Посещений:
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ГРАДИЕНТ

RanGTP

The RanGTP gradient - a GPS for the mitotic spindle
Petr Kalab and Rebecca Heald
Journal of Cell Science 121. 1577-1586 Published by The Company of Biologists 2008 doi:10,1242'ics,0CS959

The GTPase Ran has a key role in nuclear Import and export, mitotic spindle assembly and nuclear envelope formation. The cycling of Ran between its GTP- and GDP-bound forms is catalyzed by the chromatin-bound guanine nucleotide exchange factor RCC1 and the cytoplasmic Ran GTPase-activaring protein RanGAP. The result is an intracellular concentration gradient of RanGTP that equips eukaryotic cells with a 'genome-positioning system' (GPS). The binding of RanGTP to nuclear transport receptors (NTRs) of the importin p superfamily mediates the effects of the gradient and generates further downstream gradients, which have been elucidated by-fluorescence resonance energy transfer (FRET) imaging and computational modeling. The Ran-dependent GPS spatially directs many functions required for genome segregation by the mitotic spindle during mitosis. Through exportin 1, RanGTP recruits essential centrosome and kinetochore components, whereas the RanGTP-induced release of spindle assembly factors (SAFs) from importins activates SAFs to nucleate, bind and organize nascent spindle microtubules. Although a considerable fraction of cytoplasmic SAFs is active and RanGTP induces only partial further activation near chromatin, bipolar spindle assembly is robustly induced by cooperativity and positive-feedback mechanisms within the network of Ran-activated SAFs. The RanGTP gradient is conserved, although its roles vary among different cell types and species, and much remains to be learned regarding its functions.


Рис.1.  |  Network of interactions and reactions in the Ran pathway and the downstream cascade of gradients


Рис.2.  | Network of interactions and reactions in the Ran pathway and the downstream cascade of gradients


Рис.3.  | Mitotic importin ? cargo gradients scale with the size of the mitotic spindle.

Табл.1 Functions and interactions of RanGTP-regulated NTR cargos

Ras-родственная GTPase Ran контролирует многие аспекты компартментализации генома в ядрах эукариот, включая регуляцию нуклео-цитоплазматического транспорта и образование ядерной оболочки, а также сегрегацию геномов в дочерние клетки с помощью митотического веретена (Clarke and Zhang, 2004: Goodman and Zheng, 2006; Pemberton and Paschal, 2005; Terry et al.. 2007). Переход Ran между её GTP- и GDP-связанными формами контролируется с помощью пары изощренных Ran-специфических регуляторов с разными локализациями: Ran's guanine nucleotide exchange factor (GEF) regulator of chromatin condensation 1 (RCC1) импортируется в ядро и соединяется с хроматином, тогда как её GTPase-activating protein RanGAP является цитоплазматическим. RanGAP ускоряет гидролиз GTP с помощью очищенной Ran в 105-раз, а RCC1 увеличивает скорость GTP-for-GDP обмена на Ran с помощью, по-видимому, того же самого фактора in vitro (Klebe et al., 1995). Локализация её регуляторов, следовательно, динамически регулируется с помощью Ran's заряда нуклеотида гуанина (guanine-nucleotide charge) - RanGTP образуется с более высокой скоростью вокруг хромосом, чем на периферии клетки, где происходит большая часть гидролиза GTP на Ran. Как следствие, ограниченный диффузией градиент RanGTP окружает хромосомы в клетках метазоа, которые подвергаются открытым митозам вследствие разрыва ядерной оболочки, и крутой градиент RanGTP существует поперек ядерной оболочки во время интерфазы (Hetzer et al., 2002). Поскольку концентрация RanGTP увеличивается вблизи хроматина, то такой градиент можно сказать действует как 'genome-positioning system' (GPS).
Функции Ran обеспечиваются благодаря связыванию RanGTP с nuclear transport receptors (NTRs) из сверхсемейства importin β (Mans et al., 2004; Pemberton and Paschal, 2005). NTRs являются структурно отличающимися белками, которые ответственны за Ran-регулируемый транспорт белков и некоторых классов РНК посредством канала ядерных пор (Conti et al., 2006; Mans et al., 2004: Rodriguez et al., 2004; Stewart, 2007). NTRs классифицируются как или импортины или экспортины в заивисимости от того, их груз импортируется или экспортируется из ядра. Для простоты термин 'груз' мы будем использовать здесь для любой молекулы или комплекса, взаимодействующих с NTRs, которые регулируются с помощью связывания RanGTP (Table I). Соединение RanGTP в ядре с импортинами диссоциирует комплексы ядерного импорта, которые содержат груз, содержащий nuclear localization signal (NLS), в результате происходит накопление в ядре грузов. Связывание с RanGTP необходимо для стабилизации взаимодействия экспортинов с их грузами, содержащими nuclear export signal (NES). После вступления в цитоплазму комплекс распадаетсяы благодаря гидролизу GTP на Ran, это стимулируется с помощью RanGAP (Weis. 2003).
Реакции сборки и разборки RanGTP-градиентом-регулируемых NTR-cargo-комплексов продолжаются и после разрыва ядерной оболочки у Metazoa и осуществляют важные митотические роли. В работе рассматривается вопрос, как RanGTP градиент генерируется в митотических клетках и как он участвует в сборке веретена за счет пространственно управляемой активности и/или локализации spindle assembly factors (SAFs) и митотических регуляторов (Table I). Относительной функций Ran в митотическом checkpoint мы рекомендуем недавние обзоры (Dasso, 2006; Goodman and Zheng, 2006).

