной мезенхимы и дифференцироваться в печеночную энтодерму, была известна как предпеченочная энтодерма.
В исследованиях нашей лаб. мы продемонстрировали, что когда передние энтодермальные фрагменты (prehepatic endoderm) более молодых эмбрионов (HH ст. 4-7) культивировали совместно с кардиальной мезодермой, полученной из презумптивной кардиальной области от 1-1.5 дн. эмбрионов, то печеночные эпителиальные клетки с накоплениями тяжелого гликогена в своей цитоплазме дифференцировались (Fukuda 1979). Мы установили, что некардиальная мезенхима неспособна индуцировать печеночный эпителий из тех же самых энтодермальных фрагментов. Далее мы установили, что когда энтодерма из области opaca, задней части эмбрионов кур, и аллантоиса культивируются с кардиальной мезодермой, то они неспособны развиваться в печеночный эпителий (Fukuda-Taira 1981a).
Мы также исследовали распределение предпеченочных энтодермальных клеток в комбинации с кардиальной мезодермой. Наши данные выявили, что они существуют во всей области бластодермы на ст. предполоски (prestreak) (HH stage 1), по-видимому, в эпибласте и затем они инвагинируют через переднюю часть первичной полоски между стадиями короткой и дефинитивной полоски (HH stage 2-4) и вступают в дефинитивный эндобласт. Со ст. 1 сомита (HH stage 7) и далее они располагаются в энтодерме, впереди по отношению к уровню третьего сомита (Fukuda-Taira 1981b).
B. Roles of the mesenchyme in the regionalization of the endoderm
B. 1 Trial studies of mesenchymal activity using embryonic membranes
Эктодерма хориона и амниона эмбрионов кур может быть трансформирована в типичные производные кожи, если они культивируются в комбинации с tarsometatarsal или дорсальным дермисом (Kato & Hayashi 1963; Mizuno 1972; Mizuno et al. 1990). Это указывает на то, что эктодерма из эмбриональных мембран может быть нейтральной и может отвечать на индуктивные влияния мезенхим. Мы также исследовали, может ли мезенхима кишки оказывать свое влияние на энтодерму аллантоиса и энтодерму желточного мешка, а также могут ли эти энтодермы отвечать на мезенхиму кишки.
Когда энтодерма аллантоиса от 3-дн. эмбрионов кур комбинировалась с 5-дн. мезенхимой кишки и культивировалась in vitro, то она развивалась в эпителий, соответствующий комбинируемой мезенхиме. Напр., в комбинации с proventricular мезенхимой энтодерма формировала структуры желез, которые напоминали таковые из эмбрионального преджелудка. Кроме того, в комбинации с мезенхимой тонкого кишечника энтодерма превращалась в простой столбчатый эпителий, сходный с таковым из нормального эмбрионального тонкого кишечника. Однако во всех протестированных комбинациях клетки goblet появлялись в эпителии, когда экспланты культивировались более 10 дней (Mizuno & Yasugi 1973; Yasugi & Mizuno 1974). Тот же самый результат был получен, когда энтодерма аллантоиса от эмбрионов перепела трансплантировалась на спланхноплевру эмбрионов кур разных уровней (Gumpel-Pinot et al. 1978). Когда же железы, которые развивались в энтодерме аллантоиса, комбинировались и культивировались с мезенхимой преджелудка, то они синтезировали pepsinogen, маркерный белок клеток желез провентрикулюса.
То, что энтодерма желточного мешка 3-5-дн. эмбрионов перепела обладает потенциалом само-дифференцировки, чтобы сформировать эпителий желточного мешка, было продемонстрировано с использованием культур in vitro изолированной энтодермы (Masui 1981). Однако, когда энтодерма культивировалась в ассоциации с мезенхимой кишечника, то она развивалась в специфичный для мезенхимы эпителий, хотя эти энтодермальные клетки часто экспрессировали специфические маркеры дифференцировки эпителия кишечного типа (Masui 1981; Mizuno & Masui 1982).
Итак, эти результаты указывают на то, что мезенхима кишечника может осуществлять свои индуктивные влияния на энтодермальные клетки аллантоиса и желточного мешка, следовательно, эти энтодермы не являются нейтральными в терминах своего потенциала дифференцировки и что большинство клеток детерминировано к формированию кишечных регионов.
B.2 Roles of the proventricular mesenchyme in gland formation and pepsinogen expression
Энтодерма аллантоиса и желточного мешка формирует железисто-образные структуры, когда они рекомбинируются и культивируются с мезенхимой преджелудка. В предудущем сообщении нами было продемонстрировано, что эпителий gizzard также может формировать железы под влиянием мезенхимы преджелудка (Takigu-chi etal. 1986; see also below). Поэтому мы предположили, что мезенхима преджелудка может индуцировать образование желез в энтодерме или ассоциированном с ней эпителии. Возник вопрос, может ли мезенхима также индуцировать функциональную гетеротипическую дифференцировку ткани мишени.
Чтобы решить этот вопрос, мы выбрали pepsinogen в качестве маркера дифференцировки железистой дифференцировки преджелудка. Мы экстрагировали и очищали pepsinogen белок из эмбриональных преджелудков, который мы обозначили как embryonic chick pepsinogen (ECPg). Далее мы генерировали специфические антитела (Yasugi & Mizuno 1981, 1982) , чтобы выявлять белок ECPg и облегчить клонирование гена ECPg (Hayashi et al. 1988a). В преджелудке образование желез начинается на 6-й день, а ECPg мРНК и белок обнаруживаются на 8-9 день инкубации, когда железы всё ещё имели примитивную форму (Yasugi et al. 1987; Hayashi et al. 1988b).
