Хондроцит-Специфический Нокаут Smad4

Chondrocyte-Specific Smad4 Gene Conditional Knockout Results in Hearing Loss and Inner Ear Malformation in Mice Shi-ming Yang, Zhao-hui Hou, Guan Yang, Ji-shuai Zhang, Yin-yan Hu, Jian-he Sun, Wei-wei Guo, David z. z. He, Dong-yi Han,Wie-yen Young, Xiao Yang Developmental Dynamics 238:1897-1908, 2009. © 2009 Wiley-Liss, Inc.
Smad4 is the central intracellular mediator of transforming growth factor-β (TGF-β) signaling, which plays crucial roles in tissue regeneration, cell differentiation, embryonic development, and regulation of the immune system. Conventional Smad4 gene knockout results in embryonic lethality, precluding its use in studies of the role of Smad4 in inner ear development. We used chondrocyte-specific Smad4 knockout mice (Smad4^Co/Co) to investigate the function of Smad4 in inner ear development. Smad4Co/Co mice were characterized by a smaller cochlear volume, bone malformation, and abnormalities of the osseous spiral lamina and basilar membrane. The development of the hair cells was also abnormal, as evidenced by the disorganized stereoeilia and reduced density of the neuronal processes beneath the hair cells. Auditory function tests revealed the homozygous Smad4^Co/Co mice suffered from severe sensorineural hearing loss. Our results suggest that Smad4 is required for inner ear development and normal auditory function in mammals.	Внутреннее ухо млекопитающих состоит из мембранозного и костного лабиринта. Мембранозный лабиринт образуется эпителиальными клетками, происходящими из слухового пузырька, тогда как костный лабиринт происходит из окружающих мезенхимных клеток, происходящих из мезодермы и нервного гребня. Стенки мембранозного лабиринта дают сенсорный и несенсорный эпителий. Волосковые клетки сенсорного эпителия улитки являются ключевыми клеточными компонентами для поддержания функции слуха и они иннервируются сенсорными нейронами улиткового ганглия. В зрелом внутреннем ухе мембранозный и костный лабиринты разделены с помощью пространства, заполненного перилимфой, жидкостью, которая сходна по составу с спинномозговой жидкостью. При созревании внутренняя граница капсулы слухового аппарата в основном следует за сложным контуром мембранозного лабиринта. Развитие уха млекопитающих использует скоординированную молекулярную трансформацию набора эктодермальных клеток (слуховая плакода) в полностью сформированное ухо. Морфогенез внутреннего уха млекопитающих регулируется взаимодействиями между слуховым эпителием и окружающим его периотической мезенхимой (Frenz and Van De Water, 1991). Во время образования хрящевой отической капсулы сигнальные молекулы, испускаемые слуховым эпителием, влияют на периотическую мезенхиму, чтобы вызывать тканевую индукцию и дифференцировку (Frenz et al., 1992. 1994,1996). Однако отсутствуют строгие доказательства, демонстрирующие, что эти взаимодействия между слуховым эпителием и периотической мезенхимой противоположным образом влияют на развитие слухового сенсорного эпителия или даже на функцию слуха у взрослых млекопитающих. Во время развития внутреннего уха ранней и важной ступенью является конверсия эмбриональных эктодермальных клеток в отические нейросенсорные клетки. При такой трансформации эпителиальных в отические клетки центральным событием во многих клетках, которые индуцируют изменения клеточной судьбы, является регуляция транскрипции посредством передачи сигналов модифицированного bone morphogenetic protein (BMP). BMPs принадлежат к суперсемейству transforming growth factor-β (TGF-β ) и участвуют в регенерации ткани, клеточной дифференцировке и эмбриональном развитии. Функции BMPs в развитии внутреннего уха эмбрионов кур исследовали путем блокирования активности BMPs in vivo, используя птичий ретровирус, кодирующий Noggin, доминантно-негативную или постоянно активную формы рецепторов BMP, кусочки, несущие белок Noggin, и имплантацию клеток, экспрессирующих Noggin (Chang et al., 1999, 2002; Gerlach et al., 2000). Описываемые эффекты были морфологическими аномалиями, ассоциированными с дефектами роста полукружных каналов и