Binding of RCC1 to chromatin drives RanGTP-gradient formation


RCC1 соединяется непосредственно с dsДНК посредством его необычно преобразованного N-терминального хвоста (в котором N-терминальный serine или proline остаток метилирован) (Chen et al., 2007) и с гистонами H2A или H2B на нуклеосоме (Nemergut et al., 2001) с помощью соcеднего домена (Hutchins et al.. 2004; Li and Zheng, 2004a). Оба способа взаимодействия RCC1-chromatin необходимы для корректной сборки веретена в клетках культуры ткани (Chen et aL 2007; Hutchins et al., 2004; Li and Zheng, 2004a) и возможно действуют одновременно, чтобы усилить взаимодействие RCC1 с хроматином во время реакции замены нуклеотида (Chen et aL, 2007). Ran соединяется непосредственно с гистонами H3 и H4 на хроматине (Bilbao-Cortes et al, 2002), способствуя его взаимодействию с RCC1. Fluorescence recovery after photobleaching эксперименты на живых клетках показали, что кооперативное связывание RanGDP и RCC1 с хроматином сопровождается высвобождением RanGTP после завершения GDP/GTP обмена (Li and Zheng, 2004b), в результате увеличивается высота пика градиента RanGTP и происходит его фокусирование в тонком объеме интерфейса хроматина и цитоплазмы.
Интересно, что гистон связывающий домен RCC1 перекрывается с его NLS, который распознается с помощью комплекса между importin α3 и importin β, который импортирует RCC1 в ядро во время интерфазы. В митозе связанные importins могут блокировать взаимодействие между RCC1 и хроматином в отсутствие митотической cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1)-зависимого фосфорилирования серинового остатка, который соседствует с NLS (Hutchins et aL 2004; Li and Zheng, 2004a). Однако клетки человека экспрессируют три изоформы RCC1 с вариациями их N-хвостов, это делает совершенно различной регуляцию с помощью фосфорилирования и импортинов. Только RCC1γ является субстратом для митотических киназ, но он соединяется недостаточно хорошо с importins; напротив, RCC1α не фосфорилируется митотически и хорошо связывается с importins, показывая тем самым, что эти две изоформы могут быть специализированы для митотической и интерфазной функций соотв. (Hood and Clarke, 2007). Кроме того, все изоформы экспрессируются в комплексе тканеспецифическим образом (Hood and Clarke, 2007).

Cytoplasmic RanGAP catalyzes the conversion of RanGTP to RanGDP


После катализируемой RCC1 нуклеотидной замены, RanGTP, который диффундирует с хроматина, может или быстро превратиться в RanGDP с помощью RanGAP или соединиться с многочисленными NTRs в цитоплазме, RanGTP, который соединяется с NTR, защищен от RanGAP до тех пор, пока он не будет высвобожден с помощью белков, которые содержат Ran-binding domain (RBD) (Bischoff and Gorlich, 1997), это подставляет его под RanGAP-катализируемый GTP гидролиз. Большая фракция цитоплазматической RanGTP, которая выявляется с помощью моноклональных антител, фиксирована в митотических клетках (Ciciarello et al., 2004; Tedeschi et al., 2007) возможно соответствует NTR-связанной форме. Клетки человека обладают двумя RBD белками: малым цитоплазматическим белком RanBP1 и крупным nucleoporin RanBP2 (Nup358), который содержит 4 RBDs. В клетках млекопитающих фракция RanBP1 тесно ассоциирует с центросомами (Guarguaglini et al., 2000), тогда как фракция RanBP2 обнаруживается на микротрубочках веретена и кинетохорах в комплексе с SUMOylated RanGAP (RanGAP-SUMO) (Joseph et al., 2004; Salina et al, 2003). Митотические дефекты, которые возникают в результате RNA interference (RNAi)-обусловленной супрессии RanBP1 (Tedeschi et al, 2007) и RanBP2 (Salina et al., 2003) непохожи, это указывает на то, что они обладают специализированными митотическими функциями. Отделение RanGTP от importin β с помощью RanBP1 ускоряется с помощью importin α (Bischoff and Gorlich, 1997), это, по-видимому, увеличивает шансы Ran-recycling функции немногочисленных RBD белков. Итак, эти RanGAP кофакторы являются существенными для генерации динамических Ran-NTR взаимодействий. Упрощенная сеть митотических Ran-регулируемых реакций суммирована на Fig. 1A.