Используя специфические антитела и зонды для ECPg, мы затем исследовали экспрессию этого маркера в культуре эпителиально-мезенхимной комбинации, описанной выше. Наши результаты четко показали, что ECPg никогда не экспрессируется в энтодерме аллантоиса и желточного мешка, даже если они формируют хорошо развитые железистые структуры (Yasugi etal. 1985). Для дальнейшего подтверждения этого энтодерма аллантоиса эмбрионов перепела трансплантировалась в область презумптивного преджелудка эмбрионов кур. Эта экспериментальная система создавала лучшие условия для дифференцировки энтодермы аллантоиса. Однако мы снова обнаружили, что энтодерма аллантоиса не экспрессирует ECPg совсем (Yasugi 1984). Сходным образом эпителий тонкого кишечника от 2.5-дн. эмбрионов никогда не экспрессировал ECPg под воздействием мезенхимы преджелудка (Yasugi etal. 1991). Поэтому мы пришли к выводу, что индуктивные влияния мезенхимы преджелудка не могут обеспечить полную дифференцировку в направлении эпителия преджелудка в энтодерме аллантоиса и тонкого кишечника.
Мы установили, однако, что если эпителий gizzard 6-дн. эмбрионов кур ассоциирован и культивируется с мезенхимой преджелудка, то ECPg экспрессируется спустя несколько дней культивирования на хорион-аллантоисной мембране (Takiguchi etal. 1986; Hayashi etal. 1988b) , а также in vitro (Takiguchi etal. 1988b; Urase & Yasugi 1993; Urase etal. 1996). Эти результаты предоставили нам очень замечательный пример действительной гетеротипической дифференцировки эпителия, который уже приобрел региональные особенности и был детерминирован в направлении орган-специфического эпителия. Было продемонстрировано, что онтогенетическая судьба
Table 1. Expression of ECPg in recombinants of the epithelium and mesenchyme from various parts of the digestive tact and lung of 6 day old chick embryos (% ECPg-expressing recombinants)
| Mesenchyme |
Epithelium |
|
| LU |
ES |
PV |
GZ |
SI |
LI |
|
|
| LU |
0 |
100+ |
100+ |
96+ |
0 |
0 |
| ES |
0 |
13 |
67+ |
10++ |
0 |
0 |
| PV |
0 |
100+ |
100+ |
90+ |
0 |
0 |
| GZ |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| SI |
0 |
17++ |
83++ |
71+ |
0 |
0 |
| LI |
0 |
0 |
40++ |
7++ |
0 |
0 |
|
ES, esophagus; GZ, gizzard; LI, large intestine; LU, lung; PV, proventriculus; SI, small intestine. + Many epithelial cells express ECPg. ++Only a small number of epithelial cells express ECPg.
эпителия иногда детерминируется вод влиянием мезенхимы. Более того, различия между реакцией энтодермы аллантоиса и эпителием gizzard указывают на то, что способность реагировать ткани мишени также важна.
В отношении индуктивного влияния мезенхимы преджелудка, мы также продемонстрировали, что прямой контакт между эпителиальными и мезенхимными клетками необходим (Takiguchi-Hayashi & Yasugi 1990), и что реакционная способность эпителия gizzard наивысшая на 6-й день инкубации (Takiguchi et al. 1988a). Это был важный успех, который облегчил дальнейшие исследования.
B.3 Inclusive studies of ECPg expression in epithelial-mesenchymal recombinants of digestive organs
Исходя из упомянутых выше результатов Yasugi с коллегами предприняли исследования эпителиально-мезенхимных взаимодействий между пищеварительными органами и респираторными органами кур. В этих экспериментах эпителиальные и мезенхимные клетки, взатые из разных частей пищеварительного тракта и легких у 6-дн. эмбрионов кур, рекомбинировали и культивировали in vitro. Экспрессия ECPg оценивалась иммуногистохимически и с помощью анализа гибридизации in situ. Результаты суммированы в Table 1 (Takiguchi etal. 1988b; Urase & Yasugi 1993; Urase etal. 1996).
Эпителий пищевода, преджелудка и gizzard экспрессирует ECPg в присутствии мезенхимы преджелудка, легких и с низкой частотой тонкого кишечника. Это означает, что передний эпителий может экспрессировать ECPg , если он культивируется с мезенхимой преджелудка, легких и тонкого кишечника. Необходимо отметить, однако, что последние две мезенхимы происходят из органов, в которых ECPg не экспрессируется во время нормального развития.
Необходимо также подчеркнуть, что легочная мезенхима обладает неожиданно высокой способностью индуцировать экспрессию ECPg, которая сходна с таковой мезенхимы преджелудка. С др. стороны, легочный эпителий (также как и энтодерма аллантоиса и эпителий тонкого кишечника, как было показано выше) не экспрессирует гена, даже если он ассоциирует с мезенхимой преджелудка. Более того, эпителий, обладающий потенциалом экспрессии ECPg , не экспрессирует этот ген, когда он культивируется с мезенхимой gizzard. Yasugi (1993) поэтому предложил рабочую модель для объяснения этих результатов: эпителий передних частей пищеварительного тракта обладает потенциалом экспрессировать ECPg, но реализация этого зависит от факторов, предоставляемых мезенхимой преджелудка и легких. Мезенхима gizzard оказывает сильное ингибирующее влияние на экспрессию ECPg. Как результат взаимодействие между потенциалом экспрессии ECPg в эпителии и индуцирующими факторами из мезенхимы, лишь эпителий преджелудка экспрессирует ECPg во время нормального хода развития. Эта модель может интерпретировать все полученные результаты, но природа "потенциала" и "мезенхимных факторов" не была установлена.
B.4 Inductive influence of the intestinal mesenchyme on the stomach endoderm
Результаты, описанные в предыдущих разделах, демонстрируют, что эпителий нескольких пищеварительных органов эмбрионов кур может экспрессировать ECPg, маркер эпителия преджелудка, под воздействием мезенхимы преджелудка. Возникает вопрос, действительно ли кишечная мезенхима осуществляет индуктивные влияния на др. эпителии пищеварительных органов. Наши ранние исследования показали, что 5-дн. эпителий преджелудка и gizzard, комбинируемый и культивируемый с 5-дн. мезенхимой тонкого кишечника, дифференцируется в простой столбчатый эпителий типа тонкого кишечника (Yasugi & Mizuno 1978; Matsushita 1996b). Мы также продемонстрировали, что энтодерма 4-дн. желудка дифференцируется в эпителий тонкого кишечника с goblet клетками и с исчерченным краем, экспрессирующим сахарозу, если культивируется в комбинации с 6-дн. мезенхимой двенадцатиперстной кишки (Ishizuya-Oka & Mizuno 1984, 1985, 1992). Т.к. энтодерма желудка от 4-дн. эмбрионов кур уже обладает способностью само-дифференцировки в эпителий желудочного типа (Ishizuya-Oka 1983; see also section A.1), то эти результаты указывают на то, что кишечная мезенхима может индуцировать эпителий желудка, которые приобретает потенциал само-дифференцировки, чтобы дифференцироваться в эпителий кишечника.