ассоциированных с ними сенсорных органов. Chang et al. (2002) сравнивали фенотипы отической капсулы в ухе, инфицированном птичьим ретровирусом, кодирующим или постоянно активную или доминантно-негативную форму Bmp type 1B receptor (Bmpr1b). Эктопическая экспрессия постоянно активного Bmpr1b индуцирует хрящевые выросты, тогда как доминантно-негативная форма вызывает потерю хряща в отической капсуле. Ингибирование формирования хряща также происходит также в ответ на воздействие Noggin, секретируемого ингибитора Bmp (Liu et al., 2003). Кроме того, относительно недавние in vitro эксперименты с избыточной или потерей функции BMP у эмбрионов кур также дали противоречивые результаты относительно роли Bmp4 в формировании волосковых клеток. Несмотря на конфликтующие результаты, эти эксперименты подчеркнули, что передача сигналов BMP является важным элементом регуляции количества и дифференцировки волосковых клеток (Li et al., 2005; Pujades et al., 2006). Передача сигналов BMPs осуществляется посредством Smad сигнального пути (Hawkins et al., 2003). существуют 8 Smad белков, которые могут быть подразделены на три функциональные класса: рецептором регулируемые Smads (Smad1, Smad2, Smad3 и Smad5), Smad ко-медиатор (Smad4) и ингибирующие Smads (Smad6, Smad7 и Smad8). Smad2 и Smad3 отвечают на TGF-β и activin, тогда как Smad1, Smad5 и Smad8 участвуют в сигнальных путях BMP. Рецептором-упорядоченные Smads формируют гетеродимеры с Smad4 и затем транслоцируются в ядро, чтобы индуцировать или репрессировать гены мишени для TGF-β. Анализ мутаций у мышей mice, используя генный таргетинг, выявил множественные важные функции генов Smad в разных процессах развития (Weinstein et al., 2000). Наши предыдущие данные показали, что дефицит Smad5-обеспечиваемой передачи сигналов ведет к апоптозу волосковых клеток, указывая тем самым, что Smad5 является геном, который может быть связан со снижением слуха в старческом возрасте (presbycusis) (Yang et al., 2009). В качестве общего медиатора передачи сигналов transforming growth factor-β /bone morphogenetic protein (TGF-β /BMP), Smad4 экспрессируется повсеместно, напр., в эпифизарной пластинке, хрящевой ростовой пластинке, в коже и сердце. Это указывает на то, что Smad4 может играть важную роль во время развития разных тканей и органов. Однако нокаутные Smad4 мыши погибают на ранних стадиях эмбриогенеза (Sirard et al., 1998; Zhou et al., 2003; Yang et al., 2009), это делает трудным оценку функционального значения Smad4 в органогенезе, особенно в развитии внутреннего уха и слуховой функции. Тканеспецифическая делеция Smad4 начинает обнаруживать её функцию в развитии мозжечка и молочных желез (Liu et al., 2003; Zhou et al., 2003). Мы получили мышей, у которых ген Smad4 был специфически делетирован в хондроцитах в результате скрещивания линии мышей, которая несет Smad4 conditional аллель (Smad4^Co) (Yang et al., 2009) с хондроцит-специфическими Cre (Col2a1-Cre) трансгенными мышами (Li et al., 2005). Здесь мы исследовали влияние генного нокаута Smad4 на развитие внутреннего уха и слух. DISCUSSION Наше исследование показало, что хондроцит-специфический дефицит Smad4 может вызывать онтогенетические аномалии костного лабиринта улитки у мышей. Морфологически это проявляется в аномальном развитии внутренних и наружных волосковых клеток и в аномальных афферентных синапсах волосковых клеток. Фенотипически мыши страдают от тяжелой нейросенсорной потери слуха. Эти результаты указывают на то, что Smad4 является важным для развития внутреннего уха; его дефицит вызывает аномальное развитие внутреннего уха и начало нейросенсорной тугоухости. Chondrocyte-Specifie Smad4 Conditional Knockout Affects Osseous Development in the Cochleae of Mice Фенотипы аномального развития костной улитки, наблюдаемые у Smad4^Co/Co мышей, являются проявлением ключевой роли передачи сигналов BMP в хондрогенезе и эндохондральной оссификации. Обычно BMPs действуют во время раннего развития кости и регулируют форму мезенхимных конденсатов. Они участвуют в индукции мезодермы и детерминации формы кости во время развития костей (Saint-Germain et al., 