Modeling and visualization of mitotic RanGTP-regulated gradients


Движущей силой Ran-регулируемых событий в митозе является концентрационный градиент RanGTP в её свободной (несвязанной) форме, который предопределяется тремя параметрами: загрузкой Ran с GTP с помощью связанного с хроматином RCC1, диффузией RanGTP в цитоплазму, и превращением RanGTP в RanGDP с помощью RanGAP или связывание RanGTP с лигандами, что включает обилие NTRs. Успехи в оформлении и усовершенствовании fluorescent resonance energy transfer (FRET) репортеров для состояния Ran нуклеотидов предоставили прямые доказательства, что RanGTP концентрационный градиент существует и действует при сборке митотического веретена (Caudron et al, 2005; Kalab et al., 2006; Kalab et al., 2002; Li and Zheng, 2004a). Копьютерные модели системы Ran-NTR помогли этому успеху (Caudron et aL, 2005: Gorlich et aL, 2003; Kalab et aL, 2006; Smith et al., 2002). Математическая модель, которая предполагает поляризованное пространственное распределение RanGAP и RCC1 и свободную диффузию минимального набора Ran-NTR реакций в пространстве, предсказывает, что круто снижающийся градиент RanGTP, формируемый вокруг митотического хроматина и индуцирует более мелкий градиент грузов, которые высвобождаются из importin β посредством связывания с RanGTP (Bastiaens et al., 2006: Caudron et aL, 2005). Градиент RanGTP-importin-β комплексов, как полагают, диффундирует ещё дальше в цитоплазму, чем высвободившиеся грузы, в этой модели. Наконец, RanGTP-importin-β комплексы или диссоциируют или взаимодействуют с RanBP1, давая градиент importin-β-RanGTP-RanBP1 (Bastiaens et al., 2006; Caudron et al., 2005), который рассеивается с помощью RanGAP-катализируемого гидролиза RanGTP. Степень градиентов (т.е., расстояние от хроматина, на которое концентрация данного вида молекул снижается до постоянного уровня) определяется по реакциям, которые создают и рассеивают индивидуальные виды молекул и по их скорости диффузии (Fig. 1B).
Разнообразные эксперименты с использованием FRET подтверждают приведенную выше модель упорядоченных градиентов. Хотя нет прямых доказательств свободных RanGTP, но FRET сенсор, который отслеживает взаимодействия между RanGTP и RBD, был создан за счет фланкирования RBD с помощью YFP (FRET acceptor) и CFP (FRET donor), и был назван YRC (YFP-RBD-CFP) (Kalab et al., 2002), В присутствии RanGDP, YRC остается несвязанным и испускает FRET сигнал. Если YRC соединяется с RanGTP, то N- и C-концы RBD раздвигаются (Vetter et al., 1999) и FRET сигнал снижается. Наблюдение за YRC, добавленного к экстрактам яиц Xenopus laevis выявило градиент low-FRET YRC, окружающий митотические хромосомы. который делает видимым градиент RanGTP-RBD (Kalab et al., 2002). Второй FRET сенсор, который был описан для RanGTP-индуцированного высвобождения importin-α-importin-β грузов, был инспирирован с помощью структуры N-терминального importin-β-binding (IBB) домена импортина α, связанного с importin β (Cingolani et al., 1999), при этом IBB домен ведет себя как importin β груз. Т.к. структура предсказуема, то зонд importin β груза, состоящий из IBB, фланкированного YFP и CFP, обнаруживает низкий FRET сигнал, если связан с importin β и высокий FRET сигнал после соединения RanGTP с importin β, высвобождающего зонд. Хроматин в митотических веретенах, собранных в яйцевых экстрактах Xenopus laevis окружен градиентом груз-зонд, дающий высокий FRET сигнал, который делает видимым градиент importin-α;-importm-β грузов, которые высвобождаются за счет митотического градиента RanGTP (Kalab et al.. 2002). Когда градиент груза устраняется добавлением мутантного importin β - дефицитного по связыванию RanGTP - то экстракты сохраняют RanGTP-RBD градиент вокруг хроматина, хотя веретено быстро разбирается. Если RCC1 оказываля ингибированным с помощью доминантно негативной мутации Ra, то оба градиента, также как и веретено были разрушены (Kalab et al., 2002). Градиент RanGTP, следовательно, индуцирует 'нижестоящие' градиенты, включая, таковой высвободившегося importin-α-importin-β грузов, который существенен для формирования веретена.
Градиент RanGTP-RBD, который обнаруживается с использованием YRC, распространяется ~17 µm от хроматина (P.K., unpublished), по сравнению с градиентом ~25 µm высвобожденных importin-α-importin-β грузов (Kalab et al., 2006; Kalab et al., 2002). FRET между флюоресцентным Ran и importin β , добавленный к митотическим экстрактам яиц X. laevis выявляет градиент RanGTP-RanBP1-importin-β , который достигает расстояния до 30-35 µm от хроматина (Caudron et al., 2005). Наблюдаемые размеры градиентов, следовательно, согласуются с порядком, описанным математической моделью (Caudron et al., 2005) (Fig. 1B). Эти примеры иллюстрируют, как комбинация количественных imaging и моделирований оказывается существенной для нашего понимания функций RanGTP градиента.
Большинство оставшихся вопросов также может быть разрешено с помощью комбинации этих подходов. Напр., в митотических клетках млекопитающих, SUMO-модифицированный RanGAP в комплексе с RanBP2 соединяется с микротрубочками веретена и концентрируется на кинетохорах (Joseph et al.. 2002; Salina et al., 2003), где он участвует в прикреплении микротрубочек (Amaoutov et al., 2005; Joseph et al., 2004). Однако неизвестно, какова роль RanBP2-RanGAP-SUMO комплекса вo взаимодействиях кинетохор с микротрубочками, использующих любое локальное увеличение GTP гидролиза на Ran благодаря локальной концентрации RanGAP или некоторой др. активности, ассоциированной с комплексом. Определение функциональной или биохимической активности этого комплекса и использование пространственного моделирования, а также высокого разрешения картин FRET репортеров, д. помочь решить этот вопрос.

