Рис.1. | Segmental organization of the hindbrain and its early neuronal derivatives. The hindbrain is subdivided into eight rhombomeres (r1-8), which are all molecularly distinct and form different neuronal cell types. A: Diagram of the early vertebrate (zebrafish) hindbrain; lateral view, anterior to the left. Boxes above the hindbrain represent the expression patterns of various transcription factors and cell adhesion molecules: green, hoxd4; yellow, MafB; orange, hoxb1; light blue, krox20 and epha4; dark blue, ephrin b2. Stippled boxes denote genes that require RA for their expression. Neural crest cells (NCCs; red arrows) migrate to different pharyngeal arches (PA1-3) depending on their rhombomeric origin (midbrain & r1-3, arch 1; r4-5, arch 2; r6-8, arches 3-7). B: Dorsal view (anterior to the left) of a later hindbrain showing neurons within the hindbrain that require RA signaling for proper differentiation, independent of its role in rhombomere identity. Purple, trigeminal (V); orange, facial (VII); green, vagus (X); yellow, hindbrain noradrenergic (NA) neurons; stippled boxes denote neurons that require RA signaling for differentiation.
Рис.2. | Diagram of the retinoic acid (RA) pathway. An RA-producing cell (left) shows the biosynthetic pathway for RA and a responding cell (right) shows signaling and catabolism, although RA also likely acts in the cells that produce it. Retinyl esters and beta-carotene are important stores of RA precursor. Green dashed arrows point to components of the pathway induced by RA signaling. The red line denotes repression of aldh1as by RA. Once made, RA (yellow circles) enters cells and binds Crabps (blue ovals), which transport it either to RARs (blue and green ovals) in the nucleus (orange) for signaling or to Cyp26s (red hexagon) for degradation. adhs, alcohol dehydrogenases; aldh1as, aldehyde dehyrogenase 1as.
Рис.3. | Representative phenotypes caused by disrupting the retinoic acid (RA) pathway. Diagrams show dorsal views of the hindbrain, anterior to the left, extending anterior to the somites, with expression of segment-specific genes (color coded) below - blue, krox20/egr2b, r3 and r5; orange, hoxb1(a), r4; yellow, valentino/kreisler/MafB, r5/6; green, hoxb4, r7 and anterior spinal cord. A: Wild-type (wt). There are 7 rhombomeres (r1-7). B: Vitamin A-deficiency (VAD) quail. r4-7 are lost and r1-3 expand. C: bcox-morphant zebrafish. These embryos lack hoxb4 expression in r7. D: lratb-morphant zebrafish. r6 and r7 are reduced. E: Aldh1a2-/- mutant mice or fish. r5-7 are reduced/missing and r1-4 expand posteriorly. F: Rar/-/- mutant mice. r5-7 expand posteriorly. G: Rar/-/-. r6/7 are missing and replaced by expanded r3-5. H: Cyp26a1-/- mutant mice and fish. r4 expands slightly. I: cyp26a1-/-, cyp26b1-morphant zebrafish. r4 expands further and r5 and r6 are reduced. J: Cyp26a1-/-, Cyp26c1-/- mutant mice. r4-6 expand anteriorly at the expense of r1-3. K: cyp26a1-/-, cyp26c1-morphant zebrafish. r4 expands even further and abuts the cerebellum. L: cyp26a1-/-, cyp26b1/cyp26c1-morphant zebrafish. r7 replaces most of the hindbrain.
Рис.4. | Cyp26 expression in the hindbrain. Diagrams illustrate expression of cyp26a1 (blue), cyp26b1 (yellow), and cyp26c1 (red) during early patterning stages in the zebrafish (A-C), chick (D-F), and mouse (G-I). All are dorsal views, anterior to the left, except for G, which depicts a lateral view. A,D,G: Early gastrula stages. In all three species, cyp26a1 is expressed strongly in the anterior neural ectoderm. In zebrafish, graded low-level expression also extends further posteriorly (A) throughout the presumptive hindbrain region (brackets). In both fish and chick, cyp26c1 expression also appears anteriorly. B,E,H: Neurula/early-somite stages. In both zebrafish and mice, cyp26b1 and cyp26c1 expression extends throughout most of the hindbrain, with cyp26c1 also expressed in subsets of cranial mesenchyme in all three species. The hindbrain of the chick embryo, however, resembles the gastrula stages of the other two species in terms of Cyp26 expression. C,F,I: Segmentation stages. All three species exhibit Cyp26 expression throughout most of the hindbrain with minor differences in pattern.
Рис.5. | Models for retinoic acid (RA) signaling during hindbrain development. Diagrams represent hindbrain rhombomeres, (r1-7), anterior to the left in each case. Cyp26s are shown in blue, RA signaling in red and RA-target genes in yellow. A: The classic morphogen model. RA synthesized posteriorly by Aldh1a2 diffuses anteriorly and is removed by Cyp26a1 degradation. This forms an RA gradient across the A-P extent of the hindbrain and directs specification of rhombomeres according to concentration - arrows indicate thresholds for hoxd4 and vhnf1. B: Timing model. Gene expression is controlled by the length of exposure to RA, which is controlled by shifting boundaries of expression of Cyp26. Here RA signaling is revealed by expression of an RARE-lacZ transgene (red), which shows that r3/4 are exposed to RA for a shorter duration than r5-7, because of expression of cyp26c1 after gastrulation. C: Rising gradient model. The rate of RA synthesis grows over time, thus explaining both the concentration-dependent and the apparent time-dependent effects. D: Modified timing model. Similar to (B), gene expression is controlled by duration of exposure to RA, but with three distinct boundaries instead of two. E: Modified morphogen model. In this model, the RA gradient is shaped by the amount of cyp26 degradation, which is in turn set by feedback and feedforward control from Fgf and RA signaling, respectively. As the embryo grows, the RA gradient grows, without increasing the rate of RA synthesis, integrating time- and concentration-dependent effects.
Рис.6. | Rescue of hindbrain patterning by exogenous retinoic acid (RA). Whole-mount in situ hybridisation, dorsal view, anterior to the left. Probes include pax2a (midbrain-hindbrain boundary) and krox20 (r3 and r5) in red, and hoxd4 (r6/7 boundary) in blue. A: Wild-type hindbrain. B: Inhibition of RA synthesis with DEAB leads to a loss of r5-7 and expansion of r1-4. C-E: Rescue of patterning in DEAB-treated embryos by exogenous RA over a very large concentration range. F: High concentrations of RA show a posteriorized phenotype.