2004; Tsu-maki and Yoshikawa, 2005). Chang et al. (2002) сравнивали фенотипы отической капсулы в ушах, которые были инфицированы птичьим ретровирусом, кодирующим или постоянно активную или доминантно-негативную форму Bmp type 1B receptor (Bmpr1b). Эктопическая экспрессия постоянно активного Bmpr1b индуцирует избыточный рост хряща, тогда как доминантно-негативная форма вызывают потерю хряща в отической капсуле. Ингибирование образования хряща также происходит в ответ на воздействие Noggin, секретируемым ингибитором Bmp (Liu et al., 2003). В этих случаях, было неясно является ли ингибирование развития хряща результатом неспособности мезенхимы формировать клетки предшественников хряща или результатом резорбции инициального хряща. В нашем предыдущем исследовании мы установили, что устранение Smad4 в хондроцитах ведет к карликовости с тяжело дезорганизованными пластинками роста, характеризующимися расширенной зоной покоящихся хондроцитов, снижением пролиферации хондроцитов и ускоренной гипертрофической дифференцировкой (Saint-Germain et al., 2004). Следовательно, Smad4-обеспечиваемые BMP4 сигналы ингибируют обычно гипертрофическую дифференцировку хондроцитов. Условный нокаут гена Smad4 в хондроцитах вызывает снижение пролиферации и преждевременную гипертрофическую дифференцировку хондроцитов. Аномалии костной улитки у мутантов Smad4 были частью проявления аномального развития скелетной системы после устранения Smad4 в хондроцитах. Effect of Chondrocyte-Specific Smad4 Deletion on Hair Cell Synapses and Neurofilament Development BMPs также участвуют в развитии центральной и периферической нервной системы. Некоторые гены мишени для BMP4, приносящие страдания, были идентифицированы во время развития нервной системы. Во время развития спинного мозга BMPs контролируют формирование паттерна дорсовентральной оси ЦНС посредством регуляции пронейральных генов Msx1 и Mash1, транскрипционных факторов, которые также экспрессируются во внутреннем ухе и регулируются с помощью BMP4. Мыши, гетерозиготные по Mash1 нулевой мутации, лишены эфферентных нейронов внутреннего уха в обычном месте на плодной стадии, тогда как эктопические нейроны не иннервируют внутреннего уха (Tiveron et al., 2003). Количество синапсов также снижается во внутреннем ухе этих мышей. Вообще-то не совсем соотв. фенотип редукции синапсов наблюдается также у BMP4 мышей (Blauwkamp et al.. 2007), это указывает на то, что BMP4 и Mash1 находятся в одном и том же регуляторном пути. В качестве важного нижестоящего фактора в сигнальном пути BMP, условный нокаут Smad4вызывает удивительную аномальную морфологию в нейральных отростках и редуцирует количества синапсов и нервных волокон. Наши данные показывают, что устранение Smad4 может блокировать путь передачи сигналов BMP и демонстрируют участие сигнального пути BMP в развитии иннервации внутреннего уха. The Relationship Between Morphology Phenotype and Hearing Phenotype В нашем исследовании Smad4^Co/Co мышей наблюдались костные аномалии улитки, аномалии морфологии круглого окна, деформация наковаленки, беспорядок внутренних и наружных волосковых клеток, беспорядок синапсов внутренних волосковых клеток, существаннея изменчивость в морфологии синапсов и редкие нервные отростки. Как влияют эти факторы на слух у Smad4^Co/Co мышей? Деформация наковальни может влиять на передачу звука во внутреннее ухо и тем самым вызывать проводящую тугоухость у Smad4^Co/Co мышей. но полученные данные указывают на то, что все мышиные модели страдают тяжелой нейросенсорной тугоухостью, так что проводящая тугоухость оказывает лишь минимальный эффект на функцию слуха Smad4^Co/Cо мышей. Аномальная морфология круглого окошечка и аномальная костная спиральная ламина могут влиять на состояние тока перилимфы и эффективность вибраций базилярной мембраны. Напротив, аномальное развитие базилярной мембраны может затрагивать физиологическую реакцию на стимулы перилимфы и оказывать ещё большее влияние на эффективность механической стимуляции волосковых клеток на базилярной мембране. В системе слуха млекопитающих волосковые клетки улитки служат в качестве конечных