RanGTP regulates recruitment of NTR cargos to the mitotic spindle


Более 20 NTRs присутствует у человека (Pemberton and Paschal, 2005), но только 4, как известно, регулируют функцию белков груза в митотическом веретене (importin α1, importin β. importin 7 и exportin 1; see Table 1). RanGTP регулирует активность NTRs, чтобы обеспечить рекрутирование растворимых цитоплазматических грузов на структуры митотического веретена с помощью двух разных механизмов, которые не являются взаимоисключающими. В первом механизме RanGTP-индуцированное высвобождение грузов от importins позволяет грузам ассоциировать с веретеном и функционировать в качестве SAFs или непосредственно или посредством др. SAFs. При втором механизме, соединение грузов с NTRs необходимо для рекрутирования грузов на специфический сайты внутри аппарата митотического веретена. Напр., RanGTP-зависимые exportin 1 комплексы, высвобождаются на центросомы, кинетохоры и центромеры, тогда как соединение с importin-α-importin-β комплексами способствует загрузке chromokinesin Kid на митотические хромосомы (Tahara et aL. 2008). В то же самое время, связывание Kid с микротрубочками веретена обеспечивается с помощью его RanGTP-индуцированного высвобождения от importins ( Tahara et al.. 2008; Trieselmaim et al., 2003), указывая тем самым, что динамика пространственной регуляции обоих механизмов с помощью RanGTP градиента существенна для функции Kid в управляемом микротрубочками перемещении плеч хромосом.

The function of importins in mitotic spindle assembly


Все известные RanGTP- и importin-регулируемые митотические функции используют importinβ (Table 1). Эта S-образная молекула состоит из HEAT повторов и может подвергаться существенным конформационным изменениям, согласующимися с их разнообразными грузами и быстрым высвобождением их от связывания с высоким сродством с RanGTP (Stewart, 2006: Stewart 2007). Importin β ассоциирует с митотическим веретеном в клетках культуры тканей млекопитающих (Ciciarello et al. 2004; Fan et al.. 2007) , а центросомные дефекты индуцируемые с помощью избыточной экспрессии importin β (Ciciarello et al., 2004), которые могут отражать инактивацию нескольких разных грузов, которые локализуются на полюсах веретена, включая Crumbs3 (CRB3) (Fan et al, 2007), белок, который функционирует в первичных ресничках и в слипчивости центросом. В дополнение к непосредственной доставке грузов, importin β также ассоциирует с грузами посредством адапторных белков, включая NTRs importin α и importin 7 (Fried and Kutay, 2003) и nucleoporin Nup98, который стабилизирует ассоциацию importin β c Rae1, т.е. SAF грузом, который функционирует в рибонуклеопротеиновых комплексах (Blower et al., 2005).
Многие митотические грузы взаимодействуют с importin β посредством importin α. C-конец importinα содержит два XLS cargo-связывающих сайта, которые секвестрируются с помощью его N-терминального IBB домена, независимо от того связан ли IBB домен с importin β (Cingolani et al., 1999). Существует несколько струткурно и функционально специализированных изоформ importin α у животных (Quensel et al., 2004). Единственные гомологи наиболее консервативной изоформы importin α1 (KNPA2 у человека) (Mans et al., 2004) были идентифицированы в качестве регуляторов сборки митотического веретена (Askjaer et al., 2002; Mason et al., 2002; Nachury et al., 2001), и они могут быть представлены изоформой, которая специализируется на обеспечении пролиферации эмбриональных и недифференцированных клеток с помощью кае её интерфазной (Yasuhara et al., 2007), так и митотической функции (Askjaer et al, 2002). В клетках HeLa уровни мРНК importin α1 драматически увеличиваются во время митоза, подобно увеличению cyclin В и отлично от увеличения др. importin α изоформ (Whitfield et al., 2002), это указывает на ключевую роль этого грузового адаптора в митозе.
Разнообразный набор импортиновых грузов, следовательно, рекрутируется на митотическое веретено посредством Ran GPS (Table 1). Помимо SAF белков, эти грузы включают небелковые компоненты, такие как РНК в Rae1-рибопротеиновом комплексе, рассмотренные выше (Blower et el., 2005), а также мембраны, ассоциированные с ядерным lamin В (Travis, 2007; Tsai et al., 2006). Т.о., система Ran-NTR интегрирует множество различных клеточных факторов внутри веретена.

