Последнее обновление: 01/26/2025 06:16:01  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Посещений:
ЭНТОДЕРМАЛЬНЫЙ ОРГАНОГЕНЕЗ

Градиенты, Генетический Контроль

Transcriptional Dynamics of Endodermal Organ Formation
Richard I. Sherwood, Tzong-Yang Albert Chen, and Douglas A. Melton
Developmental Dynamics 238:29-42, 2009. © 2008 Wiley-Liss, Inc. | Original Article with Figure

Although endodermal organs including the liver, pancreas, and intestine are of significant therapeutic interest, the mechanism by which the endoderm is divided into organ domains during embryogenesis is not well understood* To better understand this process, global gene expression profiling was performed on early endodermal organ domains* This global analysis was followed up by dynamic immunofluorescence analysis of key transcription factors, uncovering novel expression patterns as well as cell surface proteins that allow prospective isolation of specific endodermal organ domains. Additionally, a repressive interaction between Cdx2 and Sox2 was found to occur at the prospective stomach-intestine border, with the hepatic and pancreatic domains forming at this boundary, and Hlxb9 was revealed to have graded expression along the dorsal-ventral axis. These results contribute to understanding the mechanism of endodermal organogenesis and should assist efforts to replicate this process using pluripotent stem cells.

Одним из первых решений судеб клеток происходит во время эмбриогенеза позвоночных - это разделение на зародышевые слои: эктодерму, мезодерму и энтодерму. Энтодерма, которая образуется сначала вне эмбриона и позднее интернализуется, давая пищеварительный и респираторный тракты и ассоциированные с ними органы. Происходящие из энтодермы органы включают печень, поджелудочную железу, лёгкие, кишечник и желудок, но сначала появляется первичная кишечная трубка.
У мышей дефинитивная энтодерма формируется во время гаструляции в виде толщиной в одну клетку слоя вне чашеобразного эмбриона. По ходу гаструляции эта дефинитивная энтодерма мигрирует кпереди, замещая внеэмбриональную висцеральную энтодерму (Lavvson and Ped-ersen, 1987). Энтодермальный слой постепенно начинает формировать складку на переднем и заднем концах, формируя передний и каудальный кишечные порталы (anterior and caudal intestinal portals (AIP and CIP, соотв.). Вентральные губы этих трубок увеличиваются в направлении к центру эмбриона, заставляя слой энтодермы постепенно сворачиваться в трубку, так что на ст. 13-15 сомитов (embryonic day [E] 8.75 у мыши), вся энтодерма интернализуется в виде трубки. Локальное увеличение пролиферации и/или миграции провоцируется мезодермальными сигналами, вызывающими образование зачатков, которые становятся видимыми к E9.5, которые д. стать лёгкими, печенью и дорсальной и вентральной частями поджелудочной железы. После E9.5, домены специфицированных энтодермальных органов, а также самостоятельные секции кишечной трубки (пищевод, желудок, кишечник) подвергаются морфогенезу и клональной диверсификации, чтобы создать функциональную архитектуру, специфичную для каждого органа.
Имеются доказательства, указывающие на то, что когда энтодерма инициально формируется (между E6.5 и E7.5 у мыши), она не детерминирована на специфические органные домены. Будучи эксплантированной мышам E7.5 передняя энтодерма, помещенная рядом с задней мезодермой, может активировать задние энтодермальные гены и vice versa (Wells and Melton, 2000). Экспланты мышей ст. E8.25 из вентральной части энтодермы обладают потенциалом активность гены, специфические для поджелудочной железы, печени или легких в зависимости от их близости к кардиальной мезодерме или от концентрации fibroblast growth factors (Deutsch et al.v 2001; Serls et al.. 2005). Потенциал дифференцировки энтодермы был исследован далее на эмбрионах кур с использованием гетеротопических трансплантаций. В этих экспериментах, ст.5- 12-сомитов (эквивалентно E8.25-E8.5) энтодерма изменяет экспрессию позиционных маркеров, если трансплантируется более кзади, но не меняет позиционных маркеров, если трансплантируется кпереди (Kumar et al.. 2003), и экспрессия позиционных маркеров детерминируется на ст.10- 12-сомитов (Kimura et al., 2007).
