Studies that concern the mechanism of DNA replication have provided a major framework for understanding genetic transmission through multiple cell cycles. Recent work has begun to gain insight into possible means to ensure the stable transmission of information beyond just DNA, and has led to the concept of epigenetic inheritance. Considering chromatin-based information, key candidates have arisen as epigenetic marks, including DNA and histone modifications, histone variants, non-histone chromatin proteins, nuclear RNA as well as higher-order chromatin organization. Understanding the dynamics and stability of these marks through the cell cycle is crucial in maintaining a given chromatin state.
Рис.1. | Asymmetric DNA replication and coupling of inheritance of DNA and histone marks.
Рис.2. | Nucleosome dynamics and mixing of parental and new H3–H4 dimers.
Рис.3. | Fate of old and new H3–H4 dimers and their marks at the fork.
Рис.4. | Inheritance of histone H3 variants outside of S phase.
Рис.5. | Maintaining pericentric heterochromatin in fission yeast and mouse.
Рис.6. | Reprogramming during development and the fate of epigenetic marks.
Box 1 | Candidate players for epigenetic inheritance
A model for transmission of the H3K27me3 epigenetic mark K/H.Hansen, A.P.Bracken, D.Pasini, N.Dietrich, S.S.Gehani, A.Monrad, J.Rappsilber, M.Lerdrup, K.Helin (kristian.helin@bric.dk) Nature Cell Biol. - 2008. - Vol. 10, № 11. - P.1291-1300
Ключевым нерешенным вопросом остается вопрос, как эпигенетические метки передаются клеткам следующего поколения во время клеточного деления. Предлагается модель для объяснения, как триметилированный по лизину 27 гистон 3 (H3K27me3), который катализируется с помощью комплекса PRC2, поддерживается в пролиферирующих клетках. В противоположность большинству др. эпигенетических меток, триметилирование H3K27 катализируется в основном с помощью энзима EZH, белка группы Polycomb, являющегося каталитической субъединицей стержня PRC2 комплекса. Установлено, что PRC2 комплекс соединяется с меткой H3K27me3 и совместно локализуется с этой меткой в G1 фазе и с сайтами начала репликации ДНК. Эффективное связывание нуждается в интактном тримерном PRC2 комплексе, содержащем EZH2, EED и SUZ12, но не зависит от каталитического SET домена в EZH2. Было установлено, что временное рекрутирование PRC2 комплекса на хроматин выше точки старта транскрипции является достаточным для поддержания репрессии посредством эндогенного PRC2 во время последующих клеточных делений. Предполагается, что когда устанавливается метка H3K27me3, то она рекрутирует PRC2 комплекс для сохранения этой метки в месте репликации ДНК, что ведет к EZH2 катализируемому метилированию H3K27 дочерних нитей во время инкорпорации вновь синтезированных гистонов Н3. Этот механизм гарантирует поддержание H3K27me3 эпигенетической метки в пролиферирующих клетках не только во время репликации ДНК, когда гистоны, синтезируемые de novo, инкорпорируются, но и также вне S фазы, сохраняя тем самым структуру хроматина и программы транскрипции.
Определение привлекло большое внимание в ряде публикаций1-6. Первоначально предложенный Waddington в 1942, термин epigenetics определяет причинные механизмы, с помощью которых гены генотипа становятся причиной фенотипа7. В 1987, Holliday применил термин epigenetic к ситуациям, в которых изменения в метилировании ДНК приводит к изменениям в активности генов8. Сегодня широко принятым определением - которое используется в этом обзоре - считается, что эпигенетика это изучение наследуемых изменений в функции генома, которые возникают без изменений последовательностей ДНК1. Это определение означает, что определенные состояния, которые предопределяют качественные особенности клетки, приобретаются за счет наследуемых инструкций - эпигенетических меток, которые детерминируют будет ли, где и как специфическая генетическая информация считана. Инициальный набор этих эпигенетических меток представляет фазу становления. Здесь мы обсудим эпигенетическое наследование как способ гарантии передачи эпигенетических меток, как только они будут установлены, от материнской к дочерней клетке и в принципе от поколения к поколению. Следовательно, эпигенетическая информация представляет собой форму памяти, которая необходима для поддержания функции генома, включая как паттерны дифференциальной экспрессии генов данного клеточного клона (включая, напр., поддержание качественных особенностей клеток после дифференцировки, мозаичный эффект положения у Drosophila melanogaster, дозовую компенсацию и импринтинг у млекопитающих), так и распространение существенных архитектурных признаков, таких как теломеры и , которые необходимы для жизнеспособности и статуса пролиферации клеток. Любое незапланированное нарушение на этих уровнях может вести к болезни.
Недавние исследования пролили свет на метилирование ДНК как на bona fide эпигенетическую метку, и организацию хроматина как основной источник кандидат на роль носителя информации, накладываемой на то, что кодируется самой ДНК (Box 1). В соответствии с генетической информацией эпигенетические маркеры д. быть наследуемы, чтобы быть квалифицированы как настоящая эпигенетическая информация. Более того, в противоположность генетической информации, которая д. быть высоко стабильна, эпигенетическая информация обладает определенным уровнем пластичности и она по существу обратима. Следовательно, необходимо понять, как определенное состояние хроматина, которое ассоциирует с определенным типом клеток, может сохраняться в ходе множественных клеточных делений, и что более важно, как она может встречать лицом драматические пертурбации, которые происходят во время прохождения репликационной вилки в S фазе. В зависимости от природы эпигенетических меток, оперируют разные стратегии, чтобы восстановить или поддержать эпигенетическое состояние, или непосредственно после разрушительного события (т.е., связанным с репликацией способом) или способом. который может быть отделен от разрушительного события.