The mitotic importin-β-cargo gradient - not an on-off switch


Наипростейшая модель регуляции сборки митотического веретена с помощью RanGTP градиента предсказывает, что SAF грузы ингибируются путем связывания с importins в цитоплазме и активируются вокруг хроматина с помощью их RanGTP-индуцированного высвобождения (Dasso, 2001; Weis, 2003). Более уточненная модель была предложена, согласно которой индивидуальные процессы сборки веретена локально активируются за счет специфических пороговых концентраций RanGTP. В этой модели, нуклеация микротрубочек, которая нуждается в высокой концентрации RanGTP происходит вблизи хроматина, тогда как центросомные микротрубочки, которые располагаются дальше, д. быть стабилизированными при более низких уровнях RanGTP (Bastiaens et al.. 2006; Caudron et al., 2005).
Однако количественный FRET imaging importin-β-cargo сенсора в живых клетках HeLa обнаруживает более сложный сценарий (Kalab et al., 2006). Во-первых, большинство importin β грузов (~70%), как было установлено, свободно вступает в митотическую цитоплазму, указывая, что цитоплазматические SAFs не полностью ингибированы. Во-вторых, лишь~15% грузов высвобождается вокруг хромосом, указывая, что RanGTP градиент локально активирует лишь фракцию SAFs. Однако титрация RanGTP в митотических яйцевых экстрактах X. laevis выявила, что увеличение высвобождения груза менее чем на 10% индуцирует полимеризацию микротрубочек (Kalab et al., 2006), указывая тем самым, что низкий уровень локальной активации SAF является физиологически подходящим для митотических клеток. Эти наблюдения ставят ряд вопросов, а именно: что препятствует полимеризации микротрубочек по всей митотической цитоплазме (которая содержит активные SAFs), и как частичная активация SAFs вокруг хроматина индуцирует сборку веретена?

Cooperativity and positive-feedback mechanisms among SAFs drive switch-like activation of spindle assembly by the Ran GPS


RanGTP-регулируемые механизмы функционируют в контексте др. митотических событий и активностей, чтобы способствовать образованию и функции веретена. Дестабилизация микротрубочек в начале митоза существенна для разборки интерфазного устройства и позволяет активностям. ассоциированным с хромосомами, способствовать морфогенезу веретена (Zhai et al., 1996). В целом, эти активности, дестабилизирующие микротрубочки, создают порог активации SAF, необходимый для генерации микротрубочек в митотической цитоплазме.
Пространственный сигнал для сборки веретена, обеспечиваемый с помощью градиента RanGTP умножается с помощью трех основных факторов. Во-первых, после разрыва ядерной оболочки основные места закладывания (nucleation) микротрубочек на центросомах, кинетохорах и хроматине расположены на пике градиента RanGTP. Во-вторых, синергичность и механизмы позитивной обратной связи в митотической Ran сети стимулируют сборку микротрубочек способом. сходны с переключением. В-третьих, градиент RanGTP действует кооперативно с др. базирующимися на хроматине путями сборки веретена, включая установление градиентов фосфорилирования дестабилизаторов микротрубочек stathmin (Op 18) и kinesin 13 (MCAK/XKCM1) с помощью киназы Aurora В (Kelly et al., 2007; Niethammer et al., 2004; Zhang et al., 2007) (Fig. 2).
Все RanGTP-регулируемые SAFs действуют на микротрубочки, всё же их функции в сборке веретена различны и часто зависят одна от др. так, путем нуклеации микротрубочек SAF, такой как TPX2, продуцирует субстраты для др. грузов и ассоциированных факторов, которые стабилизируют микротрубочки, включая TACC/maskin, NuSAP, HURP и XMAP215, а также для организующих микротрубочки kinesin 5, kinesin 10 и kinesin 14 (Eg5, Kid and XCTK2, соотв.: see Table 1). Некоторые из этих взаимодействий способствуют локализации и активации киназы Aurora A на полюсах веретена, которые в свою очередь фосфорилируют некоторые SAFs (Table 1).
Всё увеличивающаяся активация множественных SAFs может, следовательно, индуцировать сборку подсистем веретена возрастающей сложности: микротрубочки, следующие за звездочками и затем полюсами веретена, их формирование невозможно за счет индивидуальных SAFs, действующими в изоляции (Fig. 3). Эти высоко кооперативные взаимодействия возможно усиливаются за счет ассоциации SAFs в комплексы, которые могут одновременно поставлять множественные активности к полимеризующимся микротрубочкам. Напр., TPX2 формирует комплекс с XRHAMM, BRCA1/BARD1 и NuMA (Joukov et al., 2006), NuMA взаимодействует с Rae1 (Wong et al., 2006), а TACC соединяется с XMAP215 (Kinoshita et al., 2005; O'Brien et al.T 2005: Peset et al., 2005). Удивительно, комплекс, содержащий HURP, XMAP215, Eg5, TPX2 и Aurora A был выделен из яйцевых экстрактов X. laevis (Koffa et al., 2006). Т.о, как только микротрубочки генерируются в этой системе, то они предоставляют субстрат для многих SAFs, большинство из которых пошагово активируется с помощью градиента RanGTP. Возникающий в результате каскад RanGTP-регулируемых реакций ведет к сборке веретена.
Достаточность RanGTP, вместе с активностью Aurora A , для формирования полюсов веретена продемонстрирована на яйцевых экстрактах X. laevis, в которых Aurora-A-покрытые кусочки индуцируют образование биполярного веретена с частицей на каждом полюсе, если добавлена RanGTP (Tsai and Zheng, 2005). Фосфорилирование Aurora A способствует образованию полюсов веретена за счет связывания HURP с микротрубочками (Wong et al.. 2008), за счет ингибирования ubiquitylation активности BRCA1 (Sankaran et al., 2007) и за счет усиления роста микротрубочек на полюсах веретена с помощью TACC/maskin; (которое возникает благодаря его взаимодействию с XMAP215) (reviewed in Barr and Gergely, 2007). Доступность TACC/maskin как субстрата также зависит от его высвобождения от importins (Albee et al, 2006), это умножает локальный эффект RanGTP. RanGTP-индуцированное высвобождение от importin β также необходимо для функции Cdk11 в стабилизации полюсов веретена (Yokoyama et al.. 2008), которое может быть необходимым для эффективного рекрутирования Plk1 и Aurora A на центросомы (Pctretti et al., 2006), Наконец, Aurora A является существенным компонентом упомянутого выше HURP комплекса. который необходим для образования полюсов митотического веретена в яйцевых экстрактах X. laevis (Koffa et al., 2006). Неясно, существует ли этот комплек м в соматических клетках, где HURP, как полагают, действует прежде всего на взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами (Sillje et al., 2006: Wong and Fang. 2006). Однако , HURP локализуется в центрах прометафазных звезд микротрубочек и перемещается на микротрубочки, соседствующие с хроматином, в метафазных клетках только после достижения биполярности (Sillje et al.. 2006; Wong and Fang. 2006). Итак, эта сеть RanGTP-регулируемых синергичных взаимодействий и механизмов позитивной обратной связи способствует переходу микротрубочек веретена из прометафазных в метафазные (Fig. 2).