Ключ того, как энтодерма формирует паттерн органных доменов неизвестен, но и из известных кусочков не может быть составлен согласованный механизм. У мыши гены, которые со временем становятся специфическими для лёгких, печени и поджелудочной железы могут быть обнаружены в небольшом количестве клеток вентральной энтодермы на ст. E8.5 (Serls et al., 2005), хотя обнаружимое образование зачатков рудиментов этих органов из энтодермальной трубки не происходит только днём позднее. Детальная экспрессия транскрипционных факторов во время этого критического периода времени неизвестна. Несколько сигнальных путей, включая те, что активируются с помощью ретиноевой кислоты (Stafford and Prince, 2002; Molot-kov et al., 2005; Pan et al., 2007), и семейств bone morphogenetic protein (BMP; Tiso et al., 2002; Shin et al., 2007), fibroblast growth factor (FGF; Jung et al., 1999; Wells and Melton, 2000; Serls et al., 2005; Dessimoz et al., 2006), Wnt (Ober et al., 2007; McLin et al., 2007), Hedgehog (Hebrok et al., 1998) и Activin (Hebrok et al., 1998; Kim et al., 2000), участвуют в формировании энтодермальных органов, пока мало известно о непосредственных транскрипционных мишенях этих путей. Кроме того, соседние ткани, такие как хорда (Kim et al., 1997), эндотелий (Lammert et al., 2001; Matsu-inoto et al., 2001), кардиальная мезодерма (Deutsch et al., 2001), мезенхима поперечной перегородки (septum transversum) (Rossi et al., 2001) и латеральная пластинка мезодермы (Kumar et al., 2003) , как известно, важны для энтодермального органогенеза. Предстоит ещё много работы по сведению этих наблюдений в механистическую модель. Одной из наиболее основополагающих сторон процесса органогенеза, который слабо изучен, является динамическая экспрессия ключевых транскрипционных факторов. Такое знание может помочь соединению информации о сигнальных путях и индуктивных тканях с таковой об их специфических транскрипционных мишенях.
Чтобы постичь, как эмбриональная кишечная трубка подразделяется на орган-формирующие регионы, мы сфокусировались на экспрессии ключевых транскрипционных факторов. Эти гены являются, как минимум, пригодными географическими маркерами, а в некоторых случаях, прекрасно выполняют роль в спецификации клеточных судеб. Первоначально были приготовлены микромассивы из энтодермальных предшественников в 6 органных доменах, чтобы получить представление о факторах, экспрессирующихся во время органогенеза. Мы отслеживали эти микромассивы путём характеристики динамического паттерна клеточной экспрессии для многочисленных генов, экспрессия которых ограничена энтодермальными органами. Эти эксперименты наглядно представили, как энтодерма формирует паттерна вдоль свой оси и где формируются органные домены.

DISCUSSION


Во время 24-hr периода органогенеза мыши между E8.0 и E9.0, энтодерма трансформируется из плоского слоя с мало известной гетерогенностью в трубку, в которой уже определены домены для всех основных органов. Считается, что молекулярная гетерогенность предшествует морфологической дифференцировке, поскольку транскрипционная динамика органогенеза энтодермы охарактеризована недостаточно. Чтобы пролить свет на энтодермальный органогенез, были использованы в комбинации получения глобальных транскрипционных профилей и конфокальные картины с клеточным разрешением.