Действительная природа и разнообразие модификаций гистонов и модификаторов10 и вариантов гистонов11, описываются вдр. месте, также как и вызовы, бросаемые хроматину во время репликации и репарации12, 13. Здесь мы обсудим сложные механизмы, которые используются, чтобы облегчить наследование эпигенетических меток не только на ст. репликационной вилки, но и на др. стадиях клеточного цикла. Мы обсудим поддержание, используя пример центромер посредством событий, которые происходят во время развития, обратимость эпигенетических меток и их динамику.
Inheritance at the replication fork
В каждом клеточном цикле целостность генетической и эпигенетической информации подвергается риску во время репликации ДНК. Когда ДНК реплицируется, то хроматин подвергается волне разрушения и последующего восстановления после прохождения репликационной вилки. В то время как клональная сохранность нуждается в точном сохранении эпигенетических меток, репликация ДНК также предоставляет временной интервал для возможных изменений в эпигенетическом статусе, происходящих во время дифференцировки и развития. Т.о., используются утонченные механизмы для гарантии стабильности посредством согласованной трансмиссии генетической и эпигенетической информации на репликационной вилке, и для гарантии пластичности, которая делает возможными желаемые переключения во время развития.
Inheritance of DNA methylation during replication. С момента первого предположения, что генетическая информация реплицируется с помощью полу-консервативного способа14, было многое выяснено относительно энзимов и аппарата, действующего во время репликации15. Однако лишь начинаем осознавать, как на стадии репликационной вилки наследование генетической и эпигенетической информации может быть связано и как компоненты аппарата репликации ДНК в принципе взаимодействуют со всеми аспектами наследования помимо последовательностей ДНК.
Репликация ДНК происходит асимметричным способом с непрерывным синтезом на ведущей нити и прерывистым синтезом на отстающей нити (Fig. 1a,b). Этот синтез катализируется с помощью специализированных ДНК полимераз на каждой из нитей16. ДНК полимеразам помогает DNA processivity фактор proliferating cell nuclear antigen ()17, который загружается на обе нити. Т.о., PCNA представляет собой важную связь между двумя нитями, а укладка двух нитей в пространстве может в дальнейшем гарантировать связь механизмов репликации на ведущей и ведомой нитях18 (Fig. 1a). Если обратиться к эпигенетическим меткам в дополнение к удвоению ДНК, то важно оценить метилирование ДНК, отложение гистонов и гистоновых меток связано с аппаратом репликации. Помимо своей роли в синтезе ДНК, PCNA может также связывать синтез ДНК и наследование эпигенетических меток19, это подтверждается ранними наблюдениями, что определенные мутации в PCNA супрессируют мозаичный позиционный эффект у D. melanogaster20. Более того, PCNA взаимодействует со многими факторами сборки хроматина и модификации хроматина12, 13, 19, 21, 22 (Fig. 1c; see below). Помимо PCNA, др. факторы также скорее всего вносят свой вклад во взаимосвязь между наследованием генетической и эпигенетической информации. В самом деле, minichromosome maintenance (MCM) комплекс, который является предположительно replicative helicase, взаимодействует с anti-silencing function 1 (ASF1; see below)23, это предполагает скоординированный приток гистонов к родительской и дочерней нити. Подобно полу-консервативному наследованию последовательностей ДНК паттерны симметричного метилирования ДНК в CpG (cytosine сопровождаемый guanine) сайтах передаются с высокой точностью. Сохранение метилирования ДНК на вилке гарантируется (), благодаря её сродству к полуметилированными ДНК in vitro24, 25 и её взаимодействию с PCNA26. Однако механизм, с помощью которого поддерживается метилирование гарантировано с высокой точностью, неизвестен, т.к. DNMT1 обнаруживает также метилирующую активность de novo27, а её способность связывать PCNA не является абсолютно необходимой для поддержания метилирования ДНК28, 29. Недавние доказательства указывают на то, что и -associated (SRA)-домен-содержащие белки variant in methylation 1 (VIM1) у Arabidopsis thaliana и NP95 (также наз. UHRF1 и ICBP90) у млекопитающих составляют дополнительную механистическую связь между полу-метилированной ДНК и DNMT1 (Refs 30-33). NP95 соединяется преимущественно с полу-метилированной ДНК34-36, взаимодействует с DNMT1 и необходим для её локализации на реплицирующихся гетерохроматиновых регионах32 (Fig. 1c). В самом деле, делеция NP95 ведет к дефектам метилирования33, которые напоминают те, что обнаруживаются после потери DNMT1 (Ref. 37), это указывает на то, что NP95 играет доминантную роль в закреплении поддерживаемой methyltransferase активности на вновь реплицированной ДНК. Сохранение метилирования ДНК далее нуждается в АТФ-зависимом хроматин-ремоделирующем факторе decreased DNA methylation 1 (DDM1) у A. thaliana38, 39 и в LSH (также известном как HELLS) у мышей40, это, как было предположено, обеспечивает доступ аппарата метилирования к вновь реплицированной ДНК38.