B.5 Branching morphogenesis of the salivary gland epithelium
Многие типы железистых структур развиваются в пищеварительных органах позвоночных, такие как образования, сходные с простыми железами в желудке мышей и ткани, сходные со сложными железами в преджелудке кур. Однако лишь немногие исследования были предприняты в отношении факторов, которые детерминируют структуры этих желез.
Существуют два типа слюнных желез у эмбрионов перепела: удлиненного типа (передняя submaxillary железа) и ветвящегося типа (передняя язычная железа) (Nogawa 1978, 1981). Тип морфогенеза, по которому развивается эпителий слюнных желез, удлиняясь или ветвясь, зависит от используемой мезенхимы для рекомбинации (Nogawa & Mizuno 1981).
Эксперименты с трансфильтрами показали, что эпителий слюнных желез мышей ветвится только в присутствии собственной мезенхимы или немногих др. типов мезенхимы, указывая тем самым, что диффундирующие субстанции от мезенхимы необходимы для ветвления (Grobstein 1953; Takahashi & Nogawa 1991). Чтобы выяснить природу мезенхимного влияния на эпителий слюнных желез мышей, мы исследовали условия культивирования, при которых эпителий может нормально ветвиться в отсутствие мезенхимных клеток. Морфогенез ветвления, как было установлено, поддерживается как с помощью не диффундирующих клеточных субстратов, так и диффундирующих ростовых факторов (комбинация субстрата, сходного с базальной мембраной, [Matrigel] и epidermal growth factor [EGF] может замещать мезенхиму). В этом отношении, Matrigel не может быть замещен коллагеновым гелем (Nogawa & Takahashi 1991). Компонентом, необходимым для ветвления в Matrigel является laminin-1 (LN1), и пептидные фрагменты из LN1 (Hosokawa et al. 1999). Диффундирующие ростовые факторы, необходимые для ветвления, были изучены в отсутствие мезенхимы. EGF индуцирует образование долек, тогда как fibroblast growth factor 7 (FGF7) способствует удлинению ножки, а смесь EGF и FGF7 продуцирует промежуточную морфологию, которая напоминает эпителий нормальных слюнных желез (Morita & Nogawa 1999). Он также необходим для lysophosphatidic acid (LPA) в сыворотке, чтобы действовать в кооперации с EGF. LPA рецепторные гены экспрессируются в клетках подчелюстного эпителия (Noguchi et al. 2006).
C. Molecular mechanisms of digestive organ development
Чтобы выяснить природу эпителиально-мезенхимных взаимодействий, описанных в разделе B.3, мы анализировали паттерны экспрессии многих генов, которые активируются в эмбриональных пищеварительных органах кур (в основном в преджелудке) во время развития. Мы также провели функциональный анализ некоторых генов, которые, как полагали, имеют отношение к этим взаимодействиям.
C. 1 Expression of genes in the digestive tract epithelium
Причины проверки паттернов экспрессии генов во время развития органов были двоякими: выявить соотв. маркерные гены для каждого органа и просеять гены кандидаты, участвующие в регуляции морфогенеза и цитодифференцировки. В нашей лаб. мы исследовали экспрессиию более 30 генов в эпителии и более 10 в мезенхиме. Результаты этого анализа во время развития преджелудка показаны на Figure 2, в кот. гены сгруппированы в соответствии с их паттерном экспрессии в эпителии приблизительно во время образования желез. Первая группа генов экспрессируется до образования желез (примерно день 5) почти во всём эпителии и их экспрессия продолжается, когда железы сформируются. Среди этих генов foxa2 (первоначально HNF3β), cSox3, cfos и junD. Вторая группа включает гены, которые экспрессируются широко в эпителии до образования желез, но затем их экспрессия затухает. Эти гены могут быть рассмотрены как маркерные гены просветного эпителия. Некоторые из наиболее важных маркерных генов, такие как cSox2, sonic hedgehog (Shh), chick spasmolytic polypeptide (cSP) и PPARγ принадлежат этой группе, среди них cSP был клонирован нами и использован в качестве очень специфического маркера просветного эпителия (Tabata & Yasugi 1998). Мы также проанализировали роли, которые выполняются Shh и PPARγ в дифференцировке эпителия (see section C.2.b).
Третья группа включает гены, экспрессия которых ограничена или увеличивается в клетках желез после образования желез. Smad8 и Gata5 принадлежат к этой группе и являются маркерными генами эпителия желез. Четвертая группа включает Delta1 и Notch1, которые экспрессируются спорадически в просветном эпителии. Анализ функции этих генов привел к очень важным находкам. В последней группе находится и ген ECPg, который экспрессируется спустя несколько дней после образования желез, но только в эпителии желез, поэтому он рассматривается как доступный наиболее специфический маркер.
Мы расширили наши исследования профилей этих генов в др. органах и выявили экспрессию некоторых генов, четко определяющих границы между органами (Yasugi & Fukuda 2000). Напр., Gata5 экспрессируется в преджелудке и в органах кзади от него, но не в пищеводе (Sakamoto etal. 1998). Затем, cSox2 экспрессируется в пищеводе, преджелудке и gizzard, тогда как CdxA начинает экспрессироваться сразу же после gizzard (Ishii etal. 1997, 1998). Региональная специфичность пищеварительного тракта может быть т. о. приписана дифференциальным паттернам экспрессии этих генов, по крайней мере. частично.