Cyp26A1 является гравным ферментом, который контролирет гомеостаз that controls retinoic acid (RA) путем метаболизма RA в био-неактинве метаболиты. Ранее было установлено, что мышиный Cyp26A1 промотор имеет два канонических RA response elements (RAREs), которые лежат в основе регуляции генов с помощью RA. Анализ 2,533-пар оснований (2.5 k) геномной последовательности выше стартового кодона cyp26a1 рыбок данио, было установлено, что два RAREs законсервированы в промоторе cyp26a1 рыбок данио. Мутагенез продемонтрировал, что два RAREs работают синергично в RA индуцибельности cyp26a1. Слияние фрагмента в 2.5 k (kilobase pairs) с enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) репортерным геном позволило создать две трансгенные линии рыбок [Tg(cyp26a1:eYFP)]. Трансгенные рыбки данио обнаруживали паттерны экспрессии сходные с теми, что наблюдаеются для гена cyp26a1 in vivo. В соответствии с результатми in vitro активность гена репортера оказалась индуцибельной с помощью RA у эмбрионов. Итак, полученные результаты демонстрируют, что фрагемент в 2.5 k лежит в основе регуляции гена cyp26a1 рыбок данио с помощью RA.
Сегментация вдоль anterior-posterior (A-P) оси у эмбрионов позвоночных создает повторяющиеся серии ромбомеров в задней мозге, которые формируют кальку для ствола мозга взрослых. Задний мозг состоит из 8 ромбомеров, каждый из которых имеет отличающиеся сегментные характеристики в соответствии с положением вдоль A-P (Kiecker and Lumsden,[2005]), также как и отличающиеся типы нейронов и паттерны генной экспрессии (Fig. 1, Сегментная организация заднего мозга и его ранние нейрональные производные). Такая сегментная конструкция делает возможной специализацию нейрональных и глиальных подтипов вдоль A-P оси и коррелирует с паттернами миграции краниальных neural crest cells (NCCs). Двигательные нейроны вносят вклад в каждый из краниальных нервов и происходят из кластеров предшественников, которые формируются в специфических ромбомерах и посылают свои аксоны вдоль стереотипических путей, чтобы скоординировать формирование паттерна в заднем мозге с периферическими тканями. которые они иннервируют (Fig. 1).
Ромбомеры специфицируются во время гаструляции под контролем сигналов от задней части эмбриона, включая производные витамина А, ретиноевую кислоту (RA; Schilling and Knight,[2001]; Gavalas,[2002]; Maden,[2002]). RA , как полагают, действует как градированный морфоген, обеспечивающий сегмент-специфическую экспрессию гомеозисных (Hox) генов и формирование паттерна ромбомеров зависимым от концентрации способом.
Retinoids are potent modifiers of cell fate and behavior. Эмбрионы, обработанные экзогенной RA обнаруживают тяжелые дефекты в заднем мозге, глоточных дугах, конечностях, сердце, кишке и многих др. органах (Durston et al.,[1989]; Marshall et al.,[1992]; Godsave et al.,[1998]). Для синтеза необходимой RA достаточно принимаемого с пищей витамина А, а vitamin A-deficiency (VAD) вызывает тяжелые дефекты развития (Figs. 2, 3A,B; McCaffery et al.,[2003]). В заднем мозге VAD эмбрионов отсутствуют задние ромбомеры (r4-7) а многие передние ромбомеры увеличиваются кзади (Gale et al.,[1999]; White et al.,[2000]). Сходная anteriorization заднего мозга происходит при: (1) мутациях потери функции в гене, кодирующем основной энзим, ответственный за синтез RA у эмбрионов, aldh1a2 (aldehyde dehydrogenase 1a2, также известный как raldh2), как у мышей, так и рыбок данио (Niederreither et al.,[1999],[2000]; Begemann et al.,[2001]; Grandel et al.,[2002]), (2) мутациях потери функции в RA рецепторах (RARs и RXRs) у мышей, (3) у эмбрионов, которым инъецировали доминантно-негативные RARs, или (4) обработали фармакологическими ингибиторами продукции RA и активности рецепторов у разных видов (Daam et al.,[1993]; Blumberg et al.,[1997]; Dupe et al.,[1999]; Dupe and Lumsden,[2001]; Begemann et al.,[2004]; Linville et al.,[2004]). Всё это подтверждает роль RA как диффундирующего морфогена в заднем мозге. Однако животные вне лабораторных условий сталкиваются с драматическими флюктуациями пищевого витамина А и тем не менее их задний мозг развивается нормально. Т.о., остается вопрос, как корректно формируется такой градиент перед лицом варьирующих уровней RA.
Новая информация о регуляции передач сигналов RA получена с идентификацией Cyp26s, cytochrome p450 энзима. который деградирует RA. Была установлена у всех вторичноротых (deuterostomes), которые были изучены, общая инициальная ступень удаления RA (White et al.,[1996],[1997]; Fujii et al.,[1997]; Hollemann et al.,[1998]; Swindell et al.,[1999]; Nagatomo and Fujiwara,[2003]; Canestro et al.,[2006]). Cyp26s необходимы для формирования паттерна сегментов в заднем мозге и, по-видимому, являются составляющей негативной петли обратной связи, необходимой для модуляции передач сигналов RA. Появились новые данные о Cyp26s и деградации RA в формировании паттерна заднего мозга (Maves and Kimmel,[2005]; Sirbu et al.,[2005]; Uehara et al.,[2007]; Hernandez et al.,[2007]; White et al.,[2007]). Мы сосредоточимся на трех основных точках: (1) Cyp26-обеспечиваемая деградация существенна для эмбриогенеза, (2) RA-индуцируемая деградация с помощью Cyp26s делает передачу сигналов RA надежной (способной компенсировать изменения в уровнях RA), и (3) др. RA-индуцируемые компоненты пути RA вносят вклад в эту устойчивость.