Получение транскрипционных профилей выявляет сложность процесса органогенеза. Немногие транскрипционные факторы являются уникальными для индивидуальных органов. Органогенез скорее всего базируется на множественных отличающихся передачах сигналов и транскрипционных вкладах, это подчёркивается тем фактом, что эмбрионы, лишенные как Pdx1, так и Ptf1a, двух транскрипционных факторов наиболее важных для развития поджелудочной железы, всё ещё формируют рудиментарный панкреатический зачаток (Burlison et al., 2008), а эктопическая экспрессия Pdx1 в энтодерме недостаточна, чтобы управлять завершением морфогенеза поджелудочной железы (Grapin-Botton et al., 2001). Т.о., эти немногие орган-специфические транскрипционные факторы вряд ли являются единственными эффекторами органного морфогенеза. Вместо этого большая когорта транскрипционных факторов экспрессируемая во многих, но не во всех органных доменах, делает скорее всего наиболее важной комбинацию воздействий на органогенез. Домены экспрессии сами по себе ещё не обеспечивают простыми воздействиями механизмы органогенеза, т.к. существуют транскрипционные факторы, экспрессируемые многими разными комбинациями органов; однако они ценны, для улучшения понимания механизмов, лежащих в основе управления экспрессией этих факторов, а также их сетевых взаимодействий.
Получение транскрипционных профилей позволяет также идентифицировать белки клеточной поверхности, которые могут быть использованы для выделения специфических энтодермальных органных популяций. Каждый орган имеет сигнатуру в виде набора клеточных поверхностных белков (Supp. Table S2), которая может быть использована для выделения органных предшественников, а также субнаборов клеток внутри каждого органа. Используя коммерческие доступные антитела, кишечная энтодерма может быть изолирование по её экспрессии Dpp4, печёночная и панкреатическая энтодерма по их экспрессии Dlk1, а энтодерма желудка по её строгой экспрессии Rae1. Способность выделять специфические популяции энтодермальных органных предшественников была использована в эксперимента по дифференцировке эмбриональных стволовых клеток. в которых типы клеток не идентифицируются по морфологии.
В качестве комплементарного подхода к глобальному профилированию транскрипции, отслеживали иммунофлюоресцентное окрашивание целых эмбрионов с помощью конфокального отображения (imaging), позволяющего вычленять паттерны экспрессии с клеточным разрешением. Этот подход позволяет определять границы транскрипции, которые трудно установить с помощью гибридизации in situ целых препаратов, поскольку отсутствует клеточное разрешение, или с помощью секционной иммунофлюоресценции, при которой может быть проанализирована очень небольшая область. Такой анализ является прижизненным, позволяющим понять механизм органогенеза, т.к. анализируемые молекулярные маркёры являются скорее всего ниже расположенными эффекторами орган-формирующих сигналов и транскрипционных путей.
Наблюдения экспрессии Cdx2 и Sox2 между E8.0 и E9.5 выявили интересные реципрокные взаимоотношения. Оба гена экспрессируются в энтодерме до сомитогенеза, когда вся энтодерма представлена плоским слоем (summarized in Fig. 7a). Экспрессия Cdx2 начинается в наиболее задней части энтодермы и распространяется постепенно кпереди, тогда как экспрессия Sox2 начинается в наиболее передних клетках и распространяется прогрессивно кзади во время ранних сомитных стадий, когда энтодерма начинает формировать трубку на обоих концах. На ст. 13-15 сомитов границы экспрессии Sox2 и Cdx2 встречаются в средней кишке и некоторые клетки на этой границе коэкспрессируют оба этих гена. Эта ко-экспрессия разрешается на ст. E9.5, когда на границе, остаются клетки, экспрессирующие или Sox2 или Cdx2.