C.2 Molecular mechanisms underlying the regionalization of the stomach epithelium
a. Mesenchymal factors in the proventriculus. Одним из наиболее важных вопросов, связанным с дифференцировкой эпителия преджелудка является определение мезенхимных факторов, её контролирующих. Мы предположили, что некоторые из факторов, присутствующих в мезенхиме легких, а также преджелудка могут быть кандидатами на роль регуляторов этого процесса, т.к. легочная мезенхима обладает сильной способностью индуцировать ECPg. Затем мы исследовали экспрессию некоторых генов, экспрессирующихся в преджелудке и легких, и проводили оценку функций bone morphogenetic protein 2 (BMP2), fibroblast growth factor 10 (FGF10) и Wnt5a.
BMP2 экспрессируется в мезенхиме преджелудка и легких, но не в др. органах пищевариения, по крайней мере, во время формирования желез. Анализировали функции BMP2 путем избыточной экспрессии этого гена, используя ретровирусную систему (Fukuda et al. 2000) или путем ингибирования передачи сигналов BMP за счет избыточной экспрессии noggin, ингибитора BMP. Мы установили, что избыточная экспрессия BMP2 ведет к образованию значительно большего количества желез, которые экспрессируют ECPg по сравнению с контрольными эксплантами, инфицированными пустым вирусным вектором. Напротив избыточная экспрессия noggin полностью ингибировала образование желез и эпителий никогда не экспрессировал ECPg, хотя все эпителиальные клетки экспрессировали cSP, маркер просветного эпителия. мы также продемонстрировали, что BMP4 не эффективен в индукции генерации избытка желез в эпителии преджелудка и что мезенхима gizzard, инфицированная BMP2 вирусом, не может индуцировать экспрессию ECPg в ассоциации с эпителием преджелудка. Итак, эти результаты четко показывают, что BMP2 участвует в формировании желез в эпителии преджелудка, но это не единственный фактор в мезенхиме, который регулирует эпителиальную дифференцировку (Narita etal. 2000).
FGF10 экспрессируется довольно широко в мезенхиме пищеварительных органов. В преджелудке экспрессия этого гена начинается на 4-й день инкубации и постепенно ограничивается регионами, непосредственно под эпителием. Её рецепторы, FGFR2a и 2b, экспрессируются в эпителии. Избыточная экспрессия FGF10 in ovo в презумптивной области желудка приводит к гиперморфозу эпителиального слоя преджелудка. Неожиданно, клеточная дифференцировка эпителия желез нарушается в результате этого воздействия и эпителиальные клетки желез часто обнаруживают экспрессию cSP вместе с Smad8, маркерами желез. В то же самое время пролиферация эпителиальных клеток усиливается, указывая тем самым, что FGF10 контролирует эпителиальную дифференцировку посредством регуляции клеточной пролиферации (Shin et al, 2005, 2006).
Wnt5a экспрессируется в мезенхиме преджелудка на 5 и 6-й день, распространяясь позднее на мезенхиму gizzard, избыточная экспрессия Wnt5a вызывает гетеротипическую дифференцировку как железистого, так и просветного эпителия (Listyorini & Yasugi 2006).
Хотя эти мезенхимные факторы критически участвуют в морфогенезе и цитодифференцировке эпителия, наиболее вероятно. что они осуществляют своё влияние путем образования сложной сети сигнальной трансдукции. Более того, для морфогенеза, как полагают, важен внеклеточный матрикс. Фактически образование желез преджелудка, как было установлено, стимулируется матриксом. содержащим laminin (Matrigel) (Koike & Yasugi 1999).
b. Effects of the overexpression of genes expressed in the epithelium. Исходя из наших находок, подтверждаюих эту точку зрения, мы установили, что мезенхимные факторы важны для морфогенеза эпителия. Однако, хотя эти факторы присутствуют в мезенхиме под эпителием, их распределение довольно случайное в мезенхиме, это указывает на то, что они не являются ключевыми игроками в детерминации региональных отличий в эпителии. Мы полагаем поэтому, что некоторые факторы в эпителии важны для решений о формировании желез или просветного эпителия. Мы выбрали три гена из множества, которые экспрессируются в эпителии приблизительно во время образования желез (see above) и анализировали их функции.
Мы сфокусировались на сигнальной системе Notch-Delta , которая, как известно, важна для установления групп специфицированных клеток среди гомогенной клеточной популяции (Campos-Ortega 1993). Мы попытались с помощью электропортации экзогенных генов в эпителий совместно с репортерной плазмидой продемонстрировать активацию передачи сигналов Notch (Kohyama etal. 2005) , что Delta1 появляется в некоторых эпителиальных клетках до образования желез, которое индуцируется активностью Notch 1 в соседних клетках. Мы также подтвердили, что эти Notch-активируемые клетки позднее становятся железистыми клетками. Когда мы супрессировали передачу сигналов Notch, то мы обнаружили, что эти клетки стремятся приобрести судьбу просветных клеток, тогда как избыточная активность Notch 1 сохраняет эти клетки в недифференцированном состоянии. Поэтому мы пришли к выводу, что активация Notch действует как детерминант дифференцировки в направлении железистых клеток и в то же самое время супрессирует быструю цитодифференцировку (Matsuda et al. 2005).
Shh является одним из наиболее важных факторов во время развития позвоночных и экспрессируется во всём эпителии перед образованием желез, но его экспрессия почти исчезает из эпителия желез (Narita etal. 1998). Когда вызывалась избыточная экспрессия Shh в эпителии с использованием ретровирусов, то образование желез и экспрессия ECPg полностью ингибировались. В этом случае экспрессия patched и Gli факторов, участвующих в передаче согналов hedgehog, также как и BMP4, заметно усиливалась в мезенхиме, указывая тем самым, что Shh может супрессировать образование желез посредством этих мезенхимных факторов (Fukuda et al. 2003). Мы также проанализировали функцию PPARγ, которая, как было показано, важна для различных метаболических путей и для туморогенеза в пищеварительных органах (Takahashi etal. 1999). PPARγ экспрессируется также в эпителии всего преджелудка перед образованием желез, но в железистом эпителии его экспрессия становится очень слабой (Hojo et al. 2006). Если активность PPARγ стимулировалась за счет избыточной экспрессии этого гена вместе с добавлением агониста (indomethacin), то образование желез снова ингибировалось (M. Kusaki, K. Fukuda & S. Yasugi, unpubl. data, 2006).
c. Factors regulating ECPg expression. Благодаря сложным взаимодействиям и функции многих мезенхимных и эпителиальных факторов, упомянутых выше, формируются железы в эпителии преджелудка. Эпителиальные клетки желез затем начинают экспрессировать ECPg как один из функциональных результатов их образования. ECPg экспрессируется только в преджелудке во время эмбриогенеза (Hayashi era/. 1988b). Регуляция транскрипции гена ECPg изучалась с использованием метода репортеров.