Паттерны метилирования ДНК могут воспроизводиться в точности после прохождения репликационной вилки за счет использования преимуществ комбинации факторов: полу-консервативная репликация, которая дает полу-метилированную ДНК; распознавание полу-метилированной дочерней нити с помощью NP95; и ассоциация DNMT1 с аппаратом репликации. Эти механизмы гарантируют стабильное размножение паттернов метилирования ДНК и подкрепляют мнение, что метилирование ДНК является прототипом bona fide эпигенетических меток. Хотя мы узнали кое-что о механизмах поддержания, которые гарантируют стабильное размножение меток, очень важно также рассмотреть механизмы, которые способны удалять эти метки, чтобы постичь полностью динамику поведения метилирования ДНК41-43.
Inheritance of histones and their modifications? ДНК и её метки метилирования реплицируются, используя полу-консервативные механизмы наследования, при которых информация копируется с матрицы44. Прохождение репликационной вилки разрушает также родительские нуклеосомы, которые несут пост-трансляционные модификации. Чтобы быть наследуемыми и, следовательно, быть классифицированными как эпигенетические метки, эти гистоны и их модификации д. корректно собираться снова после прохождения вилки13. Однако очевидная матрица для повторной сборки нуклеосом отсутствует. Принимая во внимание, что вне S фазы обмены репликативного и гистона H4 минимальны по сравнению с быстрыми обменами H2A и H2B45, 46, H3 и , вместе со своими ассоциированными метками могут служить вероятными кандидатами на роль передачи информации от одного клеточного цикла к следующему. Следовательно, чтобы избежать потери информации, которая кодируется гистоновыми модификациями, необходима соотв. координация между рециклингом родительских H3-H4 димеров с их гистоновыми метками одновременно с включением вновь синтезируемых гистонов13.
Сборка нуклеосом использует закладку (deposition) из одного (H3-H4)2 тетрамера, который может существовать в промежуточной H3-H4 димерной форме, на ДНК, это сопровождается отложением двух H2A-H2B димеров47 (Fig. 2a). Гистоновые хапероны играют ключевые роли в качестве акцепторов и доноров гистонов, которые помогают при разрушении и повторной сборке нуклеосом. Они контролируют локальное снабжение гистонами и обладают специфичностью к определенным гистонам или даже к специфическим вариантам гистонов48. Важно, что H3.1-H4 chaperone chromatin assembly factor 1 (; также известный как CHAF1) рекрутируется на репликационную вилку посредством взаимодействия с PCNA вместе с др. гистоновыми модификаторами, такими как (HDACs) и 19, 21 (see below). CAF1 состоит из трех субъединиц - p150, p60 и p48 - которые координируют сборку нуклеосом во время репликации ДНК49, 50 или в местах репарации ДНК22, 51 облегчая отложение вновь синтезированных H3.1-H4 (Ref. 52).
Др. H3-H4 хаперон, ASF1, взаимодействует непосредственно с CAF1 p60 субъединицей53 и участвует синергично с CAF1 в синтезе ДНК, зависящем от сборки хроматина, действуя как донор вновь синтезируемых гистонов. Более того, ASF1 непосредственно сцеплен с аппаратом репликационной вилки посредством взаимодействий с компонентами предполагаемой репликативной helicase23. Подавление ASF1 замедляет ход S-фазы и нарушает расплетание ДНК из-за дефектов в динамике гистонов23. Вновь синтезированные гистоны, которые ассоциируют с хаперонами, такими как CAF1 и ASF1, несут эволюционно законсервированную комбинацию K5 и K12 меток ацетилирования на H4 (Refs 54, 55), которые ассоциируют с отложением новых гистонов и удаляются во время созревания хроматина. У почкующихся дрожжей новый H3 ацетилирован по остатку K56 (H3K56ac), который регулирует сборку нуклеосом, которая зависит от CAF1 и специфического для дрожжей гистонового хаперона (Refs 56, 57). В то время как присутствие H3K56ac метки описано у человека58, его концентрация, по-видимому, ограничена и его ассоциация с отложением новых гистонов не документирована. Более того, гомологи Rtt106 и Rtt109 (также известна как Kat11), которые действуют на H3K56, пока не идентифицированы у человека. Итак, играют ли H3K56ac или неидентифицированные модификации сходные роли у млекопитающих ещё предстоит исследовать.
Заметим, что вновь синтезированные гистоны H3 и H4 присутствуют в комплексах перед откладкой как димеры с гистоновыми хаперонами59 (Fig. 2a). Хотя этот принцип четко установлен для вновь синтезированных гистонов, судьба родительских H3-H4 гистоновых димеров, которые, как полагают, откладываются как тетрамеры на дочерних нитях также может быть пересмотрена. Тот факт, что гистоны H3 и H4 существуют как стабильные тетрамеры в растворе в отсутствие ДНК60 говорит против существования родительских H3-H4 димеров. Однако структурные данные показывают, что ассоциация ASF1, и потенциально также p48 и p55, с гистонами несовместима с тетрамерной структурой61-65. Кроме того, тот факт. что некоторые гистоны, несущие родительские метки, могут обнаруживаться в ассоциации с ASF1 в условиях, при которых helicase и polymerase оказываются не связанными23, подтверждает гипотезу, что ASF1 участвует в расщеплении тетрамера и что он функционирует как акцептор преобразованных родительских димеров. Следовательно, в самом деле возможно, что родительские тетрамеры (со своими собственными метками) расщепляются и перераспределяются на дочерних нитях в качестве димеров. Это затрагивает динамику гистонов на вилке и может продуцировать или смешанные тетрамеры, которые представлены родительским и новым димерами (Fig. 2b), или нуклеосомы, которые представлены только старыми гистонами, если повторно ассоциируют родительские димеры. Этот второй сценарий требует, чтобы или старые димеры находились в тесном контакте или находились в удалении от новых димеров, или что некое событие распознавания гарантирует, что правильные старые димеры будут снова соединяться вместе в туже самую частицу. Пространственная организация ДНК на вилке может облегчать эти механизмы (Fig. 1a).