Расширение экспрессии Cdx2 и Sox2 д. происходить за счёт миграции клеток, уже экспрессирующих эти гены, за счет ориентированных клеточных делений экспрессирующих клеток или за счёт de novo экспрессии ранее не экспрессировавшими клетками. Отслеживание клонов энтодермы указывает на то, что последняя возможность наиболее вероятна. Несколько исследований по отслеживанию клонов энтодермы у мышей на сомитных стадиях были проведены с инъекцией краски в энтодермальные клетки специфического расположения и анализа их производных в ходе дальнейшего развития (Lawson and Pedersen, 1987; Tremblav and Zaret, 2005; Franklin et aL, 2008), и эти исследования не выявили существенной передне-задней миграции, которая могла бы объяснить, как предсуществующие Sox2 и Cdx2-экспрессирующие клетки колонизируют всю энтодерму. Т.о., д. существовать механизмы антериоризации и постериоризации сигналов для этих двух генов. Природа этих механизмов неясна и д. согласовываться с распределением сигнальных молекул в направлении центра эмбриона с переднего и заднего полюсов или за счёт timing-based механизмов, которые позволяют клеткам, которые уже были подвергнуты действию морфогенетичеких сигналов, начинать экспрессировать эти гены.
Как только Cdx2 и Sox2встречаются репрессивные взаимодействия могут возникать. чтобы остановить взаимное проникновение этих двух доменов экспрессии. Фактически внесение эктопических Cdx2 в Sox2-экспрессирующие клетки передней кишки репрессировало эндогенный Sox2, тогда как эктопические Sox2 не репрессировали Cdx2, указывая тем самым. что Cdx2 репрессия Sox2 может обусловливать резкую границу между доменами экспрессии этих генов. На дорсальной и вентральной сторонах, Cdx2 также формирует границу с Pdx1. В то время как анализ эктопической экспрессии не позволил определить эффект Cdx2 на экспрессию Pdx1, экспрессия Cdx4, гомолога Cdx2, как было установлено, ограничивает экспансию панкреатического домена у рыбок данио (Kinkel et aL, 2008). Способность более кзади экспрессируемого транскрипционного фактора подавлять передний транскрипционный фактор и отсутствие реципрокного эффекта и составляет молекулярную основу широко распространённой концепции, известной как заднее доминирование (posterior dominance) (reviewed in McGinnis and Krumlauf, 1992; Duboule and Morata, 1994). Заднее доминирование происходит при формировании паттерна энтодермы (Kumar et al., 2003; Kimura et aL, 2007), и эта транскрипционная репрессивная активность может помочь объяснить этот феномен.
Незадолго до встречи Sox2 и Cdx2 на ст. 6-8 сомитов, впервые обнаруживается гепатопанкреатический региональный маркёр, Onecut1, начинающий экспрессироваться в передне-задней полоске, захватывающей Sox2 и Cdx2 домены. Экспрессия Onecut1 распространяется на всю дорсо-вентральную ось, тогда как Prox1 и Pdx1, которые начинают экспрессию на стадии 9-11 сомитов, первоначально экспрессируются сначала вентрально, а затем дорсально к стадии 13-15 сомитов, но не в медиальной части энтодермы (хотя на ст. E9.0, Pdx1 слабо экспрессируется в медиальных клетках, которые становятся задней частью желудка и двенадцатиперстной кишки), а Hnf4a экспрессируется только вентрально. Хорда, как известно, играет жизненно важную роль в индукции Pdx1в дорсальной части энтодермы (Kim et al., 1997; Hebrok et aL, 1998), и хорда оказывается отделённой от энтодермы в панкреатическом регионе за счёт дорсальной аорты на стадии 12-15 сомитов (Yoshitomi and Zaret. 2004). Т.о., Pdx1 впервые может обнаруживаться в дорсальной части энтодермы непосредственно после того как хорда теряет контакт с энтодермой. Эта задержка может вызываться временем, необходимым для индуцируемой хордой транскрипцией Pdx1, что доказывается экспрессией белка и подчёркивает точную координацию морфогенеза, необходимого для органогенеза, т.к. смещение хорды дорсальной аортой необходимо для индукции экспрессии Ptf1a (Lammert et aL, 2001; Yoshitomi and Zaret, 2004).
