Во время органогенеза клеточные особенности и тканевой морфогенез д. быть скоординированы, так чтобы эпителиальные листки и мезенхимные массы сформировались в соответствующее время и в соотв. месте. Эпителиальные клетки пищеварительной системы и ассоциированных с ней органов возникают из эмбриональной энтодермы. Энтодерма специфицируется во время гаструляции и первоначалько формирует паттерн вдоль anterior-posterior (A-P) оси в широких доменах передней и задней кишки, которые могут быть идентифицированы с помощью локальной экспрессии гомеобоксных генов, таких как hhex в передней и cdx или vent в задней (Grapin-Botton 2005; Moore-Scott et al. 2007). Печень, желчный пузырь, поджелудочная железа и желудок затем индуцируются из эпителия передней кишки с помощью сигналов от соседней мезодермы, тогда как судьба кишечника предопределяется в задней энтодерме (Zaret 2002; Grapin-Botton 2005). Кроме того, существует самостоятельные потенциалы развития, предшественники передней и задней кишки подвергаются разным морфогенетическим перемещениям. Напр., презумптивный кишечник подвергается существенному удлинению, тогда как домен передней кишки остается относительно компактным дивертикулом, из которого д. возникнуть зачатки органов (Chalmers and Slack 2000; Horb and Slack 2001; Grapin-Botton 2005). Механизмы, которые координируют соответствующий тканевой морфогенез с энтодермальной судьбой, до сих пор неясны.

Недавняя работа на Xenopus показала, что дифференциальная передача сигналов Wnt является ключевым событием, детерминирующим предшественников передней кишки в в противоположность предшественникам задней кишки (McLin et al. 2007). Передача сигналов Wnt обычно подразделяется на два основные класса. В "canonical" Wnt/β-catenin пути, лиганды взаимодействуют с Frizzled (Fz) и LRP6 рецепторным комплексом, вызывая активацию Dishevelled (Dsh). Dsh ингибирует содержащий GSK3 деградационный комплекс, приводя в результате к стабилизации и накоплению в ядре β-catenin, который взаимодействует с Tcf/Lef транскрипционными факторами, чтобы активировать транскрипцию генов мишеней (Clevers 2006; Macdonald et al. 2007). "Noncanonical" передача сигналов Wnt означает, по крайней мере, три внутриклеточных пути, которые не зависят от β-catenin (Wallingford and Habas 2005; Semenov et al. 2007). Путь Wnt/PCP тесно связан с путем planar cell polarity Drosophila и сигналы посредством Fz и Dsh активируют Rho и Rac GTPases, которые передают сигналы посредством Rho-associated kinase (ROCK) и Jun-N-terminal-kinase (JNK), соотв. (Wallingford and Habas 2005). Путь Wnt/Ca²⁺ передает сигналы посредством Fz, G-белков, и Dsh, чтобы мобилизовать внутриклеточный кальций и активировать CamKII (Sheldahl et al. 2003). Наконец, Wnt/Ror2 путь передает сигналы посредством Ror/Ryk рецепторных тирозин киназ, чтобы активировать PI3 kinase, Cdc42 и JNK (Oishi et al. 2003; Schambony and Wedlich 2007). Т.к. детали этих неканонических путей не выяснены, все они регулируют динамику цитоскелета и морфогенетическое клеточное поведение, включая полярность эпителиальных клеток, клеточную слипчивость и клеточные движения (Wallingford and Habas 2005).

Эксперименты на Xenopus подтвердили, что во время гаструлы и на ранних сомитных стадиях развития, высокая активность β-catenin в задней энтодерме способствует приобретению судьбы задней кишки и репрессирует качественные особенности передней кишки. Напротив, передняя энтодерма ощущает низкую активность β-catenin, которая необходима и достаточна для поддержания качественных характеристик передней кишки и для инициации развития печени и поджелудочной железы (McLin et al. 2007). Однако эндогенные Wnts участвуют , а механизмы, которые регулируют их активность вдоль A-P оси, неизвестны.

Предполагается, что секретируемые Wnt антагонисты ответственны за поддержание низкой активности β-catenin в предшественниках передней кишки. На ст. гаструлы, кандидаты на роль антагонистов включают секретируемые frizzled-related protein 1 (Sfrp1), Sfrp2, Sfrp3 (Frzb1), Sfrp5, Crescent и Dkk1, каждый из которых экспрессируется в передней мезодерме (Leyns et al. 1997; Glinka et al. 1998; Pilcher and Krieg 2002; Finley et al. 2003; Kemp et al. 2005). Sfrps секвестрирует Wnt лиганды во внеклеточном пространстве, удерживая их от соединения с Frizzled рецепторами и поэтому может ингибировать передачу как канонических, так и неканонических сигналов (Kawano and Kypta 2003). Напротив, Dkk1 специфически ингибирует канонический Wnt путь путем соединения с LRP6 (Mao et al. 2001; Semenov et al. 2001). Кстати, генетический анализ Wnt антагонистов у мышей не выявил их функции в развитии передней кишки; , однако паттерны их перекрывающейся экспрессии указывают на существенное перекрывание (Leimeister et al. 1998; Finley et al. 2003; Kemp et al. 2005). В самом деле, мутации в dkk1, sfrp1, sfrp2 или sfrp5, также как и различные двойные и тройные мутанты, показывают, что они выполняют перекрывающиеся роли в формировании осевого ствола, но дефекты передней кишки пока не были описаны у таих эмбрионов (Mukhopadhyay et al. 2001; Leaf et al. 2006; Satoh et al. 2006, 2008). У Xenopus, однако, sfrp5 является единственным Wnt антагонистом, экспрессирующимся в переденей части энтодермы во время ранних сомитных стадий (Pilcher and Krieg 2002), и поэтому он является прекрасным кандидатом на роль регуляции спецификации передней кишки во время этого периода.