Если модификации новых гистонов наводятся с помощью модификаций родительских гистонов, то способ, с помощью которого родительские гистоны будут распределяться на дочерние нити, будет предопределять степень консервации гистоновых меток. Современные модели предполагают, что распределение как родительских, так и вновь синтезированных гистонов на дочерних нитях будут происходить случайным образом (Fig. 3a). Чтобы избежать дилюции гистоновых меток, сохранение модификаций может быть достигнуто за счет использования соседних гистонов как матрицы. Можно предвидеть возможный механизм такой, в котором родительская метка распознается хроматин-связывающим белком или считывающим белком66, это в свою очередь рекрутирует хроматиновые модификаторы или writer белки. Это указывает на само-усиливающую петлю в поддержании () на 67-70 (see below). Такой механизм возможно оперирует в повторяющихся регионах, в которых длинные массивы нуклеосом несут одни и те же метки, но не приложим к регионам, в которых специфические метки ограничиваются только одной или двумя нуклеосомами. Сходный процесс само-поддержки предположен для поддержания репрессивных меток метилирования H3K27me3 (H3 триметилирован по остатку K27) во время репликации, при которой polycomb repressive complex 2 (PRC2) - который ответственен за ответственен за установление H3K27me3 метки - соединяется со своим собственным сайтом метилирования71. Важно определить, когда родительские метки действительно устанавливаются после прохождения репликационной вилки, чтобы оценить, насколько тесно наследование связано с репликацией.
Расщепленные родительские тетрамеры также д. распределяться полу-консервативным способом (Fig. 3b). Согласно представленному выше сценарию с полу-метилированными ДНК, 'hemimodified' нуклеосомы д. предоставлять матрицы, которые инструктируют относительно соотв. выбора модификации, чтобы накладывать вновь откладываемые H3-H4 гистоновые димеры. Третья возможность, которая может иметь место в определенное время и в определенных доменах хроматина, заключается в том, что родительские и новые гистоны сегрегируют асимметрично72. Это может диктоваться прирожденной склонностью нити, т.е. вноситься при репликации ДНК (Figs 1b, 3c). Это может помочь индуцировать переключение путем предоставления пустой (blank) матрицы, чтобы сделать возможными изменения в клеточной судьбе на одной из двух дочерних нитей. Чтобы верно скопировать информацию с родительских на новые нуклеосомы, необходимо общение между нитями, хотя доказательства подобного типа механизма пока отсутствуют, но возможно предусмотреть искривление в пространстве, приводящее две дочерние нити в тесную близость.
Итак, несколько моделей, которые не обязательно взаимно исключительны, были предложены для описания того, как новые и преобразованные гистоны инкорпорируются и модифицируются. Было бы важно оценить эти модели в различных контекстах (напр., в разных типах клеток и определенных субдоменах ядра) с целью оценки эффекта динамики гистонов на репликационной вилке на стабильность и пластичность эпигенетического состояния.
Connecting inheritance of DNA and histone marks
В модели reader-writer наследования гистоновых меток (Fig. 3), метки на соседних родительских нуклеосомах служат в качестве матрицы для модификаций вновь включенных гистонов. Эта ступень созревания может принимать участие на более поздних стадиях клеточного цикла. Однако метки д. также накладываться связанным с репликацией способом и могут быть скоординированы с выбором времени репликации домена (Box 3). Для связанного с репликацией поддержания, могут встретиться две ситуации: во-первых, общие факторы на всех репликационных вилках могут влиять на маркирование; и, во- вторых, домен-специфические факторы модулируются с помощью локального окружения хроматина и с помощью предсуществующих меток, таких как метилирование ДНК (Fig. 1c).
PCNA на всех репликационных вилках может функционировать как посадочная площадка для разных модификаторов хроматина17. PCNA рекрутирует HDACs73 и Lys methyltransferase SET8 (также известную как KMT5A, PR-SET7 и SETD8), которые участвуют в монометилировании H4K20 (Refs 74, 75) , а также хроматин ремоделирующей активности76. PCNA, вместе с CAF1, остается на реплицированной ДНК в течении приблизительно 20 мин77, 78. Во время этого промежутка вновь реплицированный хроматин подвергается модификациям, включая удаление меток ацетилирования на остатках K5 и K12 вновь инкорпорированных гистонов H4 (Refs 54, 55).
В регионах, богатых метилированием ДНК, предсуществующее метилирование и ассоциированный с его поддержанием аппарат д. наводить расположение гистоновых модификаций. В таких регионах methyl CpG-binding protein 1 (), который обнаруживается в комплексе с Lys methyltransferase (также известной как KMT1E)79, может взаимодействовать с CAF1 во время репликации80, это указывает на то, что имеется связь между отложением гистонов и расположением (setting) модификаций. Описанные взаимодействия ДНК methyltransferase энзима DNMT1 с гистон-модифицирующими энзимами (Ref. 81), (Ref. 82) и Lys methyltransferase G9a (также известно как KMT1C)83, могут гарантировать координацию между належением меток на ДНК и гистоны.