клеток нейросенсорного пути, они могут трансформировать звуковые стимулы в электрические сигналы, посылаемые через слуховые нервы в акустический центр. У Smad4^Co/Co мышей нарушение развития и беспорядок внутренних и наружных волосковых клеток могут влиять на путь, с помощью которого внутренние волосковые клетки воспринимают механическую стимуляцию от вибрирующей базилярной мембраны, и на деполяризацию наружных волосковых клеток, соотв., это д. приводить к нейросенсорной потере слуха. Это может быть причиной линейной реакции на повышающееся звуковое давление (CM data). Внутренние волосковые клетки связаны с 95% афферентных нейрофибрилл, чтобы сформировать синаптические соединения, так что внутренние волосковые клетки запускают нервные импульсы в качестве первичных рецепторов. В случае нарушения развития и беспорядка внутренних волосковых клеток и аномальной морфологии синапсов, соединённых с внутренними волосковыми клетками у Smad4^Co/Co мышей, может возникать нерегулярность нервных импульсов. Если каждый афферентный нерв передает противоречивые нервные импульсы, то это может приводить к отсутствию синхронности разрядов (discharge) в нерве улитки. Изменение временной синхронности афферентных разрядов слухового нерва ведет к замедлению скорости проведения сигналов по нерву; и если количество синапсов сходным образом изменено, то нарушенная их способность передавать импульсы д. мешать передаче нервных импульсов в центр в стволе головного мозга и может объяснить отсутствие акустически активируемых рефлексов ствола мозга. Такой механизм может объяснить аномальные ABR и CAP результаты. Effect of Chondrocyte-Specific Smad4 Deletion on Hair Cell Development Морфогенез внутреннего уха млекопитающих регулируется перекрестными взаимодействиями между эпителием внутреннего уха и окружающей мезенхимой (Frenz and Van De Water, 1991). Имеются важные доказательства in vitro, показывающие, что во время хондрогенеза капсулы улитки эпителий внутреннего уха секретирует молекулы TGF-β семейства, включая BMPs, которые действуют в периотической мезенхиме, влияя на дифференцировку мезенхимы в хрящ (Frenz et al., 1992, 1994, 1996). В нашей мышиной модели, Smad4 специфически делетировали в хондроцитах, не нарушая его экспрессии в др. тканях, включая сенсорный эпителий. Внутренние и наружные волосковые клетки развивались, но развитие стереоцилий в них нарушено. Мы полагаем, что это является одним из возможных объяснений. Хондроцит-специфическая делеция Smad4 не влияла на передачу сигналов BMP4 в эпителии, так что пролиферация и дифференцировка разных клеточных популяций нормальные в эпителии внутреннего уха. Однако, при условной делеции Smad4 нарушены сигнальные взаимодействия Smad4 из окружающей мезенхимы с эпителием внутреннего уха, это становится точкой запуска, которая активирует некоторые взаимосвязанные сигналы. Поскольку эти взаимосвязанные сигналы, которые индуцируют созревание волосковых клеток и синапсов волосковых клеток, блокированы, то развитие волосковых клеток нарушается, а их синапсы обнаруживают аномальный морфогенез. Анализ внутреннего уха у условных Bmp4 нулевых эмбрионов обнаруживает очевидные деформации вестибулярного аппарата, это указывает на то, что Bmp4 важен для вестибулярной системы (Chang et al., 2008). У наших Smad4 мутантов после остановки Smad4-обусловленной передачи сигналов Bmp4, обнаруживается типичная дисфункция улитки и очевидные аномалии улитки, при этом не выявляется вестибулярных симптомов после рождения. Мы объясняем эти различия пространственно-временным характером генного условного нокаута. На ст. E13.5, когда начинается нарушение Smad4 в хондроцитах, вестибулярные каналы уже хорошо сформированы (Morsli et al., 1998). Тем не менее два мутанта представляют разные доказательства, что BMP4 является существенным для развития внутреннего уха. Итак хондроцит-специфический условный нокаут Smut4 у мышей ведет к аномальному развитию сенсорных клеток улитки и тяжелой нейросенсорной потере слуха. Наши данные показывают, что ген Smad4 необходим для развития внутреннего уха и нормального функционирования слуха.