Наиболее важный транскрипционный фактор, который регулирует ECPg это GATA. Существует пять GATA-связывающих сайтов на 800 bp выше стартовой точки транскрипции ECPg и мы продемонстрировали, что три сайта, расположенные вблизи места старта, обязательны для транскрипции этого гена. Мы также установили, что экспрессия Gata5 позитивно регулируется в железистых эпителиальных клетках и что белок GATA5 может фактически соединяться с GATA-связывающими сайтами в вышестоящей от ECPg области. С др. стороны, наши находки показали, что cSox2 действует как негативный регулятор: избыточная экспрессия этого гена в эпителии полностью ингибирует транскрипцию ECPg is completely inhibited. Как упоминалось выше, cSox2 экспрессия исчезает из железистого эпителия. Следовательно, наша модель регуляции транскрипции ECPg базируется на конкурентном действии GATA и Sox факторов (Fukuda et al. 1994; Sakamoto et al. 2000; Watanuki & Yasugi 2003). Из этого мы делаем вывод, что экспрессия этих факторов контролируется эпителиальным фактором Shh. Также Smad8 экспрессируется только в железистых клетках и может участвовать в регуляции ECPg под влиянием мезенхимного BMP.
До сих пор мы описывали молекулярные события, которые лежат в основе регионализации желудка, детерминации преджелудка и gizzard, регионализации внутри эпителия преджелудка, формирования желез и экспрессии ECPg (Fig. 3). Хотя точные взаимоотношения между факторами, регулирующими эти процессы всё ещё запутаны.
C.3 Regulation of mesenchymal differentiation by the epithelium
Мезенхима дифференцируется в слои lamina propria, muscularis mucosae, submucosa и гладкие мышцы. В желудке мышечный слой, нервное сплетение, происходящее из нервного гребня, хорошо развиты и эти концентрические структуры из мезенхимы более или менее одинаковы для всего пищеварительного тракта. Мы были заинтересованы молекулярными механизмами, ведущими к образованию таких концентрических структур и использовали gizzard эмбрионов кур в качестве модельной системы, мы продемонстрировали, что его эпителий, предопределяет упорядоченность этих структур. Когда эпителий прикрепляется к наружной поверхности мезенхимы gizzard, то гладкие мышцы экспрессируют ген cFKBP/SMAP (Fukuda et al. 1998), было установлено, что он дифференцируется на внутренней стороне мезенхимы.
Затем мы поискали эпителиальные факторы, регулирующие дифференцировку гладких мышц, и нашли, что молекула Shh, экспрессирующаяся в эпителии, играет определённую роль. Белок Shh неизменно ингибирует образование гладких мышц и это действие блокируется применением cyclopamin. Лежащий в основе механизм также приложим и к дифференцировке нервного сплетения (Sukegawa et al. 2000).
Этот анализ четко показал, что во время образования пищеварительных органов эпителиально-мезенхимные взаимодействия играют важную роль.
C.4 Characteristics and plasticity of the mammalian stomach epithelium
В предыдущих разделах мы представили наши находки по морфогенезу и функциональной дифференцировке пищеварительных органов у кур, особое внимание было уделено преджелудку эмбрионов кур. Эти результаты заставили обратиться нас к дифференцировке желудка млекопитающих.
Желудок взрослых мышей состоит из двух частей: forestomach, содержащий стратифицированный эпителий, и железистый желудок, который обладает простым столбчатым эпителием, формирующим железы. Сначала мы исследовали, влияет ли на дифференцировку эпителия железистого желудка (gastric) гетерогенная мезенхима эмбрионов мыши и установили, что его онтогенетическая судьба детерминируется на 11.5 день беременности, когда желудок начинает расширяться (Fukamachi etal. 1979).
В первичных культурах, 16.5-дн. gastric эпителиальные клетки плодов мышей дифференцируются в клетки слизистой поверхности, которые экспрессируют cathepsin E в отсутствие мезенхимы, но не дифференцируются клетки, продуцирующие pepsinogen (Fukamachi et al. 1994a). В присутствии гастрической мезенхимы, однако, pepsinogen-продуцирующие клетки появляются среди клеток гастрического эпителия (Tsukada et al. 1998), указывая. что гастрическая мезенхима существенна для дифференцировки pepsinogen-продуцирующих клеток. Однако было также продемонстрировано, что гастрическая мезенхима не способна индуцировать пепсиноген-продуцирующие клетки в ассоциации с энтодермой урогенитального синуса, хотя железы желудочного типа формируются экстенсивно (Mizuno etal. 1990a).
Runx3 является runt доменовым транскрипционным фактором, строго экспрессирующимся в гастрическом эпителии, но почти не экспрессирующимся в forestomach. У RunxЗ-нулевых мышей гастрическая слизистая обнаруживает гиперплазии, обусловленные стимулированной пролиферацией и супрессированным апоптозом эпителиальных клеток (Li et al. 2002). Более того, гастрические эпителиальные клетки RunxЗ-нулевых мышей дифференцируются in vivo в клетки кишечного типа, экспрессирующие Cdx2 (Fukamachi etal. 2004). Следовательно, Runx3 регулирует пролиферацию гастрического эпителия и ингибирует экспрессию генов кишечного типа. У человека экспрессия RUNX3 существенно редуцирована при кишечных метаплазиях и gastric раках, а потеря его функции связана с генезом и прогрессированием gastric рака (Li et al. 2002).