Авт. показали, что Sfrp5 необходим ка для поддержания качественных особенностей передней кишки, так и для правильного её морфогенеза. Sfrp5-истощенные эмбрионы Xenopus обнаруживали драматическое снижение экспрессии генов передней кишки и имели гипопластические зачатки печени и поджелудочной железы. Кроме того, эпителий передней кишки собственно не формировался: клетки, лишенные apical-basal полярности и рыхло слипающиеся, приводили к коллапсу полости передней кишки. Было показано, что дефекты спецификации и морфогенеза разделимы и обусловлены повышенными уровнями как передачи канонических Wnt/β-catenin так и неканонических Wnt/PCP сигналов, соотв., оба обеспечиваемые Wnt11. Полученные данные показали, что Sfrp5 локально ингибирует Wnt11, чтобы поддерживать качественные особенности передней кишки и позволяет эпителиальному слою передней кишки формироваться поверх массы глубокой энтодермальной ткани. Этот новый механизм может координировать клеточные судьбы и морфогенез в развитии и при болезнях.

Предыдущие исследования предсказали модель, где дифференциальная передача Wnt/β-catenin сигналов контролирует судьбы энтодермальных клеток вдоль A-P оси. В этой модели Wnt лиганды стимулируют высокую активностьβ-catenin в задней энтодерме, что способствует экспрессии vent2 и приобретению судьбы кишечника. Vent2 в свою очередь репрессирует hhex и foxa2, которые существенны для органогенеза передней кишки (McLin et al. 2007). Модель предсказывает, что секретируемые Wnt антагонисты в передней энтодерме защищают предшественников передней кишки и репрессируют передачу сигналов Wnt/β-catenin. Вплоть до сегодня эндогенные антагонисты и лиганды, участвующие в этом процессе были неизвестны. Было показано, что истощение Sfrp5 приводит к потере экспрессии генов передней кишки, как и предсказывалось моделью. Неожиданно, потеря Sfrp5 также предупреждает образование эпителия передней кишки, которая приводит к коллапсу полости передней кишки и нарушает морфогенез зачатка органа. Было показано, что дефекты качественных особенностей клеток и эпителиальной целостности разделимы и обусловлены несоответствующей передачей Wnt/β-catenin и Wnt/PCP сигналов, соотв. Полученные данные подтверждают, что Wnt11 активирует эти пути в энтодерме и что Sfrp5 локально ингибирует каноническую и неканоническую передачу сигналов Wnt11, чтобы скоординировать детерминацию судьбы и морфогенез передней кишки (Fig. 7B).

Между стадиями 15-30, кишка Xenopus удлиняется вдоль A-P оси и зачатки билатерального органа конвергируют к вентральной срединной линии. Полученные результаты показали, что это обеспечивается с помощью Wnt/PCP передачи сигналов, это согласуется с сообщениями, что перекрывание Wnt11, Wnt11-R и Wnt4a лигандов способствует CE энтодермальных предшественников по срединной линии у рыбок данио (Matsui et al. 2005). Будущие исследования нуждаются в точном описании клеточного поведения, обеспечивающего CE в кишке Xenopus, чтобы определить, как это регулируется с помощью PCP пути, наши исследования ингибиторов проливают некоторый свет на это. Полученные результаты указывают на то, что Dsh (PDZ domain) и JNK активности необходимы для элонгации кишки, тогда как активности ROCK и PKC необходимы для конвергенции органов передней кишки, с Dsh (DEP domain) и Rac активностью. существенной как для конвергенции, так и вытягивания (extension). Это напоминает CE в мезодерме гаструлы, где Wnt11 передает сигналы посредством Dsh (как с PDZ, так и с DEP доменами), Rac, JNK, Rho, ROCK и PKC, чтобы скоординировать динамику клеточных поведений с каждым из компонентов, обладающим как самостоятельной, так и перекрывающейся функциями (Yamanaka et al. 2002; Habas et al. 2003; Kinoshita et al. 2003; Tahinci and Symes 2003; Kim and Han 2005).