Внутреннее ухо млекопитающих состоит из мембранозного и костного лабиринта. Мембранозный лабиринт образуется эпителиальными клетками, происходящими из слухового пузырька, тогда как костный лабиринт происходит из окружающих мезенхимных клеток, происходящих из мезодермы и нервного гребня. Стенки мембранозного лабиринта дают сенсорный и несенсорный эпителий. Волосковые клетки сенсорного эпителия улитки являются ключевыми клеточными компонентами для поддержания функции слуха и они иннервируются сенсорными нейронами улиткового ганглия. В зрелом внутреннем ухе мембранозный и костный лабиринты разделены с помощью пространства, заполненного перилимфой, жидкостью, которая сходна по составу с спинномозговой жидкостью. При созревании внутренняя граница капсулы слухового аппарата в основном следует за сложным контуром мембранозного лабиринта. Развитие уха млекопитающих использует скоординированную молекулярную трансформацию набора эктодермальных клеток (слуховая плакода) в полностью сформированное ухо.

Морфогенез внутреннего уха млекопитающих регулируется взаимодействиями между слуховым эпителием и окружающим его периотической мезенхимой (Frenz and Van De Water, 1991). Во время образования хрящевой отической капсулы сигнальные молекулы, испускаемые слуховым эпителием, влияют на периотическую мезенхиму, чтобы вызывать тканевую индукцию и дифференцировку (Frenz et al., 1992. 1994,1996). Однако отсутствуют строгие доказательства, демонстрирующие, что эти взаимодействия между слуховым эпителием и периотической мезенхимой противоположным образом влияют на развитие слухового сенсорного эпителия или даже на функцию слуха у взрослых млекопитающих.

Во время развития внутреннего уха ранней и важной ступенью является конверсия эмбриональных эктодермальных клеток в отические нейросенсорные клетки. При такой трансформации эпителиальных в отические клетки центральным событием во многих клетках, которые индуцируют изменения клеточной судьбы, является регуляция транскрипции посредством передачи сигналов модифицированного bone morphogenetic protein (BMP).

BMPs принадлежат к суперсемейству transforming growth factor-β (TGF-β ) и участвуют в регенерации ткани, клеточной дифференцировке и эмбриональном развитии. Функции BMPs в развитии внутреннего уха эмбрионов кур исследовали путем блокирования активности BMPs in vivo, используя птичий ретровирус, кодирующий Noggin, доминантно-негативную или постоянно активную формы рецепторов BMP, кусочки, несущие белок Noggin, и имплантацию клеток, экспрессирующих Noggin (Chang et al., 1999, 2002; Gerlach et al., 2000). Описываемые эффекты были морфологическими аномалиями, ассоциированными с дефектами роста полукружных каналов и ассоциированных с ними сенсорных органов. Chang et al. (2002) сравнивали фенотипы отической капсулы в ухе, инфицированном птичьим ретровирусом, кодирующим или постоянно активную или доминантно-негативную форму Bmp type 1B receptor (Bmpr1b). Эктопическая экспрессия постоянно активного Bmpr1b индуцирует хрящевые выросты, тогда как доминантно-негативная форма вызывает потерю хряща в отической капсуле. Ингибирование формирования хряща также происходит также в ответ на воздействие Noggin, секретируемого ингибитора Bmp (Liu et al., 2003). Кроме того, относительно недавние in vitro эксперименты с избыточной или потерей функции BMP у эмбрионов кур также дали противоречивые результаты относительно роли Bmp4 в формировании волосковых клеток. Несмотря на конфликтующие результаты, эти эксперименты подчеркнули, что передача сигналов BMP является важным элементом регуляции количества и дифференцировки волосковых клеток (Li et al., 2005; Pujades et al., 2006).