Mitotic functions of exportin 1


В противоположность высвобождению грузов от импортинов с помощью механизма, зависящего от градиента RanGTP, митотические функции, которые обеспечиваются с помощью RanGTP-exportin, являются следствием связывающих взаимодействий, которые направляют ключевые компоненты на аппарат митотического веретена. Будучи сформированными RanGTP-exportin грузовые комплексы нуждаются в RBD белке и RanGAP для разборки (Bischoff and Gorlich, 1997) и поэтому могут диффундировать далеко от хроматина, пока не осуществится гидролиз RanGTP, так как это происходит RanGTP-importin-β комплексах (Caudron et al., 2005) (Fig. IB). Поэтому возможно, что не образуются достоверные концентрационные градиенты этих комплексов в соматических клетках и хотя RanGTP необходима для образования комплексов, её градиент может не иметь значения. Вместо этого exportin I использует специфические для груза механизмы доставки своих митотических грузов на кинетохоры, центромеры и центросомы (Fig. 3).
На кинетохорах, exportin 1 действует как 'ловушка', готовая присоединить груз, состоящий из RanBP2-RanGAP-SUMO комплекса. Фракция exportin 1 соединяется с кинетохорами благодаря своей ассоциации с Nup107-Nup160 nucleoporin комплексом (Zuccolo et aL, 2007) RanGTP- и груз-независимым способом (Arnaoutov et aL, 2005), и затем рекрутирует RanBP2-RanGAP-SUMO, производственный комплекс, который необходим для корректных взаимодействий кинетохор и микротрубочек. Образование этого крупного кинетохорного комплекса нуждается в функции exportin, RanGTP, микротрубочках и SUMOylation RanGAP (Arnaoutov et aL, 2005). Нарушение образования RanBP2-RanGAP-SUMO комплекса также как и его рекрутирование на кинетохоры ведет к дефектам кинетохоных волокон, неправильному расположению и неправильной сегрегации хромосом (Arnaoutov el aL. 2005: Joseph et aL, 2004; Salina et aL, 2003).
Exportin функционирует также в центромерном хроматине, который лежит в основе кинетохор, где он, как было установлено, способствует локализации survivin (Knauer et aL, 2006), анти-апоптического фактора (Allien, 2006) и компонента chromosome passenger complex (CPC), который необходим для биориентации веретена и содержит Aurora B, INCENR и borealin (Dasra у X. Iaevis) в дополнение к survivin (Ruchaud et aL, 2007). Survivin, по-видимому, соединяется с центромерами после того как он разгружается с exportin 1 (Knauer et aL, 2006). Контролируется ли локализация всего CPC с помощью Ran посредством exportin-1-survivin соединения, неизвестно, но в митотических яйцевых экстрактах X. Iaevis CPC соединяется с хроматином посредством Dasra независимо от Ran (Kelly et aL, 2007).
Exportin 1 также ассоциирует с митотическими хромосомами (Wang et aL, 2005), где он, как полагают, соединяется с nucleophosmin I (NPM1) (Budhu and Wang, 2005; Wang et aL. 2005), законсервированным ядрышковым белком. Как NPM1 функционирует на центросомах неясно, хотя эксперименты на клетках культуры ткани показали, что их NES-зависимая локализация на центросомах необходима для целостности центросом (Wang et aL. 2005). также неясно существует ли какая-либо связь между NPM1, exportin и пулом Ran, который как было установлено ассоциирует с AKAP 450 центросом (Keryer et aL, 2003).