Также могут быть задействованы характерные свойства, которые создаются во время репликации ДНК в определенном домене. NP95 обладает сродством как к полу-метилированной ДНК, так и гистонам34-36, 84, и специфически взаимодействует с пептидами, которые метилированы по H3K9 in vitro85, с помощью потенциального считывания гистоновых меток. Кроме того, NP95 обнаруживается в комплексе с HDACs и G9a31, 32. Следовательно, помимо соединения с полу-метилированной ДНК, NP95 может интерпретировать гистоновое окружение, создавая тем самым механизм обратной связи, который использует взаимное усиление меток метилирования гистонов и ДНК. В этой ситуации гистоновые метки могут влиять на наследование метилирования ДНК. Далее хроматин-связывающие белки или модификаторы хроматина с двойным сродством как к метилированной ДНК, так и к определенным модификациям гистонов, скорее всего будут идентифицированы в дальнейшем.
Приведенные выше примеры показывают, как метилирование гистонов и ДНК в репрессивном домене может сохраняться на репликационной вилке. Однако, как активные хроматиновые метки размножаются, менее ясно. Недавно была описана передача активного состояния посредством ядерного переноса у Xenopus laevis и было предположено, что замещение гистонового варианта необходимо для эпигенетической памяти86. Чтобы оценить эту ипотезу, необходимо лучше понимать механизмы, которые участвуют в процессах независимых от репликации замен гистонов и в заменах гистоновых вариантов.
Inheritance of histone variants outside S phase
Гистоновые варианты могут метить определенное состояние хроматина: H3.3 обогащен в активных регионах, тогда как уникальное включение центромер-специфичного гистонового H3 варианта CenH3 ( у человека) специфицирует место, характерное для центромер. Вместе с репликативными вариантами H3.1 и H3.2, варианты замещения H3.3 и CENP-A составляют основные гистоновые H3 изотипы, которые известны у млекопитающих87. H3.1 и H3.2 исключительно инкорпорируются во время S фазы, тогда как отложение замещающих вариантов, таких как H3.3 или CENP-A, происходит вне S фазы11, 88. Т.о., гистоновые варианты H3.3 и CENP-A оказываются кандидатами на роль ключевых игроков эпигенетической информации, которая передается независимым от репликации способом.
Наследование H3.3. H3.3 ассоциирует с транскрипционно активными регионами и обогащен активными гистоновыми метками55, 89, 90. Более того, нуклеосомы, которые содержат H3.3, по-видимому, менее стабильны, чем те, что содержат H3.1 (Ref. 91). Степень, с которой это зависит от статуса дифференциальной модификации нуклеосом55, присутствие др. вариантов, таких как H2A.Z92, или наследуемых различий в из структурных свойствах, еще предстоит установить. Независимо от этого, in vivo, эти свойства указывают на то, что H3.3 нуклеосомы являются более динамичными или ответственными за смещения во время транскрипции. Принимая во внимание, что репликация ведет к сопутствующему отложению H3.1, плотность H3.3-содержащих нуклеосом снижается. Т.к. смешивания H3.1 и H3.3 в одних и тех же нуклеосомах не наблюдается55, 59, то полу-консервативных механизм на вилке вряд ли возможен для наследования H3.3 (Fig. 3b).
Возможно, что разведение H3.3 и его меток наполовину после одного клеточного цикла может не оказывать влияния на транскрипционное считывание региона. Т.о., устойчивая активная экспрессия генов в комбинации с модификациями родительского H3.3, может рекрутировать факторы, которые модифицируют вновь инкорпорированные H3.1 с соотв. метками, и включение H3.3 может быть простимулировано. В согласии с этой гипотезой наблюдались массивы нуклеосом, которые содержат H3.3 и H3.1 нуклеосомы, а анализ гистоновых модификаций в этом контексте показал, что будучи соседними с H3.3 нуклеосомами, H3.1 нуклеосомы накапливают активные метки55. Однако разведение H3.3 в ряде генераций может быть устранено с помощью независимой от репликации инкорпорации H3.3, чему способствуют хапероны, такие как Hir-related protein A (HIRA), сопровождающие транскрипцию59, 93 (Fig. 4a).
Inheritance of CENP-A. Гистоновый H3 вариант CENP-A маркирует место, характерное для центромеры94, 95. Ассоциация CENP-A с центромерами чрезвычайно стабильна, как показывает количественный fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) анализ и он остается ассоциированным в ходе клеточных делений96. Хотя точный механизм отложения CENP-A на центромерах остается загадочным, это независимый от репликации процесс, как и отложение H3.3 (Ref. 97). CENP-A отложение (deposition), как впервые было предположено, происходит в G2 фазе, т.к. сборка CENP-A может происходить в присутствии ингибитора репликации ДНК aphidicolin, а пик CENPA мРНК и CENP-A белка приходится на G2 фазу97. Недавние доказательства на клетках млекопитающих показали, что загрузка новых CENP-A на центромеры ограничивается дискретным временным окном в клеточном цикле в поздней телофаза-ранней G1 фазе98, но механизм и специфический хаперон, который облегчает отложение CENP-A ещё предстоит расшифровать.