Передача сигналов BMPs осуществляется посредством Smad сигнального пути (Hawkins et al., 2003). существуют 8 Smad белков, которые могут быть подразделены на три функциональные класса: рецептором регулируемые Smads (Smad1, Smad2, Smad3 и Smad5), Smad ко-медиатор (Smad4) и ингибирующие Smads (Smad6, Smad7 и Smad8). Smad2 и Smad3 отвечают на TGF-β и activin, тогда как Smad1, Smad5 и Smad8 участвуют в сигнальных путях BMP. Рецептором-упорядоченные Smads формируют гетеродимеры с Smad4 и затем транслоцируются в ядро, чтобы индуцировать или репрессировать гены мишени для TGF-β. Анализ мутаций у мышей mice, используя генный таргетинг, выявил множественные важные функции генов Smad в разных процессах развития (Weinstein et al., 2000). Наши предыдущие данные показали, что дефицит Smad5-обеспечиваемой передачи сигналов ведет к апоптозу волосковых клеток, указывая тем самым, что Smad5 является геном, который может быть связан со снижением слуха в старческом возрасте (presbycusis) (Yang et al., 2009).

В качестве общего медиатора передачи сигналов transforming growth factor-β /bone morphogenetic protein (TGF-β /BMP), Smad4 экспрессируется повсеместно, напр., в эпифизарной пластинке, хрящевой ростовой пластинке, в коже и сердце. Это указывает на то, что Smad4 может играть важную роль во время развития разных тканей и органов. Однако нокаутные Smad4 мыши погибают на ранних стадиях эмбриогенеза (Sirard et al., 1998; Zhou et al., 2003; Yang et al., 2009), это делает трудным оценку функционального значения Smad4 в органогенезе, особенно в развитии внутреннего уха и слуховой функции. Тканеспецифическая делеция Smad4 начинает обнаруживать её функцию в развитии мозжечка и молочных желез (Liu et al., 2003; Zhou et al., 2003). Мы получили мышей, у которых ген Smad4 был специфически делетирован в хондроцитах в результате скрещивания линии мышей, которая несет Smad4 conditional аллель (Smad4^Co) (Yang et al., 2009) с хондроцит-специфическими Cre (Col2a1-Cre) трансгенными мышами (Li et al., 2005). Здесь мы исследовали влияние генного нокаута Smad4 на развитие внутреннего уха и слух.

DISCUSSION

Наше исследование показало, что хондроцит-специфический дефицит Smad4 может вызывать онтогенетические аномалии костного лабиринта улитки у мышей. Морфологически это проявляется в аномальном развитии внутренних и наружных волосковых клеток и в аномальных афферентных синапсах волосковых клеток. Фенотипически мыши страдают от тяжелой нейросенсорной потери слуха. Эти результаты указывают на то, что Smad4 является важным для развития внутреннего уха; его дефицит вызывает аномальное развитие внутреннего уха и начало нейросенсорной тугоухости.

Chondrocyte-Specifie Smad4 Conditional Knockout Affects Osseous Development in the Cochleae of Mice