THE RA PATHWAY: SYNTHESIS AND DEGRADATION
Как показано на Figure 2, уровни RA тонко регулируются с помощью комбинации синтеза и деградации, и зависят от доступности её предшественников. В свою очередь несколько белков, которые связывают RA, модулируют её распределение и контролируют перемещение из одного клеточного компартмента в др. Множественные петли обратной связи идентифицированы на многих ступенях пути передачи сигналов RA, усиливает эту сложность то, что (Fig. 2; green and red arrows) RA может негативно регулировать свою собственную продукцию непосредственно репрессируя экспрессию aldh1a2 (Niederreither et al.,[1997]; Dobbs-McAuliffe et al.,[2004]) и lecithin:retinol acyltransferase (Matsuura and Ross,[1993]; Zolfaghari and Ross,[2002]). RA также позитивно регулирует энзимы, которые деградируют её, такие как Cyp26a1 (White et al.,[1996],[2007]; Dobbs-McAuliffe et al.,[2004]) и индуцирует экспрессию RARs (Rar, Rar, Rar) и связывающих белков, Crabps (CrabpI & CrabpII; Giguere et al.,[1990]; Leroy et al.,[1991a],[b]; Smith et al.,[1991]; Kamei et al.,[1993]; Serpente et al.,[2005]). Мы полагаем. что такие позитивные и негативные обратные связи в пути позволяют передаче сигналов RA компенсировать как варьирующие уровни RA, так и изменения в размере и форме эмбрионов во время развития.
Synthesis
Все животные нуждаются в некоторой форме витамина А (retinol) в своей диете. Она поступает в виде β-carotene от растений и retinyl эфиров от животных источников (Fig. 2). Основные формы хранения у эмбрионов варьируют от вида к виду (reviewed in Simoes-Costa et al.,[2008]). Напр., у некоторых морских рыб retinal предоминирует, тогда как эмбрионы пресноводных рыб, которые были изучены, содержат высокую пропорцию, retinol/retinyl эфиров (Plack,[1964]; Irie and Seki,[2002]). Тенденция у высших позвоночных в направлении увеличения использования эфиров retinol и retinyl (Plack and Kon,[1961]) имеет лишь некоторые исключения. Напр., retinol предоминирует у эмбрионов кур, тогда как эмбрионы уток и гусей предпочитают retinal (Plack,[1964]). У плацентных млекопитающих retinol и retinyl эфиры предоставляются эмбриону и плоду посредством материнского кровообращения (Quadro et al.,[2004],[2005]). Retinol транспортируется в сыворостку связанным с retinol binding protein (RBP, described later), но не может пересекать плаценту (Quadro et al.,[2004]). Поэтому он диссоциирует от RBP и диффундирует через желточный мешок, место экспрессии фетального RBP (Johansson et al.,[1997]) для доставки эмбриональным и плодным тканям.
β-carotene-15,15-oxygenase (bcox) делит β-carotene на две молекулы retinal (Fig. 2), а недавние результаты на рыбках данио продемонстрировали, что bcox необходима для эмбриогенеза (Lampert et al.,[2003]; Fig. 3A,C). Антисмысловые morpholino oligonucleotides (MOs), которые истощают bcox у эмбрионов, вызывают дефекты в формировании фарингеальных дуг и грудных плавников. В заднем мозге bcox MO-injected (morphant) эмбрионов обнаруживается снижение экспрессии Hox гена (hoxb4) в ромбомере 7 (r7). Все эти дефекты, по-видимому, возникают косвенно из-за потребности в bcox энтодермальными клетками, которые превращают β-carotene, хранимый в желточном мешке (Lampert et al.,[2003]). Напротив, retinyl эфиры хранятся в печени и синтезируются из retinol с помощью lecithin:retinol acyltransferase (lrat; Fig. 2), энзима, необходимого для эмбриогенеза (Liu and Gudas,[2005]; Isken et al.,[2007]; Kim et al.,[2007]). У рыбок данио потеря функции lratb дает эмбрионов с повышенными уровнями RA и пониженными уровнями retinyl эфиров, приводящих к уменьшению пробела между r5 и спинным мозгом (r6 и r7), фенотип, напоминающий эмбрионов, обработанных RA (Fig. 3D; Isken et al.,[2007]). И bcox и lrat регулируются с помощью RA, чтобы приспособить количества retinol , а значит и RA (Matsuura and Ross,[1993]; Zolfaghari and Ross,[2002]; Lampert et al.,[2003]; Liu and Gudas,[2005]; Isken et al.,[2007]). Хранилища retinyl эфиров мобилизуются с помощью retinyl ester hydrolases (Fig. 2).
Превращение retinol в RA происходит в две ступени, катализируемые разными наборами dehydrogenases (reviewed in Duester,[2000]). Некоторые цитозольные alcohol dehydrogenases (Adhs) и микросомальные retinol dehydrogenases (Rdhs) превращают retinol в retinal, и затем aldehyde dehydrogenases (Aldh1as) превращают retinal в RA (Fig. 2). Недавно описана мутация в Rdh10 мышей, которая характеризуется дефектами передних конечностей, фронтоназальных отростков, фарингеальных дуг и краниальных ганглиев. Rdh10 экспрессируется у эмбрионов в вентральной части заднего мозга и в наиболее передних сомитах (Cammas et al.,[2007]; Sandell et al.,[2007]). это предоставляет первые доказательства. что превращение retinol в retinal также пространственно ограничено и что Rdh10 является главным вкладчиком в это превращение у ранних эмбрионов.
Некоторые из первых генетических доказательств, подтверждающих роль эндогенно синтезируемой RA у эмбрионов получены в работах с мутациями потери функции энзимов. синтезирующих RA, Aldh1a2, у рыб и мышей (Niederreither et al.,[1999],[2000]; Begemann et al.,[2001]; Grandel et al.,[2002]). Эти работы продемонстрировали, что Aldh1a2 (из трех Aldh1as у позвоночных) является критическим для раннего эмбриогенеза и что неспособность синтезировать RA ведет к потере задних и расширению передних ромбомеров (Fig. 3E). Дефекты заднего мозга коррелируют с потерей экспрессии трансгенных репортеров, управляемых с помощью консенсуса ДНК связывающих сайтов для RARs , известных как RA-response elements (RAREs), подтверждая потерю или снижение передачи сигналов RA. Однако уникальные и перекрывающиеся функции разных Aldh1as в передаче сигналов RA остаются неясными. Потеря функции Aldh1a2 не фенокопирует всех аспектов VAD (compare Fig. 3B and 3E), вообще-то из-за др. источников RA.
Неожиданно некоторые сообщения показали, что энзим CYP1 (др. член семейства cytochrome p450) также может вносить вклад в синтез RA как с retinol, так и с retinal (Chen et al.,[2000b]; Zhang et al.,[2000]; Choudhary et al.,[2004]; Chambers et al.,[2007]). Обработка эмбрионов ингибитором CYP1B1 ведет к легкому подавлению экспрессии Hoxb1 в r4, указывая на снижение передачи сигналов RA. Взрослые Cyp1b1-/- мыши также имеют аномалии глаз, напоминающие врожденную глаукому людей, которые отражают дефекты хорошо известных ролей передачи сигналов RA в развитии глаз (Libby et al.,[2003]).