Центромерная ДНК реплицируется во время S фазы, во время которой родительские CENP-A нуклеосомы распределяются по дочерним нитям97, 98. Следовательно, хроматин центромер содержит половину набора CENP-A нуклеосом после завершения S фазы и во время последующих G2 и M фаз. Чтобы устранить дефицит CENP-A молекул, как предсказывает современная модель, во время репликации или H3.1-содержащие нуклеосомы временно помещаются на центромеры или напротив создаются нуклеосомные 'пробелы' , которые заполняются позднее в клеточном цикле99 (Fig. 4b).
Недавние исследования указывают на то, что CENP-A нуклеосомы являются необычными и что эти их особенности могут создавать уникальный способ маркирования этого региона хромосом. Напр., у почкующихся дрожжей предположено существование специализированных Cse4 (Saccharomyces cerevisiae CenH3)-содержащие нуклеосом в форме, при которой гистоны H2A и H2B замещаются не гистоновым белком suppressor of chromosome missegregation 3 (Scm3)100. У D. melanogaster описаны 'hemisome', которые состоят из одной молекулы каждая из CenH3, H4, H2A и H2B101. Дополнительные доказательства указывают на то, что подобно H3.3 нуклеосомам, CENP-A нуклеосомы легче разбираются in vitro, чем канонические нуклеосомы102. Можно предположить, что 'необычные' CENP-A-содержащие нуклеосомы представляют собой центромерный хроматин в промежуточном состоянии, которое содержит половину от количества CENP-A, прежде чем он будет полностью восполнен новыми CENP-A молекулами позднее в клеточном цикле. Хотя инкорпорация вариантов, замещающих H3.3 или CENP-A не прямо зависит от репликации ДНК, распределение родительских гистонов на вилке может в принципе предопределять, как и где H3.1 может быть замещен на более поздних стадиях. В этом отношении проверка распределения определенных гистоновых вариантов в определенных доменах в ходе клеточного цикла может оказаться высоко информативной. замещающих
Challenges of heterochromatin maintenance
Домены перицентромерного хроматина вносят вклад в корректное расхождение хромосом и д. сохраняться в ходе клеточного цикла. Во время митоза и S фазы определенные молекулярные маркеры, которые характеризуют перицентрический гетерохроматин и его высоко упорядоченную организацию (Box 2), являются спорными. У разных организмов, таких как делящиеся дрожжи и мыши, используются разные механизмы, которые гарантируют поддержание гетерохроматина.
Fission yeast. делящиеся дрожжи проводят большую часть своей жизни в G2 фазе, во время которой перицентрические повторы организуются в нуклеосомы, которые обогащены диметилированными H3K9 (H3K9me2), с которыми соединяются HP1 гомологи . Swi6 рекрутируется эволюционно законсервированными кольце-образными белковыми комплексами cohesin, которые удерживают сестринские хроматиды вместе103, 104. Когда клетки вступают в митоз, то гистон H3 становится фосфорилированным по остатку S10, это ведет к снижению связывания Swi6 и облегчает сегрегацию хромосом105-107. Центромеры подвергаются репликации даже до завершения цитокинеза108. Разбавление репрессивных гистоновых меток и дальнейшая делокализация Swi6 как следсвие репликации ДНК, как полагают, делают возможным доступ к аппарату RNA polymerase II и происходит двунаправленная транскрипция перицентромерных повторов в это дискретное окно в клеточном цикле в ранней S фазе106, 107 (Fig. 5a).
В самом деле, тщательный анализ уровней транскриптов во время клеточного цикла выявил корреляцию между временем репликации и транскрипции, т.к. передовые транскрипты, которые имеют место старта ближе к источнику репликации, накапливаются первыми107. Транскрипты преобразуются в (siRNAs) , которые временно накапливаются в S фазе107. RNA interference (RNAi)-зависимые и RNAi-независимые механизмы затем управляют активностью Lys methyltransferase (Clr4; также известной как Kmt1) и HDAC (Clr3 and Sir2),соотв., чтобы восстановить характеристики гетерохроматина после репликации109-113. В то время как экспериментальные доказательства подтверждают эту модель у дрожжей, но остается неясным, участвует ли RNAi в поддержании гетерохроматина у млекопитающих114-116. Хотя перицентрические повторы транскрипбируются117, 118, но не каждый компонент аппарата RNAi у делящихся дрожжей, такой как РНК-зависимая RNA polymerase, которая участвует в пост-транскрипционной амплификации продукции siRNA, был идентифицирован у млекопитающих119.
Mice. Как у делящихся дрожжей мышиный перицентромерный гетерохроматин обогащен HP1 белками, связывание которого зависит от H3K9me3 , а также от неидентифицированного структурного РНК компонента120, 121. Хотя фосфорилирование H3S10 происходит при вступлении в митоз у млекопитающих122, 123, некоторые HP1 сохраняются во время митоза и в противоположность делящимся дрожжам обогащены в гетерохроматиновых доменах в G1 фазе124, 125. Регуляция клеточным циклом транскрипции перицентрических повторов также обнаружена и у мышей126. Идентифицированы два вида РНК: короткие виды, которые специфичны для митоза и др. виды варьирующие в размерах, которые накапливаются в G1 фазе и достигают пика в G1-S фазе. Неизвестно, играют ли короткие перицентрические транскрипты роль в динамике HP1 во время митозов. Однако транскрипция крупных видов, как было установлено, затухает перед репликацией гетерохроматиновых доменов, это указывает на маловероятную непосредственную роль перицентрических транскриптов в пост-репликативном созревании гетерохроматина у мышей126.