Фенотипы аномального развития костной улитки, наблюдаемые у Smad4^Co/Co мышей, являются проявлением ключевой роли передачи сигналов BMP в хондрогенезе и эндохондральной оссификации. Обычно BMPs действуют во время раннего развития кости и регулируют форму мезенхимных конденсатов. Они участвуют в индукции мезодермы и детерминации формы кости во время развития костей (Saint-Germain et al., 2004; Tsu-maki and Yoshikawa, 2005). Chang et al. (2002) сравнивали фенотипы отической капсулы в ушах, которые были инфицированы птичьим ретровирусом, кодирующим или постоянно активную или доминантно-негативную форму Bmp type 1B receptor (Bmpr1b). Эктопическая экспрессия постоянно активного Bmpr1b индуцирует избыточный рост хряща, тогда как доминантно-негативная форма вызывают потерю хряща в отической капсуле. Ингибирование образования хряща также происходит в ответ на воздействие Noggin, секретируемым ингибитором Bmp (Liu et al., 2003). В этих случаях, было неясно является ли ингибирование развития хряща результатом неспособности мезенхимы формировать клетки предшественников хряща или результатом резорбции инициального хряща. В нашем предыдущем исследовании мы установили, что устранение Smad4 в хондроцитах ведет к карликовости с тяжело дезорганизованными пластинками роста, характеризующимися расширенной зоной покоящихся хондроцитов, снижением пролиферации хондроцитов и ускоренной гипертрофической дифференцировкой (Saint-Germain et al., 2004). Следовательно, Smad4-обеспечиваемые BMP4 сигналы ингибируют обычно гипертрофическую дифференцировку хондроцитов. Условный нокаут гена Smad4 в хондроцитах вызывает снижение пролиферации и преждевременную гипертрофическую дифференцировку хондроцитов. Аномалии костной улитки у мутантов Smad4 были частью проявления аномального развития скелетной системы после устранения Smad4 в хондроцитах.

Effect of Chondrocyte-Specific Smad4 Deletion on Hair Cell Synapses and Neurofilament Development

BMPs также участвуют в развитии центральной и периферической нервной системы. Некоторые гены мишени для BMP4, приносящие страдания, были идентифицированы во время развития нервной системы. Во время развития спинного мозга BMPs контролируют формирование паттерна дорсовентральной оси ЦНС посредством регуляции пронейральных генов Msx1 и Mash1, транскрипционных факторов, которые также экспрессируются во внутреннем ухе и регулируются с помощью BMP4. Мыши, гетерозиготные по Mash1 нулевой мутации, лишены эфферентных нейронов внутреннего уха в обычном месте на плодной стадии, тогда как эктопические нейроны не иннервируют внутреннего уха (Tiveron et al., 2003). Количество синапсов также снижается во внутреннем ухе этих мышей. Вообще-то не совсем соотв. фенотип редукции синапсов наблюдается также у BMP4 мышей (Blauwkamp et al.. 2007), это указывает на то, что BMP4 и Mash1 находятся в одном и том же регуляторном пути. В качестве важного нижестоящего фактора в сигнальном пути BMP, условный нокаут Smad4вызывает удивительную аномальную морфологию в нейральных отростках и редуцирует количества синапсов и нервных волокон. Наши данные показывают, что устранение Smad4 может блокировать путь передачи сигналов BMP и демонстрируют участие сигнального пути BMP в развитии иннервации внутреннего уха.

The Relationship Between Morphology Phenotype and Hearing Phenotype

В нашем исследовании Smad4^Co/Co мышей наблюдались костные аномалии улитки, аномалии морфологии круглого окна, деформация наковаленки, беспорядок внутренних и наружных волосковых клеток, беспорядок синапсов внутренних волосковых клеток, существаннея изменчивость в морфологии синапсов и редкие нервные отростки. Как влияют эти факторы на слух у Smad4^Co/Co мышей?

Деформация наковальни может влиять на передачу звука во внутреннее ухо и тем самым вызывать проводящую тугоухость у Smad4^Co/Co мышей. но полученные данные указывают на то, что все мышиные модели страдают тяжелой нейросенсорной тугоухостью, так что проводящая тугоухость оказывает лишь минимальный эффект на функцию слуха Smad4^Co/Cо мышей.

Аномальная морфология круглого окошечка и аномальная костная спиральная ламина могут влиять на состояние тока перилимфы и эффективность вибраций базилярной мембраны. Напротив, аномальное развитие базилярной мембраны может затрагивать физиологическую реакцию на стимулы перилимфы и оказывать ещё большее влияние на эффективность механической стимуляции волосковых клеток на базилярной мембране.