Системы первичных культур были разработаны для эпителиальных клеток двенадцатиперсной кишки (Fukamachi 1992), gastric (Fukamachi etal. 1994a), forestomach (Fukamachi etal. 1995) и толстого кишечника (Fukamachi etal. 2005). В отношении их реакции на факторы роста и ECM, forestomach и gastric эпителий оказались одинаковыми, и оказались похожими эпителий двенадцатиперсной кишки и колона . Эпителий forestomach и двенадцатиперстной кишки оказались совсем различными, а gastric эпителий обнаруживал промежуточное состояние между ними. Т.о., может существовать градиент от головы к хвосту, который контролирует реакцию эпителия на эти факторы (Fukamachi etal. 1995).
Чтобы идентифицировать мезенхимные факторы, которые контролируют рост и дифференцировку желудочно-кишечного эпителия, производили поиск факторов, экспрессирующиеся в мезенхиме и контролирующие рост эпителия. Мезенхимные факторы, идентифицированные на сегодня включают hepatocyte growth factor (Fukamachi etal. 1994b), keratinocyte growth factor (Matsubara etal. 1996), laminin, fibronectin, type IV collagen (Ichinose ef al. 1997) и endothelin-3 (Fukamachi et al. 2005).
C.5 Molecular analysis of intestinal regionalization
Как упоминалось выше, эпителий тонкого кишечника эмбрионов кур на 6-й день инкубации формирует структуры, похожие на железы, но не экспрессирует ECPg под влияением мезенхимы преджелудка (Yasugi ef al. 1985). Это указывает на то, что судьба кишечного эпителия детерминируется очень рано в развитии. Мы далее анализировали потенциал кишечного эпителия относительно эффекта гетерологичных мезенхим, используя специфические маркеры.
Кишечный эпителий 6-дн эмбрионов кур ассоциировали и культивировали с мезенхимой преджелудка, но не обнаружили никакой экспрессии cSP или cSox2, маркеров передней части пищеварительного тракта. Эти культуры неизменно экспрессировали sucrase, chick intestinal fatty acid binding protein (clFABP) и CdxA, маркеры кишечного эпителия. Почти идентичные результаты были получены с более молодой энтодермой, полученной от 1.5-дн. эмбрионов. Если энтодерма культивировалась с дермисом, полученным из 6-дн. эмбриональной кожи, то она экспрессировала Shh, пан-энтодермальный маркер, но не специфические маркеры эпителия или кишечника или желудка. Эти данные показывают, что молодая презумптивная кишечная энтодерма обладает потенциалом дифференцировки в направлении эпителия кишечника, но что реализация этого зависит от определенных факторов из мезенхимы пищеварительных органов или спланхнической мезодермы (Hlramatsu & Yasugi 2004). Хотя мы ещё не выявили факторов, которые участвуют в спецификации передних и задних чатей первичного пищеварительного тракта, очень возможно, что CdxA, гомолог Drosophila caudal гена, является важным. В этой связи, Silberg et al. (2002) продемонстрировали, что Cdx2, мышиный гомолог CdxA, может вызывать кишечную метаплазию в эпителий желудка. i
C.6 Molecular mechanisms underlying the regionalization of the Drosophila digestive tract
Drosophila является одной из наиболее важных моделей в области биологии развития. В последние годы достигнут существенный прогресс в нашем понимании механизмов. лежащих в основе регионализации пищеварительного тракта. Пищеварительный тракт Drosophila представлен передней, средней и задней кишкой. Эпителий передней и задней кишки у этого организма эктодермального происхождения, тогда как средняя кишка энтодермального происхождения. У взрослых мух средняя кишка составляет большую часть пищеварительного тракта.
Для детерминации и дифференцировки энтодермы Drosophila необходимы GATA факторы. Один из них, Serpen (srp), активирует dGATAe, др. GATA фактор. dGATAe экспрессируется специфически в энтодерме средней кишки Drosophila и активирует гены. участвующие в функционировании средней кишки (Fig. 4; Murakami et ai. 2005; Okumura etal. 2005; Okumura ef al. 2007).
Средняя кишка Drosophila состоит из энтодермального эпителия и окружена мезодермой. В мезодерме члены семейства HOM-C, такие как sex combs reduced, Antennapedia, Uitrabithorax, abdominal-A и Abdominal-B экспрессируются вдоль передне-задней оси. Эти HOM-C гены в свою очередь активируют гены, кодирующие сигнальные молекулы, такие как wingless(wg) и decapentaplegic(dpp), которые затем вызывают регионализацию средней кишки (Nakagoshi 2005). У личинок Drosophila средняя кишка имеет более 20 доменов, которые отличаются разными паттернами генной экспрессии. Однако молекулярные механизмы, которые детерминируют эти домены, всё ещё неизвестны.
Детерминация задней кишки Drosophila зависит от фактора, известного как brachyenteron (byn), гомолог Brachury позвоночных (Fig. 4; Murakami etal. 1999). Задняя кишка может быть подразделена на 6 доменов со специфическими типами клеток. Подразделение зачатка задней кишки в основном обеспечивается сигнальными молекулами, такими как Wg и Notch, а также с помощью транскрипционного фактора engrailed (Murakami etal. 1999; Takashima & Murakami 2001; Takashima etal. 2002). Необходимо также отметить, что многие гомологичные гены или гены, принадлежащие к тому же семейству, участвуют в регионализации пищеварительных трактов как позвоночных, так и Drosophila, такие как Gata, dpp, BMP, wg и Wnt.
C.7 Factors regulating the regionalization of mammalian hepatic tissues
Сходным образом. что и у эмбрионов ку (as discussed in section A3), печенеочная энтодерма эмбрионов мышей развивается в виде дивертикула на вентральной донной части передней кишки. Эта печеночная энтодерма первоначально состоит из гепатобластов. В средине беременности гепатобласты, которые располагаются вокруг портальной вены, формируют протоковые пластинки или жемчужина-подобные структуры и затем возникают клетки intrahepatic bile duct (IHBD), которые экспрессируют характерный для желчных протоков cytokeratin и несколько lectin-связывающих сайтов (Shiojiri 1979, 1981, 1984: Shiojiri etal. 1991). Они также образуют базальную ламину, которая экспрессирует laminin и nidogen, тогда как гепатобласы, не связанные с портальной веной, дифференцируются в зрелые гепатоциты, которые лишены таких структур (Shiojiri & Sugiyama 2004). Жемчужина-подобные структуры временно экспрессируют маркеры зрелых гепатоцитов, такие как urea-цикла энзим ornithine transcarbamylase (OTC) и albumin, но их экспрессия супрессируется в течение нескольких дней (Shiojiri et al. 1991, 2001). Это указывает на то, что финальным самопроизвольным фенотипом гепатобластов является фенотип гепатоцитов и что микроусловия вокруг портальной вены могут ограничивать судьбу гепатобластов желчными эпителиальными клетками.