Напротив, трансмиссия и молчание гетерохроматина у мышей может быть гарантировано с помощью взаимного усиления между наследованием ДНК и модификациями гистонов на репликационной вилке (Fig. 5b). Поддержание гетерохроматина у млекопитающих требует метилирования ДНК, деацетилирования гистонов, триметилирования H3K9 и трансмиссии HP1 белков дочерним нитям. Как обсуждалось выше, DNMT1 обогащен в перицентрическом гетерохроматине в средине S фазы127, и PCNA и DNMT1 рекрутируют HDAC активность. CAF1 присутствует в двух взаимно исключающих комплексах, или с гистонами или с HP1 (Refs 59, 128), и как полагают, это гарантирует наследование HP1 на репликационной вилке128, 129 за счет переноса HP1, который присутствовал до вилки, на вновь формируемый хроматин12, 128, 130. В самом деле, прохождение через среднюю S-фазу блокируется мутациями в HP1-связывающих сайтах в p150 субъединице CAF1 (Ref. 130), нокаут которой у мышей является летальным131. Дальнейшее удержание HP1 в гетерохроматине использует как само-ассоциацию HP1 белков, так и из взаимодействие с SUV39H1 (известным также как KMT1A), основной Lys methyltransferase, которая ответственна за триметилирование H3K9 (Refs 67, 68). Рекрутирование SUV39H1 с помощью HP1, как полагают, создает дополнительные места связывания HP1 и тем самым формирует самоподдерживающую петлю69, 70. Этот механизм также может в принципе гарантировать связывание HP1 с перицентрическим гетерохроматином после дестабилизации в митозе.
Фракция CAF1 также может взаимодействовать с MBD1 и SETDB1 во время репликации гетерохроматина79, 80. Следовательно, можно предположить, что SETDB1 метилирует H3 до его отложения во время репликаци ДНК methylation- и MBD1-обогащенного гетерохроматина. В самом деле, анализ пост-трансляционных модификаций не-нуклеосомного H3.1 показал, что монометилирование H3K9 (H3K9me1) является единственной меткой метилирования перед отложением (deposition)55. будучи инкорпорированым в хроматин, H3K9me1 может действовать как субстрат для дальнейшего метилирования с помощью SUV39H1 (Ref. 55), подтверждая тем самым, что хроматиновые доменты, такие как гетерохроматин, могут быть предварительно маркированы во время отложения гистонов для дальнейшего созревания в более поздней точке.
Др. важной характеристикой мышиного перицентромерного гетерохроматина является его способность формировать кластеры высоко упорядоченных структур, наз. (Box 2). Такая высокого порядка организация также необходима во время репликации ДНК. Неожиданно, домен не подвергается существенным перестройками, как видно при 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) окрашивании (Box 3), и видно, что HP1 не устраняется из гетерохроматина во время S фазы78. Вместо этого, репликация перицентрического гетерохроматина происходит в специфических тельцах удвоения, в которых ДНК вытягивается на периферию и реплицируется. После сборки хроматина ДНК повторно интернализуется в домен128. С разрушением хроматина, ограниченным периферией гетерохроматинового домена, крупно-масштабные структурные изменения не происходят и даже ассоциация между гетерохроматиновыми доменами из разных хромосом может сохраняться во время процесса репликации. Собственно созревание вновь реплицированного хроматина после репликации также затрагивает высокого порядка организацию доменов перицентрического гетерохроматина. Обработка клеток мышей HDAC ингибитором TSA индуцирует обратимые гиперацетилирование и разборку кластеров хромоцентра132. Образование кластеров доменов гетерохроматина также наблюдается у делящихся дрожжей133, у которых ассоциация теломер зависит от функционального RNAi аппарата и поддержания гетерохроматина111.
Перицентрический гетерохроматин является типичным примером конституитивного гетерохроматина и определяется - в противоположность факультативному гетерохроматину - как реакция на продукцию гетерохроматина тем же самым способом на обеих гомологичных хромосомах134, 135. Однако недавнее выяснение, как перицентрический гетерохроматин устанавливается во время развития делает эти различия менее выраженными136, 137. В будущем было важно оценить, применимы ли базовые принципа механизмов поддержания, описанные выше, к др. регионам гетерохроматина.
Inheritance or reversibility?
Хотя наследование эпигенетических меток во время клеточного цикла предоставляет способ стабильного поддержания клеточных клонов, эпигенетическая информация обратима по своей природе. Экстенсивное репрограммирование эпигенетических меток, которое наблюдается во время раннего эмбрионального развития млекопитающих и во время развития primordial germ cell (PGC) подчеркивает прирожденную обратимость эпигенетических состояний (Fig. 6).
Во время преимплантационного развития высоко специализированные, дифференцированные гаметы, которые объединяются в одиночной цитоплазме в момент оплодотворения ведут к образованию тотипотентных зигот, из которых дифференцируются все типы клеток организма. Возвращение к тотипотентности имеет место в одном клеточном цикле и использует дифференциальное метилирование ДНК и изменения модификаций гистонов в отцовском и материнском геноме138-140, а также крупномасштабную реорганизацию хроматина, напр., доменов перицентрического гетерохроматина136, 141 (Fig. 6a). Необходимо отметить, однако, что спермии, хотя и высоко специализированы, уже, по-видимому, существенно репрограммированы, если рассматривать метилирование промоторов142.