Species- and cell-type-specific functions of the Ran GPS in mitosis


Вклад Ran GPS в митозы является организм- и клеточно-специфическим, это не удивительно, учитывая эволюционное разнообразие NTRs и огромные различия в клеточных размерах, которые накладывают физические ограничения на сборку веретена (Fig. 3) Крупные митотические веретена, собираемые в яйцевых экстрактах Х. Iaevis, разрушались при добавлении доминантно-негативного importin β мутантов (Kalab et aL, 2002; Nachury et aL, 2001), но те же самые белки, микроинъецированные в клетки HeLa не нарушают веретен, если они уже сформированы (Kalab et aL, 2006). Функции exportin, по-видимому, также варьируют, поскольку exportin-1-RanBP2-RanGAP-SUMO кинетохорный комплекс обнаруживается в клетках млекопитающих, но отсутствует в кинетохорах яйцевых экстрактов и клеток культуры тканей X. laevis (Arnaoutov and Dasso, 2005). Существуют различия даже в потребности в градиенте Ran между последовательными мейотическими клеточными делениями в ооцитах мышей. При мейозе I веретена могут оправляться от RCC1 ингибирования, но при мейозе II веретена стираются от того же самого воздействия (Dumout et aL, 2007; Schuh and Ellenberg, 2007). Следовательно, обобщения относительно функций митотической Ran GPS необходимо делать с осторожностью.
Однако некоторые из ключевых механизмов, с помощью которых действует градиент RanGTP, чтобы обеспечить сборку веретена законсервированы, даже среди организмов, которые подвергаются закрытым митозам, таких как дрожжи. Напр.. у Schizosaccharomyces pombe градиент RanGTP необходим для импорта Alp7 (TACC/maskin гомолога) в ядро в начале митоза. Alp7 , как полагают, импортируется совместно с Alp14 (гомолог XMAP215) и комплекс концентрируется на микротрубочках, чтобы осуществить важную функцию сборки биполярного веретена (Sato and Toda. 2007). Возникающая консервативная парадигма заключается в том, что клетки подвергаются открытому или закрытому митозу в зависимости от Ran-регулируемых SAFs, концентрирующихся на микротрубочках внутри пика градиента RanGTP , чтобы построить биполярное веретено.
Промежуточные образования между диффузией ограниченным градиентом RanGTP в митотических клетках и дискретным градиентом RanGTP поперек ядерной оболочки могут быть обнаружены в синтициальных эмбрионах Drosophila melanogaster. В отличие от меченных Ran в яйцах X. laevis eggs, эмбрионах морских звезд и клетках тканевой культуры млекопитающих (Hmkle et aL, 2002), GFP-Ran концентрируется внутри митотических веретен в общей синцитиальной цитоплазме (Triesehnann and Wilde, 2002), указывая на присутствие некой формы барьера для диффузии, несмотря на отсутствие ядерной оболочки.
Новые функции градиента RanGTP были открыты, это ещё больше расширяет их роли в клеточных делениях. Пост-метафазная задача для Ran в формировании midbody ,быа описана для эмбрионов D. melanogaster (Silverman-Gavrila and Wilde, 2006). У мышей в мейотических ооцитах градиент RanGTP маркирует места на плазматической мембране, где вытолкнуто первое полярное тельце (Deng et aL, 2007), указывая тем самым, что помимо управления сборкой веретена вокруг хромосом, дальнодействующая Ran GPS передает сигналы о положении веретена мейотической клетке. RanGTP также предопределяет размер продуктов мейоза I (Dumont et al., 2007). Участвует ли Ran в позиционировании веретена и асимметрических клеточных делениях в соматических клетках, неизвестно.

Are intracellular and embryonic morphogen gradients similar?


В синтициальной бластодерме эмбрионов D. melanogaster концентрационный градиент of bicoid управляет образованием передних и позицией экспрессии задних генов (Driever et al.. 1989; Driever and Nusslein-Volhard, 1988; Gregor et aL 2007a: Gregor et al., 2007b; Lander, 2007). Как же градиент RanGTP, который наз. 'внутриклеточным морфогеном' (Macara, 2002), сравнить с градиентом эмбрионального морфогена? Пик цитоплазматического уровня митотического importin-β-cargo градиента в клетках HeLa варьирует от клетки к клетке, хотя амплитуда градиента более постоянна (Kalab et al., 2006). Напротив градиент bicoid может создавать точные локальные концентрации морфогена для индивидуальных синцитиальных ядер (Gregor et al.. 2007a; Gregor et al., 2007b). Чтобы достичь соотв. локального порога концентрации высвобожденных importin-β-регулируемых SAFs, клетки д. тонко контролировать экспрессию всех NLS-содержащих белков - манящая потребность, учитывая стохастическую природу генной экспрессии в индивидуальных клетках ( Kaufmann and van Oudenaarden, 2007). Однако в эмбрионах, в которых доза гена bicoid была экспериментально повышена в 6 раз, то картирование судеб клеток выявляло сдвиг в обратном направлении, но эмбрионы развивались нормально (Driever et al., 1989; Driever and Nusslein-Volhard, 1988). Образование головы эмбриона, следовательно, в общем-то нечувствительно к концентрации морфогена, это возможно аналогично способности градиента RanGTP управлять сборкой веретена несмотря на флюктуации в экспрессии белков.