Receptors
RA осуществляет большинство своих эффектов посредством набора рецепторов ядерных гормонов, рецепторов ретиноевой кислоты (RARα,β,Γ ) и retinoid X receptors (RXRα,β,Γ; Fig. 2), которые обнаруживают перекрывающуюся экспрессию в заднем мозге (Hale et al.,[2006]; Tallafuss et al.,[2006]). RARs и RXRs формируют гетеродимеры, которые регулируют транскрипцию путем связывания RAREs. Исследование нокаутов у мышей выявило различные, но перекрывающиеся функции этих рецепторов в эмбриогенезе (Li et al.,[1993]; Lohnes et al.,[1993],[1994],[1995]; Lufkin et al.,[1993]; Kastner et al.,[1994]; Mendelsohn et al.,[1994a],[b]; Sucov et al.,[1994]; Luo et al.,[1995]; Subbarayan et al.,[1997]; Dupe et al.,[1999]; Wendling et al.,[2001]). Одиночные мутанты жизнеспособны постнатально, хотя некоторые в меньшей степени, чем дикий тип (Li et al.,[1993]; Lohnes et al.,[1993]; Lufkin et al.,[1993]; Mendelsohn et al.,[1994b]; Luo et al.,[1995]). Компаундные RAR/RXR мутанты обнаруживают более тяжелые эмбриональные дефекты (Fig. 3F,G). В заднем мозге, RARα/β двойные мутанты обнаруживают увеличенную область r5-7, тогда как r5-7 теряется и r3-4 расширяется кзади у RARα/Γ; двойных мутантов (Dupe et al.,[1999]; Wendling et al.,[2001]). Это указывает на то, что рецепторы действуют в комбинации и наполовину перекрывающимся образом, чтобы трансдуцировать RA сигнал.
Ситуация ещё больше осложняется тем фактом, что в отсуствие лиганда RARs и RXRs рекрутируют корепрессоры, чтобы репрессировать транскрипцию генов мишеней для RA, в то время как связанные с лигандом комплексы содержат ко-активаторы и активируют эти же самые мишени (Horlein et al.,[1995]; Chen et al.,[1996]; Koide et al.,[2001]). Это означает, что даже в областях, лишенных RA, RARs могут влиять на экспрессию генов. В самом деле, передний и средний мозг нуждаются в низких уровнях RA , чтобы развиваться соотв. образом (Koide et al.,[2001]). Укороченный ко-репрессор, который действует как доминантно-негативный, блокирует репрессию эндогенных кофакторов, но не активацию с помощью RARs и это ведет к неспособности переднего развития. Это демонстрирует, что репрессия необходима для развития головы (Koide et al.,[2001]). Кроме того, форсированная репрессия за счет обработки эмбрионов inverse агонистом RARs (AGN193109) активирует передние маркеры. Равновесие между связанными с лигандом и несвязанными димерами рецепторов, которое детерминирует конечный результат по каждому из генов мишеней для RA, является привлекательным механизмом для установления очень резкого порога активации, общего признака многих RA мишеней.
др. методы, связанные с функцией рецепторов, включают избыточную экспрессию доминантно-негативных рецепторов и обработку эмбрионов химическими антагонистами рецепторов (одирн из inverse агонистов, который стабилизирует ко-репрессорный комплекс). Они дали логически обоснованные данные по заднему мозгу, фарингеальным дугам, кишечнику и конечностям. Однако имеются важные отличия между каждым из этих вмешательств. Напр., inverse агонисты RARs, такие как AGN193109 (Agarwal et al.,[1996]) увеличивают репрессию, тогда как мутации потери функции или инъекции MO устраняют рецепторные белки, блокируя как активацию, тае и репрессию. Т.о.. несмотря на огромное множество функциональных исследований рецепторов, необходимы дальнейшие исследования для отличия позитивных и негативных эффектов.
Существуют доказательства, что RA соединяется и активирует молекулы иные, чем RARs и RXRs, включая PKC (Radominska-Pandya et al.,[2000]; Ochoa et al.,[2003]) и PPARβ/δ (Shaw et al.,[2003]; Schug et al.,[2007]). Следовательно, RA участвует в др. процессах, таких как метаболизм липидов и тучность, которые являются интересным путем исследований RA в будущем.
Binding Proteins
Некоторые белки соединяются или с retinol или с RA aи регулируют их клеточные перемещения (Fig. 2). Критические роли были недавно продемонстрированы для внеклеточного Retinol Binding Protein (Rbp) рецептора. наз. Stra6 (Kawaguchi et al.,[2007]), мутации у людей, которые вызывают глазные, сердечные и легочные дефекты, напоминают редукцию передачи сигналов RA (Pasutto et al.,[2007]). Эти результаты подтверждают, что Stra6 позитивно регулирует продукцию RA , способствуя потреблению retinol. Интересно, что RA соединяется также с внеклеточным белком, связывающим жирные кислоты, с высоким сродством, функция этого неясна. Один такой белок, выделенный из эпидидимуса крыс, соединяется с RA, но не retinol (Ong and Chytil,[1988]; Newcomer,[1993]; Sundaram et al.,[1998]). Однако отсутствуют данные о его экспрессии или функции во время эмбриональрного развития.
Внутриклеточно клеточный ретинол-связывающий (Crbps; Ross,[1993]) и RA-связывающий белки (Crabps; Ong and Chytil,[1978]; Napoli,[1993]; Donovan et al.,[1995]) модулируют передачу сигналов (Fig. 2). Оги обнаруживают чрезвычайно высокое сродство со своими субстратами, подтверждая, что RA остается связанной с такими белками большую часть времени. Это облегчает перемещения липофильной молекулы, такой как RA в водной среде. Куда и как перемещается связанная RA остается неясным.
Три функции были предположены для Crabps: (1) транспорт RA в ядро, чтобы взаимодействовать с RARs, (2) секвестрация RA в цитоплазме вдали от RARs и (3) транспорт RA к Cyp26 энзимам для деградации. Эти функции могут отличаться для каждого из субтипов Crabp и не являются взаимоисключающими.