В дополнение к обеспечению CE движений, классическая передача PCP сигналов регулирует клеточную полярность в эпителии. Напр., Wnt5a- и Sfrp3-обусловленная передача PCP сигналов контролирует proximal-distal полярность сенсорных клеток в эпителии внутреннего уха мышей (Qian et al. 2007). Путь PCP также регулирует апикально-базальную клеточную полярность в эктодерме Xenopus (Dollar et al. 2005). В противоположность этим примерам, где передача PCP сигналов важна для поддержания поляризованного эпителия, было показано, что Sfrp5 необходим, чтобы репрессировать PCP активность в порядке установления поляризованного эпителия передней кишки.

У Xenopus, вентральная эктодерма не является тонким слоем как у мышей и кур, а скорее это массивная ткань. Во время развития Xenopus эпителий передней кишки д. формироваться из передней энтодермы, которая подвергается существенной перестройке клеток во время гаструляции; более того, этот эпителий вентральной части передней кишки д. формироваться поверх массы более глубокой энтодермы, которая продолжает испытывать Wnt/PCP-обеспечиваемые перемещения клеток. Напротив, поверхность задней кишки уже является поляризованным эпителием ещё до гаструляции (Keller 1975; Gerhart and Keller 1986; Shook et al. 2004) и, по-видимому, не затрагивается пертурбациями активности Wnt или Sfrp5. У истощенных по Sfrp5 эмбрионов клетки вентральной части первичной кишки становятся рыхло соединенными и не образуют собственно эпителия с базально-латеральным накоплением β-catenin и апикальной aPKC. Наши данные указывают на то, что Sfrp5 действует локально на поверхности энтодермальных масс, чтобы ингибировать несоответствующую Wnt11-обусловленную передачу PCP сигналов и сделать возможным образование эпителия вентральной части передней кишки. Интересно, что у Sfrp5-истощенныех эмбрионов PCP-зависимый дефект оказывался более локальным, чем Wnt/β-catenin-зависимые дефекты генной экспрессии. Диссоциация клеток и потеря cadherins and β1-integrins из мембраны ограничивались sfrp5 экспрессирующими клетками и их непосредственными соседями, тогда как пониженная экспрессия hhex обнаруживалась на расстоянии в 10-15 клеток от источника Sfrp5. Интересно, что hhex^-/- мутантные эмбрионы мышей также обнаруживают дефекты эпителия передней кишки и потерю клеток (Bort et al. 2006), указывая тем самым, что Hhex, Sfrp5 и Wnt11 могут действовать в виде ауторегуляторной петли.

Передача сигналов Wnt11 регулирует и разнообразные клеточные поведения во время гаструляции. Исходя из этого мы постулировали ряд механизмов, где Sfrp5 д. способствовать образованию эпителия за счет локально ограниченной активности Wnt11. Во-первых, Sfrp5 может удерживать поверхностные клетки, чтобы они не подвергались PCP-обусловленным клеточным перемещениям, которые переживают глубокие клетки, это, по-видимому, является предварительным условием образования эпителия. Эта интерпретация согласуется с нашими экспериментами по ингибированию, где блокирование любого одного из Rac, ROCK, JNK или PKC эффекторов PCP пути достаточно для устранения эпителиальных дефектов у Sfrp5-истощенных эмбрионов. Это сходно с гаструляцией, где ингибирование Rac, Rho или PKC активности достаточно, чтобы ингибировать CE перемещения. Передача сигналов Wnt11 также участвует в модулировании E-cadherin-обеспечиваемой клеточной слипчивости путем регуляции динамики Rab5-обеспечиваемого эндоцитоза cadherin и рециклинга в мембрану (Ulrich et al. 2005; Witzel et al. 2006; Ogata et al. 2007). Sfrp5 может локально репрессировать эту активность и замедлять циклические изменения cadherin в поверхностных клетках, приводя к усилению слипчивости клеток и делая возможным образование слипчивых соединений. Wnt11/Fz7 также может предавать сигналы посредством PKC, чтобы способствовать поведению тканевого разделения (Winklbauer et al. 2001) и, следовательно, Sfrp5 может увеличивать адгезию между поверхностными клетками и глубокой энтодермой после закрытия бластоцеля. Также возможно, что Sfrp5 не полностью ингибирует передачу сигналов Wnt11, а скорее ограничивает её, чтобы генерировать локальный концентрационный градиент Wnt активности в поверхностных клетках. В этом случае, Sfrp5 может ограничивать Wnt11-индуцируемое накопление Fz на будущей базальной стороне поверхностных клеток, это может усиливать существующие контакты клеток на этой поверхности (Witzel et al. 2006) и тем самым инициировать апикально-базальный склон. Также возможно, что Sfrp5 действует опосредованно путем репрессии транскрипции некоторых Wnt11/JNK/AP1 генов мишеней (хотя это вряд ли возможно, т.к. репрессия ROCK или PKC устраняет sfrp5-MO фенотип, но не снижает активности AP1). Наконец, возможно, что ряд таких механизмов кооперирует, чтобы создать эпителий передней кишки.