Ran and cancer


Список митотических мишеней для Ran напоминает 'Who's Who' генов, которые являются объектом частых мутаций, перестроек или делеций при раке (BRCAI, NPM1, survivin) или которые высоко экспрессируются при некоторых раках (NPM1, HURT, TPX2, Aurora A, TACC3, survivin, RHAMM; see Table 1). Хотя работают, по-видимому, разные механизмы, выявляется общая тема, такая как неправильная регуляция в раковых клетках Ran-регулируемой сети, которая способствует сборке полюсов веретена. Все 5 человеческих гомолога X. laevis HURP комплекса ( Eg5, hTOG/XMAP215, TPX2, HURP, Aurora A) (Koffa et al., 2006; Sillje et al., 2006) экспрессируются скоординированно др. с др. и с митотическими маркерами в клетках, происходящих от 22 разных опухолей человека (Tsou et al., 2003: Wong and Fang, 2006), показывая, что в некоторых раковых клетках ключевые регулируемые Ran SAFs активируются в то же самое время. Скорее, чем вызывание непосредственно трансформации клеток, Ran-rрегулируемые SAFs вносят вклад в формирование опухолей путем преодоления митотических checkpoints, индуцируя тем самым геномную нестабильность (Castillo et al.. 2007; Maxwell et al., 2008; Raft; 2002: Wong and Fang, 2006). Остается возможным, что анеуплоидия, в свою очередь, индуцирует высокие уровни Ran-регулируемых SAFs, таких как HURP (Wong and Fang, 2006), способствуя пролиферации раковых клеток.
Уровни экспрессии компонентов Ran-пути, по-видимому, важны при раке. Ran и TPX2 были идентифицированы как два из наиболее достоверных примера среди 3700, тестированных с помощью RNAi скрининга на факторы, потеря которых индуцирует гибель опухолевых клеток человека (Morgan-Lappe et al., 2007). Существенно повышенные уровни Ran наблюдались в ряде опухолей человека и в 6 линиях клеток, происходящих от опухолей (включая HeLa) , они содержали Ran в концентрациях во много раз превышающих те, что обнаруживаются в трех нетрансформированных линиях фибробластов человека (Xia et al., 2008). Важно, что супрессия Ran с помощью RNAi делает устойчивыми нетрансформированные клетки, но индуцирует клеточную гибель в линиях раковых клеток. Однако это может быть обращено за счет избыточной экспрессии survivin (Xia et al., 2008), являющимся Ran- и exportin-1-регулируемым анти-апоптическим фактором и митотическим регулятором (Knauer et al., 2006: Knauer ct al., 2007).
Интересно, что большинство Ran-связанных раковых путей, по-видимому, использует importin α1 (KPNA2 у человека), который был идентифицирован как один из трех наиболее часто избыточно экспрессируемых генов в недифференцированных раковых клетках среди 6 типов раковых опухолей (Rhodes et al., 2004). Скорее, чем непосредственная активация SAFs, importin α1, по-видимому, способствует пролиферации недифференцированных клеток путем управления ядерным импортом транскрипционного фактора Oct4 (также известного как Oct3 или POU5F1) (Yasuhara et al., 2007), это ставит вопрос, включают ли транскрипционные мишени Ran-rрегулируемые SAFs. Примечательно, что хотя высокая всеобщая экспрессия importin α1 коррелирует с высоким риском развития рака груди, его накопление в ядре коррелирует с особенно плохим прогнозом (Dahl et al., 2006).

Conclusions


Since its discovery less than a decade ago, studies of the mitotic Ran GPS have provided many important insights into the amazingly complex interactions between mitotic chromosomes and cytoplasmic components during spindle assembly. The well-characterized and tractable components of the Ran-NTR system have served as a powerful discovery tool, enabling the biochemical discovery of mitotic regulators and facilitating the visualization of mitotic chromosome signals. The enzymes that control the Ran nucleotide state are dynamically regulated in space, and the mitotic function of Ran is subject to species- and cell-type-specific variations. Nevertheless, in mitosis, the localized production and diffusion-limited dissipation of the RanGTP signal appears to be conserved, and has similarities to embryonic morphogen gradients.
Until now, much of the research on Ran has relied on meiotic, embryonic and cancer-eel l-bascd systems. It is becoming apparent that the powerful mitotic Ran GPS is characteristic of mitosis in non-differentiated and embryonic cells, where it may underlie their rapid proliferation. Increasing evidence suggests that aberrant or amplified Ran pathways can overwhelm mitotic controls in differentiated cells, thereby contributing to cancer. Important future directions are to investigate the function of the Ran GPS in differentiated somatic cells, and to exploit its role in cancer for the development of novel therapeutics.
Дезинфицирующие средства с моющими свойствами. кирпич хорошая компания. Ученические учебники для 5 класса по природоведению с доставкой в интернет магазине (Москва).
Сайт создан в системе uCoz