Доказательства, подтверждающие модель, что Crabps (по крайней мере, CRABPII) помогает транспорту RA к RARs в ядро получены из многих источников. Напр., избыточная экспрессия xCrabp у Xenopus вызывает потерю передних структур, как при обработке RA (Dekker et al.,[1994]), подтвержая, что этот белок связывания усиливает передачу сигналов RA, функция, которая наиболее согласуется с первой гипотезой. In vitro избыточная экспрессия CRABPII в линии клеток рака груди (Jing et al.,[1997]), также как в клетках COS-7, усиливает RAR-опосредованную активацию репортерного гена благодаря прямому взаимодействию между CRABPII и RARs (Dong et al.,[1999]). В самом деле, соединение RA с CRABPII вызывает изменение конформации, которая экспозирует предполагаемый сигнал ядерной локализации. Это приводит к импорту RA-CRABPII комплекса в ядро (Sessler and Noy,[2005]).
Напротив, в исследования in vitro с CRABPI продемонстрировали негативную роль в передаче сигналов. Избыточная экспрессия CRABPI в клетках F9 тератокарциномы снижает их чувствительность к воздействию RA и это коррелирует с увеличением продукции RA метаболитов, тогда как истощение экспрессии CRABPI увеличивает чувствительность (Boylan and Gudas,[1991],[1992]). Кроме того, микросомы семенников крыс метаболизируют RA, связанную с CRABPI , значительно быстрее, чем одну только RA (Fiorella and Napoli,[1991]). Эти данные указывают на то. что в отличие от CRABPII, CRABPI регулируется скорость метаболизма RA, возможно с помощью секвестрации в цитоплазме или за счет предоставления RA деградирующим энзимам или обоими способами.
Несмотря на их эффекты in vitro, мыши, несущие делеции CRABPI или CRABPII индивидуально или в комбинации обнаруживают относительно легкие дефекты развития (de Bruijn et al.,[1994]; Gorry et al.,[1994]; Fawcett et al.,[1995]; Lampron et al.,[1995]), указывающие, что передача сигналов RA может происходить без этих белков. Это было интерпретировано таким образом, что CRABPs не существенны, но это только в лабораторных условиях, где уровни витамина А безусловно достаточны. Такие белки могут играть незначительную роль в модуляции сигналов в ответ на средовые флюктуации в RA или её предшественников.
Degradation as a Major Determinant of the RA Pathway
RA удаляется из тканей путем окисления в полярные метаболиты, которые которые значительно легче экскретируются. Окисление первоначально катализируется с помощью энзимов Cyp26 (White et al.,[1996],[1997]; Fujii et al.,[1997]; Hollemann et al.,[1998]; Swindell et al.,[1999]), из них 3 встречаются у млекопитающих: Cyp26a1, Cyp26b1 и Cyp26c1. Эти ассоциированные с ER энзимы окисляют RA с помощью cytochrome p450 reductase (Cpr/Por). Мутации потери функции Cyp26a1 у мышей и рыбок данио (Abu-Abed et al.,[2001]; Sakai et al.,[2001]; Emoto et al.,[2005]) а также Cyp26b1 и Cyp26c1 у мышей (Yashiro et al.,[2004]; Uehara et al.,[2007]) и Cpr/Por (Otto et al.,[2003]; Ribes et al.,[2007b]) все они обнаруживают дефекты, согласующиеся с усилением передачи сигналов RA (Fig. 3H-L).
Продукты окисления с помощью Cyp26 энзимов. включают 4-oxo-RA, 4-hydroxy-RA и 5,6 или 5,8-epoxy-RA (Fiorella and Napoli,[1994]; White et al.,[1996],[2000]; Fujii et al.,[1997]; Swindell et al.,[1999]). Эти метаболиты сами по себе активируют RARs, открывается тем самым возможность, что Cyp26 энзимы не просто противодействуют передаче сигналов RA (Pijnappel et al.,[1993]). Др. субтип Cyp энзима (CYP3A7) был описан как гидроксилирующий RA в печени плода человека, где он потенциирует передачу сигналов (Chen et al.,[2000a]). Дальнейшее превращение метаболитов RA в более полярные молекулы с помощью, напр., UDP glucuronosyltransferases, ведет к их окончательной экскреции (Little and Radominska,[1997]; Samokyszyn et al.,[2000]).
Т.к. более полярные продукты от Cyp26s быстро экскретируются, то первичная функция Cyp26s скорее всего это быть катаболическими энзимами, которые элиминируют RA и ингибируют передачу сигналов (Abu-Abed et al.,[2001],[2003]; Sakai et al.,[2001]), это согласуется с данными потери функции. Как RA-чувствительные, так и нечувствительные регионы экспрессируют Cyp26s и RA активирует некоторые из этих энзимов (напр., Cyp26a1 в нервной системе) , но не др. (see Table 1). Там, где RA индуцирует Cyp26, это создает петлю негативной обратной связи, которая регулирует уровни RA и компенсирует изменения в уровнях RA.
Table 1. Effects of RA on Cyp26 Expression
Таблицу см. в
Expression and Function of Cyp26s Across Species
Кстати, Cyp26 энзимы были клонированы и проанализированы у мышей (Fujii et al.,[1997]; de Roos et al.,[1999]; MacLean et al.,[2001]; Tahayato et al.,[2003]), кур (Swindell et al.,[1999]; Blentic et al.,[2003]; Reijntjes et al.,[2003],[2004]), перепела (Reijntjes et al.,[2005]), Xenopus (Hollemann et al.,[1998]; de Roos et al.,[1999]) и рыбок данио (Kudoh et al.,[2002]; Dobbs-McAuliffe et al.,[2004]; Emoto et al.,[2005]; Gu et al.,[2005]; Zhao et al.,[2005]; Hernandez et al.,[2007]). Недавняя идентификация Cyp26 у hemichordates, echinoderms и некоторых urochordates (Canestro et al.,[2006]), включая Ciona intestinalis (Nagatomo and Fujiwara,[2003]), указывает на то, что они присутствовали у общего предшественника всех deuterostomes. Cyp26s у позвоночных имеют др. домены экспрессии (Fig. 4), некоторые в чувствительных к RA регионах, др. в независимых от RA регионах. Мы сконцентрируемся на экспрессии и функции в заднем мозге у ранних эмбрионов рыбок данио, кур и мышей (Figs. 3, 5). Table 2 суммирует их паттерны экспрессии в заднем мозге и в др. местах. Признаки экспрессии на поздних стадиях развития зесь рассматриваться не будут (детали см. MacLean et al.,[2001]; Abu-Abed et al.,[2002]; Tahayato et al.,[2003]; Sakai et al.,[2004]).