Мозаичный анализ с помощью случайной инактивации или отцовской или материнской Х хромосомы выявил spfash мутацию (редкая шерсть, аномальная кожа и волоски и дефицит OTC ) у гетерозиготных самок, которая демонстрирует, что гепатобласты двойным потенциалом дифференцировки, чтобы формировать гепатоциты и IHBD клетки (Shiojiri etal. 1997, 2000, 2001). Это также строго подтверждается наблюдениями, что гепатобласты печени C/EBPa-нулевых мышей обильно развивают псевдожелезистые структуры, которые напоминают предшественников IHBD (Shiojiri etal. 2004). Супрессия экспрессии С/ЕВРа в гепатобластах вокруг вены ведет к подъёму экспрессии Hnf6 и Hnflp и, наконец, к дифференцировке желчных клеток. Паренхима печени дикого типа экспрессирует мРНК этих транскрипционных факторов на низких уровнях, хотя желчные предшественники около вены обнаруживают сильную экспрессию этих транскриптов (Yamasaki ef al. 2006). Итак, следовательно, в гепатобластах, расположенных около портальной вены, дифференцировка в IHBD стимулируется за счет супрессии экспрессии С/ЕВРа, которая вызывается сигналами, такими как Notch2 и TGFβ из periportal эндотелия и соединительной ткани и за счет повышения экспрессии Hnf6 и Hnfip (Shiojiri 2007).
Источник extrahepatic bile ducts (EHBD) и желчного пузыря отличается от такового для IHBD. Первый происходит из каудальной части печеночного зачатка, тогда как последний дифференцируется из гистобластов, развивающихся из краниальной части (Shiojiri 1979, 1981). Они развиваются независимо и соединяются вторично др. с др. , это ведет к образованию общей системы дренирования желчи (Shiojiri & Katayama 1987, 1988; Shiojiri & Sugiyama 2004).
Инактивация гена Hes1 gene (basic helix-loop-helix [bHLH] транскрипционного фактора, который оперирует ниже передачи сигналов Notch) индуцирует превращение EHBD в панкреатическую ткань (Sumazaki etal. 2004). Это указывает на то, что эпителиальные клетки этих протоков могут обладать потенциалом дифференцировки в панкреатические клетки и что экспрессия Hes1 в EHBD супрессирует эту дифференцировку в поджелудочную железу и обеспечивает дифференцировку в желчный пузырь и EHBD.
C.8 Reconstruction of the digestive tract during amphibian metamorphosis
Во время метаморфоза амфибий эпителий кишки драматически меняется с личиночной на взрослую форму под влиянием thyroid hormone (TH). Этот феномен очень интересен с точки зрения органогенеза и регенерации органов. Ремоделирование при переходе от личинки к взрослой форме эпителия желудка и кишечника у эмбрионов Xenopus связано с двумя основными процессами на клеточном уровне: (i) апоптозом личиночного эпителия; и (ii) активной клеточной пролиферацией и последующей дифференцировкой взрослого эпителия. происходящего из стволовых клеток (Ishizuya-Oka & Shimozawa 1992a; Ishizuya-Oka & Ueda 1996; Ishizuya-Oka etal. 1997, 1998). Одновременно с началом ремоделирования эпителия базальная ламина внезапно истончается и становится более проницаемой и оказывается непосредственно под развивающимся взрослым эпителием, фибробласты, обладающие хорошо развитым грубым эндоплазматическим ретикулемом агрегируют и часто устанавливают клеточные контакты со взрослыми эпителиальными клетками (Ishizuya-Oka & Shimozawa 1987). Дифференцировка этих фибробластов обеспечивается эпителием и взаимодействиями эпителия и соединительной ткани, которые существенны для ремоделирования кишечника (Ishizuya-Oka & Shimozawa 1992b, 1994).
TH непосредственно позитивно регулирует экспрессию stromelysin-3 (S73), matrix metalloproteinase-11 (MMP11). Экспрессия ST3 в фибробластах, находящихся непосредственно под эпителием, играет роль в модификации базальной ламины, которая облегчается апоптозом в эпителии (Ishizuya-Oka et al. 2000; Fu et al. 2005). С др. стороны, TH также позитивно регулирует экспрессию Shh в эпителии. Наивысший уровень экспрессии Shh наблюдается в эпителиальных стволовых клетках взрослых (Ishizuya-Oka et al. 2001b), которые как и кишечные стволовые клетки млекопитающих экспрессируют Musashi-1 (Ishizuya-Oka etal. 2003). Затем Shh индуцирует BMP-4 в фибробластах непосредственно под развивающимся взрослым эпителием , а BMP-4 способствует дифференцировке взрослого эпителия (Ishizuya-Oka etal. 2001a, 2006). Следовательно, очень возможно, что Shh и BMP-4 участвуют в развитии взрослого эпителия, происходящего из стволовых клеток, как эпителиальные и соединительнотканные сигналы. соотв. Недавние успехи в культивировании и трансгенных технологиях позволили нам исследовать функции таких чувствительных к TH генов в кишечнике амфибий и пролили свет на молекулярные аспекты ниш стволовых клеток, которые общи с таковыми кишечника млекопитающих (Ishizuya-Oka 2007: Fig. 5).