По своему положению, Onecut 1, Proxl, Pdxl и Hnf4a не обладают общими границами и даже на ст. E9.5. Pdx1 и Prox1 не обладают общей границей в панкреатическом домене. Присутствие большего количества доменов экспрессии, чем органов в гепато-панкреатической области указывает на то, что множественные сигнальные механизмы могут быть ответственны за инициацию экспрессии этих генов. Эти дополнительные гепато-панкреатические домены могут быть жизненно важны для формирования самостоятельных структур внутри этой области, таких как панкреатический и желчный протоки.
Поскольку передне-задняя гетерогенность может быть легко связана с формированием органов в разных позициях вдоль передне-задней оси, имеется значительно меньше сигнальных воздействий, обеспечивающих дорсо-вентральную гетерогенность Hlxb9. Эмбрионы, дефицитные по Hlxb9 имеют дефекты образования дорсальной, но не вентральной панкреас (Harrison et aL, 1999; Li et al., 1999), подтверждая роль Hlxb9 в облегчении формирования паттерна дорсальной энтодермы в пре-панкреатиеской области. Однако, Hlxb9 экспрессируется по всей дорсальной энтодерме, так что вполне возможно, что его отсутствие будет вызывать более лёгкие дефекты формирования дорсо-вентрального паттерна в др. регионах энтодермы. Отделение дорсальной части пищевода от вентральной части трахеи и дорсальный изгиб и диспропорция типов клеток в желудке являются двумя событиями, которые могут получать паттерн-формирующие импульсы от Hlxb9.
Т.к. функциональное значение Hlxb9 в формировании паттерна дорсо-вентральной энтодермы неизвестно, то паттерн его экспрессии чётко подтверждает, что Hlxb9 интерпретирует один или множественные дорсо-вентрально асимметричные сигналы. Экспрессия Hlxb9 обнаруживается в медиальной половине энтодермы на ст. E8.0, а на ст.E8.75, когда медиальная часть энтодермы становится дорсальной энтодермой в результате образования вентральной складки латеральной энтодермы во время тубулогенеза, то уровень его экспрессии снижается в наиболее вентральных Hlxb9-экспрессирующих клетках (summarized in Fig. 7b). Впоследствии слегка увеличенная экспрессия в наиболее дорсальных Hlxb9-экспрессирующих клетках и постепенно снижающаяся в вентральном направлении создают линейный градиент экспрессии, в котором каждая клетка обнаруживает более низкий уровень Hlxb9, чем её дорсальная соседка. Линейность и уклон градиента находятся в пределах значений, полученных для Drosophila Bicoid, чья концентрация снижается семикратно между передним полюсом и срединной точкой при таких же концентрациях и уклоне (Gregor et aL, 2007). Эти данные дополнительно подтверждают, что все клетки, экспрессирующие Hlxb9 на ст. E9.5 происходят от E8.5 Hlxb9-позитивных клеток, исключая существенные клеточные перемещения поскольку дорсальные 50% энтодермы постоянно экспрессируют Hlxb9.
Т.о., энтодерма, по-видимому, получает градированные морфогенетические импульсы вдоль дорсо-вентральной оси. природа которых неопределённа. Hlxb9 д. прямо или косвенно позитивно регулироваться с помощью сигналов, происходящих из медиально/дорсально расположенных тканей, таких как хорда или негативно регулироваться сигналами от латеральной пластинки мезодермы, или эти сигнальные воздействия д. быть комбинаторными. Идентификация этих сигналов может оказаться критической для понимания энтодермального органогенеза. Кроме того, т.к. Hlxb9 является единственным транскрипционным фактором, обеспечивающим формирование дорсо-вентрального паттерна. Одним из вероятных кандидатов является Hhex, опять же который мы не обнаружили, работая с коммерческими антителами, но который, по-видимому, экспрессируется преимущественно в ранней вентральной энтодерме и необходим собственно для формирования вентральной части поджелудочной железы и печени (Thomas et al., 1998; Martinez Barbera et al., 2000).

→ | K титульной странице | K оригиналам в pdf- и html-формате
Посещений:

Сайт создан в системе uCoz