Table 2. Summary of Cyp26 Expression Patterns
Таблицу см. в
Cyp26a1
У всех трех видов Cyp26a1 первоначально экспрессируется в передней части нервной пластинки во время гаструляции, в будущем переднем и среднем мозге (blue in Fig. 4A,D,G; Fujii et al.,[1997]; Hollemann et al.,[1998]; Swindell et al.,[1999]; Kudoh et al.,[2002]). Между этим доменом и экспрессией Aldh1a2 в параксиальной мезодерме туловища пробел в несколько сотен микрометров предопределяет презумптивную область заднего мозга (Swindell et al.,[1999]) и источник и сброс RA (Fig. 5A). Задняя граница экспрессии Cyp26a1 отличается слегка у мышей (r2/3 граница) и рыбок данио (r3/4 граница; Kudoh et al.,[2002]; Sirbu et al.,[2005]; Hernandez et al.,[2007]). Наши недавние результаты на рыбках данио, однако показывают, что т.к. эта граница предопределяет область строгой экспрессии cyp26a1, то многие клетки внутри презумптивной области заднего мозга (r3-7) экспрессируют cyp26a1 на ст. гаструлы на значительно более низком уровне, который как мы показали, является критическим для формирования RA-зависимого паттерна (Fig. 4A; White et al.,[2007]). В противоположность экспрессии cyp26a1 впереди r2/3, этот низкий уровень экспрессии в заднем мозге индуцируется с помощью и нуждается в RA, показывая. что он модулирует уровни передачи сигналов RA посредством негативной обратной связи (Fig. 5E).
Cyp26a1 существенен для эмбрионального развития (Fig. 3H). У Cyp26a1-/- мутантных мышей как задний мозг, так и позвоночник posteriorized и имеют тяжелое каудальное укорочение со spina bifida иногда и с sirenomelia, русалко-подобной деформацией нижних конечностей, слитых по срединной линии и отсутствие хвоста (Abu-Abed et al.,[2001]; Sakai et al.,[2001]). Все гомозиготные мутантны эмбрионы погибают в первый день после рождения.
В заднем мозге Cyp26a1-/- мутантов, r3 уменьшен и качественные особенности клеток в r4 расширяются кпереди как r2 (Fig. 3H; Abu-Abed et al.,[2001]; Sakai et al.,[2001]; Kudoh et al.,[2002]; Uehara et al.,[2007]; Emoto et al.,[2005]; Hernandez et al.,[2007]). Это в конечном итоге разрушает краниальные нервы, возникающие из этих ромбомеров. Sakai et al. ([2001]) показали, используя чувствительный к RA lacZ трансген, который расширяет передачу сигналов RA кпереди в проспективные r2 и r3 у Cyp26a1-/- мутантов. Т.о., Cyp26a1 действует как локальный антагонист передачи сигналов RA. В согласии с этим то, что гаплонедостаточность по Aldh1a2+/- (Niederreither et al.,[2002]), или делеция RARΓ (Abu-Abed et al.,[2003]), нормализует Cyp26a1-/- фенотип. Недавно было сообщено, что приблизительно 30% эмбрионов Cyp26a1-/- имеют более тяжелые дефекты заднего мозга, чем это предполагалось, включая драматическое расширение передач сигналов RA, исходя из RARE-lacZ (Uehara et al.,[2007]).
Интересно, что Cyp26a1-/- мутанты более чувствительны к RA, чем дикий тип. Расширение задней части заднего мозга, вызываемое низкими дозами экзогенной RA (5 nM) у мутантов. напоминает эмбрионов дикого типа, обработанных более высокими дозами (Hernandez et al.,[2007]). Это указывает на то, что Cyp26a1 защищает эмбрион от повышенных уровней RA. В согласии с этой идеей, инъекции высоких доз retinal, чтобы искусственно увеличить скорость продукции RA, posteriorizes эмбрионы, лишенные экспрессии Cyp26a1. Cyp26a1 также необходим для обработок экзогенной RA, чтобы восстанавливать RA-дефицитных эмбрионов (Hernandez et al.,[2007]). Т.о., Cyp26a1, по-видимому, играет ключевую роль в заднем мозге, отличную от таковой Cyp26b1 или Cyp26c1 (которые не индуцируются в нервной системе с помощью RA) в компенсации изменений уровней RA (White et al.,[2007]).
Cyp26a1-обусловленная деградация также вносит вклад в пространственную динамику передачи сигналов RA во многих др. тканях и органах. Table 2 обобщает домены экспрессии cyp26a1 вне заднего мозга. Сюда входит краниальная мезодерма у рыб (blue in Fig. 4B; Dobbs-McAuliffe et al.,[2004]) и мышей (Fig. 4I), эктодерма зачатков конечностей и дорсальная часть спинного мозга у кур (Swindell et al.,[1999]; Blentic et al.,[2003]), границы сомитов у Xenopus и рыбок данио на стадиях поздней сегментации (Hollemann et al.,[1998]; de Roos et al.,[1999]; Dobbs-McAuliffe et al.,[2004]), также и зачаток хвоста, нейральная сетчатка и фарингеальные дуги. Cyp26a1, подобно Cyp26b1 и Cyp26c1 (see below) также может играть рольв формировании позднего паттерна в заднем мозге кур и мышей, где экспрессируется в полоске клеток, описываемой как r2 или r3 (Fig. 4F,H; Fujii et al.,[1997]; Swindell et al.,[1999]; Blentic et al.,[2003]). Вне заднего мозга, Cyp26a1, по-видимому, также действует внутри сосудистой системы мышей (MacLean et al.,[2001]; Ribes et al.,[2007a]) и во многих др. тканях, в которых он экспрессируется.
Cyp26b1
В противоположность Cyp26a1, Cyp26b1 экспрессируется, по-видимому, позднее и в виде более динамичного паттерна в заднем мозге (yellow in Fig. 4; Table 2). Во всяком случае паттерн слегка отличается: 1) у рыбок данио сначала в r3/4 (Fig. 4B) и r2-6 на стадиях ранних сомитов (Fig. 4C; Zhao et al.,[2005]), 2) у кур сначала в r4, расширяясь до r1-6 (Fig. 4F; Reijntjes et al.,[2003]), 3) у мышей первоначально в r3 и r5 и позднее в r2-6 (Fig. 4H,I; MacLean et al.,[2001]). Эти паттерны указывают на то, что Cyp26b1 создает новый слив (sink) для RA внутри центральной части заднего мозга (r3-5) в конце гаструляции, который в конечном итоге затрагивает все за исключением самых задних ромбомеров.