Существенное репрограммирование происходит также в PGCs и использует стирание родительских импринтов, это делает возможным образование зародышевых клеток и формирование гамет-специфических импринтов. В первой волне репрограммирования PGCs репрессируют программу экспрессии соматических генов, чтобы приобрети характеристики плюрипотентности143. Во второй волне PGCs стирают импринты метилирования ДНК144, 145 и затем подвергаются существенным изменениям вариантов, модификаций гистонов и хроматин-связывающих белков, а также реорганизации перицентрического гетерохроматина143, 145 (Fig. 6b). Некоторые изменения хроматина являются временными, но потеря импринтов метилирования ДНК персистирует и является обязательным условием для собственно развития и наложения гамет-специфических меток метилирования.
Предложен ряд механизмов, которые вносят вклад в репрограммирование эпигенетических меток кандидатов. Метки метилирования гистонов, которые уже давно рассматриваются как стабильные, могут быть удалены в результате пассивного разбавления, замен гистонов, контролируемого протеолиза гистонов или активного деметилирования, которое катализируется с помощью гистоновых demethylases146. Метилирование ДНК может быть удалено или пассивными или активными процессами. Деметилирование ДНК материнского генома во время преимплантационного развития является, как полагают, пассивным и может быть объяснено разбавлением метилирования ДНК во время репликации, путем предупреждения функции DNMT1 на репликационной вилке147, 148. Быстрое деметилирование ДНК отцовского генома вследствие оплодотворения138, 139 и во время развития PGC подтверждает, однако, что метилирование ДНК может быть удалено с помощью активных механизмов143, 145, 149, 150. Тогда как у растений охарактеризованы DNA glycosylases, которые участвуют в деметилировании ДНК151, 152, но механизмы и ферментативные активности которых, ответственные за деметилирование ДНК у млекопитающих - скорее сцепленные с репарацией ДНК - дискуссионны42, 43, 149, 153-155. Др. вопрос, связанный со взаимоотношениями между деметилированием ДНК и динамикой хроматина и с тем, являются ли изменения хроматина необходимыми, чтобы сделать возможным деметилирование ДНК или с тем влечет ли за собой деметилирование ДНК реорганизацию хроматина. Доводом в пользу второй возможности является наблюдение, что во время развития PGC могут быть обнаружены изменения хроматина, как следствие деметилирования ДНК143, тогда как у зигот деметилирование ДНК сопровождается заменами протаминов на гистоны в родительском геноме139, 156.
Возможности экспериментально репрограммировать дифференцированное ядро путем использования репрограммирующего потенциала ооцита, ещё больше подчеркивают обратимость эпигенетических состояний. Даже раковая клетка успешно репрограммируется, предоставляя тем самым доказательства эпигенетической природы клеточной трансформации при некоторых раках157. Успешное репрограммирование соматических клеток в культуре induced pluripotent stem (iPS) клеток за счет экспрессии избранных транскрипционных факторов является главным прорывом на пути использования обратимости эпигенетических состояний для терапевтических целей158, 159. Эта система может позволить изучение того, как изменения эпигенетического состояния возникают, индуцируемые с помощью экспрессии этих репрограммирующих факторов. Однако любой анализ может быть осложнен потребностью в нескольких раундах репликации и клеточных делений и стохастическим способом, с помощью которого эти изменения происходят. Скорее использование экспериментов по слиянию клеток160 могут стать высоко информативными для понимания молекулярных механизмов, которые управляют репрограммированием и как они проявляются и закрепляются на уровне организации хроматина.
Concluding remarks
During the past few years, great progress has been made in identifying key candidates for epigenetic marks and the mechanisms that ensure their inheritance and reversibility. Molecular players have been characterized that, alone or in combination, function to impose and remove marks on histones and DNA, and insight has been gained into the metabolism of chromatin-associated nuclear RNA and the principles that control nuclear compartmentalization.
It is now clear that complex mechanisms operate at the replication fork to ensure the epigenetic inheritance of DNA methylation, DNA- and chromatin-binding factors, histone modifications and other factors that contribute to higher-order structures. The corresponding machinery likely integrates information of the local chromatin environment, and thereby leads to mutual reinforcement of inheritance of the different marks. Simple models have been built to integrate these parameters. To integrate the increasing complexity of nuclear organization, which we are beginning to unravel, these models have to be evaluated in different regions of the genome and at specific moments during development. In certain cases, faithful inheritance of all epigenetic marks at the fork might not necessarily be desired, and consequently replication presents a window of opportunity to induce a change in epigenetic state.
In addition, not all marks are directly imposed at the replication fork, as chromatin undergoes further dynamics that are uncoupled from the replication process. Certain histone variants, such as CENP-A, are inherited in a replication-independent manner, which brings other phases of the cell cycle into the spotlight. Furthermore, non-dividing quiescent cells with a long lifetime, such as neurons, stably maintain their cellular identity. How this is achieved in the face of cellular renewal remains to be investigated.
Although we have mostly discussed mitotic inheritance of epigenetic marks, a few examples in mammals suggest that epigenetic states that are established during the life of an organism could be passed on to the next generation161-164. The candidate epigenetic marks that are transmitted through meiosis and are responsible for this transgenerational inheritance, and the influence of environmental factors including diet (for example, the level of methyl donors) on transmission, remain matters of debate165-167.
There is also evidence for inheritance that does not rely on chromatin, but might instead involve RNA or cytoplasmic factors3, 168-171. We should thus remain open to the identification of new heritable marks that can impact on gene expression and the developmental programme of an organism. Furthermore, it is likely that future progress will also reveal alternative mechanisms of inheritance that are uncoupled from the disruptive event.