D. Stem cells in the digestive tract
Дифференцировка эпителия пищеварительного тракта, упомянутая выше, может быть объяснена, т.к. большинство биологов развития до сих пор полагаются на недифференцированное состояние эпителиальных клеток. Внутри популяций недифференцированных клеток происходит некоторая гетерогенность или региональная спецификация, которая вызывается эффектами от окружающей среды или факторами внутри этих популяций. Субпопуляции таких клеток может быть в дальнейшем подразделены на несколько небольших клеточных групп, в которых клетки последовательно дифференцируются в соответствии с природой группы, к которой они принадлежат. При таком процессе клетки, детерминированные к ограниченной онтогенетической судьбе, когда они когда они переходят от одной степени к др. В случае презумптивной кишечной энтодермы детерминация кишечного эпителия происходит очень рано, тога как эпителий gizzard сохраняет свою потенцию дифференцироваться в эпителий преджелудка вплоть до очень поздних стадий развития. Будучи полностью дифференцированными многие эпителии
Fig. 5. Larval-to-adult intestinal remodeling during Xenopus metamorphosis. Thyroid hormone directly upregulates the expression of ST3 and that of Shh. ST3 facilitates apoptosis of the larval epithelium by modifying the basal lamina. On the other hand, Shh induces the expression of BMP-4, which in turn promotes the differentiation of the adult epithelium (courtesy of Dr A. Ishizuya-Oka).
обнаруживают потенциал к дальнейшей дифференцировке в гетеротипическую форму, даже под влиянием сильного индуктивного воздействия и можно сказать необратимо детерминируются. Однако это предположение о процессе дифференцировки не может объяснить, почему эпителий эмбрионального пищевода может экспрессировать ECPg под действием легочной мезенхимы (section B.3).
Здесь м представляем нашу гипотезу, что в регионализации и цитодифференцировке пищеварительных органов стволовые клетки играют важную роль. Энтодерма пищеварительных органов эмбрионов кур обнаруживает региональную спецификацию, которая устанавливается в раннем развитии. Однако когда эпителий кпереди от gizzard, но не задний эпителий, рекомбинируется с мезенхимой преджелудка, то ECPg-экпрессирующие клетки появляются в эпителии. Этот удивительный феномен может быть объяснен, если мы предположим существование стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в ECPg-продуцирующие клетки. С помощью этой гипотезы стволовых клеток мы можем также объяснить, почему энтодерма от очень молодых эмбрионов может само-дифференцироваться in vitro в отсутствие мезенхимы (see section A.1), без какого-либо прямого контакта между энтодермальными и мезодермальными клетками и даже несмотря на тот факт, что карты судеб энтодермы и мезодермы не совпадают на ранних стадиях развития (see section A.2). Как описывалось выше в предыдущем разделе (C.8), в кишечнике эмбрионов Xenopus во время метаморфоза появляются эпителиальные стволовые клетки взрослого типа и их дифференцировка стимулируется с помощью TH.
Мезенхима пищеварительного тракта, как полагают, стимулирует и супрессирует пролиферацию и дифференцировку эпителиальных стволовых клеток. Напр., gizzardмезенхима может полностью супрессировать пролиферацию или дифференцировку эпителиальных стволовых клеток, которые иначе становятся ECPg-экспрессирующими клетками (see section B.3). Др. словами, мезенхимные клетки органа предоставляют некоторые средовые факторы (ниши), которые регулируют пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток в этом органе.
Существование стволовых клеток во взрослых пищеварительных органах было установлено ранее (Karam & Leblond 1993; Potten etal. 2003: Giannakis etai. 2006). Однако существование и функционирование стволовых клеток в развивающихся пищеварительных органах еще не изучено. Результаты наших собственных исследований пока не прояснили, правильна ли теория стволовых клеток. Однако наши недавние находки, что клетки, экспрессирующие Musashi-1, маркер стволовых клеток, по крайней мере, в нервной системе (Sakakibara et al. 1996; Kaneko et al. 2000) и кишечнике (Kayahara etal. 2003; Potten etal. 2003), обнаруживаются в эмбриональном желудке и кишечнике Xenopus, кур и мышей, это строго указывает на то, что стволовые клетки выполняют некоторые важные роли в процессе развития (Ishizuya-Oka etal. 2003; Asai et al. 2005).
Conclusions and perspectives
In the present review, we have described studies undertaken in our laboratories on the regionalization and differentiation of the digestive organs in vertebrates and Drosophila. These findings have elucidated some pivotal molecular pathways that are involved in endodermal organ formation. By providing basic information and techniques, this knowledge will be useful for the future analysis of the molecular mechanisms underlying organogenesis in general, and also for the advancement of regenerative medicine.
However, many issues in this field remain to be tackled in the future. We contend that the principal questions that are currently outstanding are as follows:
1. How and when do the stem cells, that will later give rise to various cell types according to the environmental cues (niche), appear in the presumptive gut endoderm and what are their molecular characteristics? In general, ES cells are characterized by the expression of Oct3/4, Stat3 and Nanog (Loh etal. 2006), and neural stem cells by the expression of nestin, Sox2 (Wegner & Stolt 2005) and Musashi-1 (Sakakibara etal 1996). We do not yet know the gene expression profile of the gut stem cells. It is thus necessary to explore methods that may identify them. For this purpose, the establishment of an appropriate culture system for gut stem cells is required.
2. What are the first factors that determine both the anterior-posterior and dorsal-ventral axes? During many aspects of development, homeobox genes, especially members of Hox gene cluster, are known to be involved in the determination of the anterior-posterior axis. In addition, at some stage in the regionalization of the digestive tract it has been suggested that Hox genes play functional roles (Sakiyama et ai. 2001). There is also a possibility that these axis and regional specificities are determined by the molecular network at the time of the establishment of the endoderm (Fukuda & Kikuchi 2005).
3. After the digestive tract is subdivided into several parts, what factors or key genes regulate the differentiation of each organ? For the development of the pancreas, Pdx1 is known as a key gene (Jonsson etal. 1994), and for lung. FGF10 (Bellusci etal. 1997). However for other digestive organs, we do not yet know what the key genes are and their identification will be a very important advancement for regenerative medicine as it pertains to digestive organs.
4. Studies from our laboratory and others have stressed the importance of mesenchymal factors in the morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelium. These factors must therefore form very complex networks, and the elucidation of these pathways, the interrelationship between them, in addition to the associated epithelial factors and signaling systems, can be carried out using inclusive analyses of the gene expression patterns of both tissues, and by rigorous functional analysis of the relevant genes.
|
Сайт создан в системе uCoz |