Прямые доказательства, что cyp26b1 вносит вклад в развитие заднего мозга получены в исследованиях на рыбках данио. MOs, которые ингибируют продукцию белка Cyp26b1, не вызывают дефектов в формировании паттерна заднего мозга у себя, но будучи инъецированными мутантам cyp26a1, они вызывают расширение r4, а граница r6/7 сдвигается кпереди (Fig. 3I; Hernandez et al.,[2007]; see below), а на более поздних стадиях вызывает дефекты черепно-лицевых структур (Reijntjes et al.,[2007]). Эти данные указывают на то, что cyp26a1 и cyp26b1 играют частично перекрывающуюся роль в ингибировании передач сигналов RA в заднем мозге.
Мутации потери функции Cyp26b1-/- у мышей вызывают аномалии в конечностях и черепно-лицевом скелете, а также потерю зародышевых клеток из семенников (Yashiro et al.,[2004]; MacLean et al.,[2007]), но не дают крупных дефектов заднего мозга. Cyp26b1 экспрессируется в зачатках конечностей передние и задние конечности укорочены у мутантов, так что проксимальные характеристики расширяются за счет дистальных, а также выявляется повышенная экспрессия репортерных генов, чувствительных к RA (Yashiro et al.,[2004]; MacLean et al.,[2007]). Кроме того, зародышевые клетки вступают в мейоз преждевременно и погибают из-за апоптоза у этих мутантов (MacLean et al.,[2007]). Дикого типа семенники, обработанные синтетическими ретиноидами, которые не могут быть метаболизированы с помощью CYP26B1, обнаруживают те же самые дефекты. Эти результаты указывают на то. что повышение передач сигналов RA скорее, чем потеря продуцируемых CYP26B1 метаболитов, вызывает эти фенотипы.
Table 2 суммирует экспрессию Cyp26b1 в регионах вне заднего мозга. Сюда входит зачаток хвоста (не показан) и краниальная мезодерма у кур (Fig. 4E; Reijntjes et al.,[2003]), это напоминает экспрессии cyp26a1 в презумптивной краниальной мезодерме у рыбок данио и мышей (Dobbs-McAuliffe et al.,[2004]; Fig. 4B,I).
Cyp26c1
Cyp26c1 также экспрессируется в заднем мозге и паттерн экспрессии варьирует существенно между видами: (1) у рыбок данио экспрессия начинается на ст. бластулы, оказывается ограниченной r2-4 (red in Fig. 4A) и в конечном счете расширяется на r2-6 (Fig. 4B; 11h; Gu et al.,[2005]; Hernandez et al.,[2007]) и дорсальную часть заднего мозга, (2) у кур экспрессия начинается во время гаструляции в передней мезодерме (Fig. 4D,E). В нервной трубке он экспрессируется в презумтивной r2/3 (St. 10), затем распространяется на r2-5 (Fig. 4F) и верхнюю часть трубки (Reijntjes et al.,[2004]), (3) у мышей экспрессия Cyp26c1 первоначально появляется в головной мезенхиме на ст. E7.5 (Fig. 4G; Uehara et al.,[2007]) и затем экспрессируется после гаструляции в r2 и r4 (Fig. 4H) и затем теряется из r4 (Fig. 4I; Tahayato et al.,[2003]). Эти паттерны указывают на то, что Cyp26c1, подобно Cyp26b1, формирует сток (sink) для RA в центральных ромбомерах (r2-6) заднего мозга, это редуцирует RA в клетках, которые экспрессируют его и помогает держать форму градиента RA в соседних клетках.
Cyp26c1-дефицитные мыши жизнеспособны и не обнаруживают очевидных анатомических аномалий (Uehara et al.,[2007]). Однако, Cyp26a1-/- Cyp26c1-/- двойные мутанты имеют тяжело posteriorized задний мозг и погибают во время эмбриогенеза (Fig. 3J). Голова и глаза мутантов редуцированы, а нервная трубка неспособна к закрытию. Экспрессия Hoxb1 и Fgf8 в заднем мозге расширяется кпереди, как это делает экспрессия RARE-lacZ (Uehara et al., 2006), подтверждая усиление передачи сигналов RA. Krox-20 (Egr2b, который обычно маркирует r3 и r5) экспрессируется в одиночной широкой полоске у двойных мутантов (Fig. 3J). Кроме того, потеря функции Aldh1a2 у Cyp26a1-/- Cyp26c1-/- двойных мутантов частично нормализует фенотип, подтверждая, что это обусловлено повышенными уровнями RA (Uehara et al.,[2007]).
Hernandez et al. ([2007]) также вызывали истощение только cyp26c1 и в комбинации с др. Cyp26s у рыбок данио и нашли, что потребность в них частично перекрывается. Инъекции только cyp26c1-MO или вместе с cyp26b1-MO лишь слегка укорачивали задний мозг. Однако инъекции cyp26c1-MO эмбрионам cyp26a1-/- вызывали потерю r2/3, переднюю экспансию r4, укорочение r5/6 и передний сдвиг границы r6/7 (Fig. 3K). Истощение всех трех Cyp26 энзимов у рыбок данио приводило к более драматическим фенотипам - массивной posteriorization r2-7, при этом весь задний мозг выглядел. как приобретший r7-подобные качественные характеристики (Fig. 3L). У тройных мутантов, r3 и r5 потеряны, r4 примыкает к мозжечку (r1), а граница r6/7, по-видимому, располагается сразу позади r4 (Hernandez et al.,[2007]). Сходные трансформации возникали при обработке эмбрионов химическим ингибитором активности Cyp26 и они могли быть устранены при одновременной обработке эмбрионов DEAB (соединение, которые блокирует синтез RA). Всё это предоставляет строгие доказательства, что 1) все три Cyp26s необходимы для формирования паттерна A-P оси заднего мозга и 2) что дефекты, вызываемые удалением их функций обусловлены избытком передачи сигналов RA скорее, чем отсутствием Cyp26-зависимых метаболитов.
Table 2 суммирует др. места экспрессии Cyp26C1 у видов, включая глоточные дуги, головную мезенхиму (презумптивную мезодерму) вблизи ушей и небольшой участок сетчатки у рыбок данио (Gu et al.,[2005]).
THE ROLE OF RA IN HINDBRAIN DEVELOPMENT
Учитывая эту новую информацию о деградации RA, как мы можем представить себе передачу сигналов RA вдоль A-P оси в заднем мозге? RA синтезируется с помощью Aldh1a2 в параксиальной мезодерме туловища (Niederreither et al.,[1997]), а деградирует с помощью Cyp26a1 а передней части нервной пластинки в голове (Hale et al.,[2006]; Tallafuss et al.,[2006]). Это ведет к модели, согласно которой RA формирует снижающийся кпереди концентрационный градиент, который действует как морфоген, чтобы сформировать паттерн поля заднего мозга (Fig. 5A; Berggren et al.,[1999]; Swindell et al.,[1999]). Однако градиент RA никогда не был продемонстрирован непосредственно в основном из=за технических причин. Мы рассмотрим доказательства за и против этой модели морфогена для RA в развитии заднего мозга.