В системе слуха млекопитающих волосковые клетки улитки служат в качестве конечных клеток нейросенсорного пути, они могут трансформировать звуковые стимулы в электрические сигналы, посылаемые через слуховые нервы в акустический центр. У Smad4^Co/Co мышей нарушение развития и беспорядок внутренних и наружных волосковых клеток могут влиять на путь, с помощью которого внутренние волосковые клетки воспринимают механическую стимуляцию от вибрирующей базилярной мембраны, и на деполяризацию наружных волосковых клеток, соотв., это д. приводить к нейросенсорной потере слуха. Это может быть причиной линейной реакции на повышающееся звуковое давление (CM data). Внутренние волосковые клетки связаны с 95% афферентных нейрофибрилл, чтобы сформировать синаптические соединения, так что внутренние волосковые клетки запускают нервные импульсы в качестве первичных рецепторов. В случае нарушения развития и беспорядка внутренних волосковых клеток и аномальной морфологии синапсов, соединённых с внутренними волосковыми клетками у Smad4^Co/Co мышей, может возникать нерегулярность нервных импульсов. Если каждый афферентный нерв передает противоречивые нервные импульсы, то это может приводить к отсутствию синхронности разрядов (discharge) в нерве улитки. Изменение временной синхронности афферентных разрядов слухового нерва ведет к замедлению скорости проведения сигналов по нерву; и если количество синапсов сходным образом изменено, то нарушенная их способность передавать импульсы д. мешать передаче нервных импульсов в центр в стволе головного мозга и может объяснить отсутствие акустически активируемых рефлексов ствола мозга. Такой механизм может объяснить аномальные ABR и CAP результаты.

Effect of Chondrocyte-Specific Smad4 Deletion on Hair Cell Development

Морфогенез внутреннего уха млекопитающих регулируется перекрестными взаимодействиями между эпителием внутреннего уха и окружающей мезенхимой (Frenz and Van De Water, 1991). Имеются важные доказательства in vitro, показывающие, что во время хондрогенеза капсулы улитки эпителий внутреннего уха секретирует молекулы TGF-β семейства, включая BMPs, которые действуют в периотической мезенхиме, влияя на дифференцировку мезенхимы в хрящ (Frenz et al., 1992, 1994, 1996).

В нашей мышиной модели, Smad4 специфически делетировали в хондроцитах, не нарушая его экспрессии в др. тканях, включая сенсорный эпителий. Внутренние и наружные волосковые клетки развивались, но развитие стереоцилий в них нарушено. Мы полагаем, что это является одним из возможных объяснений. Хондроцит-специфическая делеция Smad4 не влияла на передачу сигналов BMP4 в эпителии, так что пролиферация и дифференцировка разных клеточных популяций нормальные в эпителии внутреннего уха. Однако, при условной делеции Smad4 нарушены сигнальные взаимодействия Smad4 из окружающей мезенхимы с эпителием внутреннего уха, это становится точкой запуска, которая активирует некоторые взаимосвязанные сигналы. Поскольку эти взаимосвязанные сигналы, которые индуцируют созревание волосковых клеток и синапсов волосковых клеток, блокированы, то развитие волосковых клеток нарушается, а их синапсы обнаруживают аномальный морфогенез.

Анализ внутреннего уха у условных Bmp4 нулевых эмбрионов обнаруживает очевидные деформации вестибулярного аппарата, это указывает на то, что Bmp4 важен для вестибулярной системы (Chang et al., 2008). У наших Smad4 мутантов после остановки Smad4-обусловленной передачи сигналов Bmp4, обнаруживается типичная дисфункция улитки и очевидные аномалии улитки, при этом не выявляется вестибулярных симптомов после рождения. Мы объясняем эти различия пространственно-временным характером генного условного нокаута. На ст. E13.5, когда начинается нарушение Smad4 в хондроцитах, вестибулярные каналы уже хорошо сформированы (Morsli et al., 1998). Тем не менее два мутанта представляют разные доказательства, что BMP4 является существенным для развития внутреннего уха.

Итак хондроцит-специфический условный нокаут Smut4 у мышей ведет к аномальному развитию сенсорных клеток улитки и тяжелой нейросенсорной потере слуха. Наши данные показывают, что ген Smad4 необходим для развития внутреннего уха и нормального функционирования слуха.