Первоначальные доказательства этой модели были получены в экспериментах на эмбрионах лягушки и кур, в которые воздействия экзогенной RA вызывали зависимые от концентрации эффекты на формирование паттерна заднего мозга (Durston et al.,[1989]; Sive et al.,[1990]; Marshall et al.,[1992]; Godsave et al.,[1998]). Важным для этой модели оказалось то, что избыток RA заставляет задние ромбомеры расширяться безусловно за счет передних сегментов. Кроме того, воздействия химических антагонистов RARs (таких как BMS493), продемонстрировали, что ромбомеры нуждаются в передаче сигналов RA способом, зависимым как от концентрации, так и времени (Dupe and Lumsden,[2001]). В отсутствие передачи сигналов RA передние ромбомеры расширяются и замещают задние сегменты, это согласуется с градиентной моделью. Задние ромбомеры также нуждаются в более высоких концентрациях RA для развития, а разные концентрации фармакологических блокаторов Aldh1as, ингибирующих синтез RA , также вызывают градированную anteriorization заднего мозга (Begemann et al.,[2004]; Maves and Kimmel,[2005]).
Одним из основных аргументов против модели морфогена выступает четкий время-зависимый аспект в формировании ромбомеров (Dupe and Lumsden,[2001]; Maves and Kimmel,[2005]; Sirbu et al.,[2005]). Клетки могут не реагировать на концентрацию RA, действию которой они подвергаются, а скорее определяют продолжительность времени воздействия (Gavalas,[2002]; Maden,[2002]; Sirbu et al.,[2005]). Некоторые исследования предполагают существование двух фаз в передаче сигналов RA в заднем мозне: (1) первоначально она распространяется вплоть до границы r2/3 и (2) позднее ограничивается сзади до границы r4/5 благодаря деградации с помощью Cyp26c1 (Fig. 5B). В этой модели сдвига границ деградации r5/6 специфицируются, т.к. они подверглись действию сигналов RA в течение дольшего времени, чем r3/4. Это, однако точно не устраняет зависимые от концентрации эффекты RA. Фактически, Sirbu et al. ([2005]) привлекают концентрационную зависимость для объяснения паттернов экспрессии hoxb1 и vHNF1 в своей модели. Cyp26c1 мутантные мыши также не обнаруживают фенотипических отклонений в заденем мозге, это говорит против модели поздней фазы (Uehara et al.,[2007]).
Maves and Kimmel ([2005]) выдвигают аргументы против временной модели, базируясь на своей работе с задним мозгом рыбок данио. Они показали, что гены мишени для RA (напр., hox гены) нуждаются в передаче сигналов RA только в начале их экспрессии. Кроме того, достаточно высокие концентрации индуцируют задние гены мишени, такие как hoxd4, значительно раньше, по сравнению с их нормальным началом (Maves and Kimmel,[2005]). Т.о., задние гены не нуждаются в более продолжительной экспозиции RA. Вместо этого они могут нуждаться в более высоких уровнях RA, чем впереди экспрессирующиеся гены и могут активироваться позднее, т.к. увеличение синтеза RA происходит на более поздних стадиях (Fig. 5C; Maves and Kimmel,[2005]). Это может указывать на то, что градиент RA увеличивается со временем и что высокие концентрации, необходимые для для генов, экспрессирующихся в задних частях, достигаются позднее, создавая кажущуюся временную зависимость.
Остается ещё возможность, что клетки каким-то образом интегрируют силу и продолжительность экспозиции сигнала RA и что высокая концентрация соответствует более длительной экспозиции. Сходная модель была предложена для механизма действия Shh при формировании паттерна вдоль dorsal-ventral (D-V) оси нервной трубки позвоночных (Dessaud et al.,[2007]).
Hernandez et al. ([2007]) предлагают др. модель включения времени, согласно которой энзимы деградации также играют центральную роль (Fig. 5D). Это базируется на элегантном наборе исследований потери функции разных Cyp26s у рыбок данио. В их модели RA действует скорее пермиссивно, чем инструктивно в заднем мозге. Достаточный уровень передачи сигналов RA в целом скорее, чем концентрационный градиент, делает возможной генную экспрессию в разное время и в разных местах под контролем некоего др. механизма формирования A-P паттерна. Передача сигналов происходит в регионах заднего мозга, не экспрессирующих каких-либо Cyp26 энзимов, это делает возможной экспрессию соотв. генов мишеней для RA, подобно тому, что в модели Sirbu et al. ([2005]). Онтогенетическое время диктует, какие гены будут экспрессироваться на каждой данной ступени. С этим сдвигом границ деградации, RA сначала закладывает переднюю границу экспрессии hoxb1 и затем закладывает границы последовательно всё более задних генов.
Подобно Sirbu et al. ([2005]), эти исследования показали, что как пространственная. так и временная активность RA контролируется с помощью Cyp26-обеспечиваемой деградации. Обе модели указывают на то, что некоторая др. A-P паттерн-формирующая информация управляет экспрессией Cyp26. Т.о., важной следующей ступенью должна стать идентификация такой информации.
Благодаря нашим собственным экспериментальным исследованиям на эмбрионах рыбок данио в комбинации с компьютерным анализом передачи сигналов RA , мы недавно предложили др. модель, которая, как мы полагаем, может удовлетворить большинству признаков, обсужденных выше (Fig. 5E; White et al.,[2007]). В противоположность большинству предыдущих исследований мы показали, что cyp26a1 экспрессируется боле широко, чем непосредственно передняя часть нервной пластинки. Во время гаструляции презумптивный задний мозг сам по себе также экспрессирует cyp26a1, хотя и на очень низких уровнях и этот домен экспрессии нуждается в передаче сигналов RA. Эти результаты указывают на более тонкую роль Cyp26a1, чем просто действие в качестве переднего sink. Мы полагаем, что Cyp26a1 динамически модулирует уровни передачи сигналов RA и компенсирует флюктуации в величине синтеза RA. Т.о., если продукция RA снижается, то снижается и Cyp26a1-обеспечиваемая деградация, чтобы компенсировать и vice-versa.
Передача сигналов Fgf от задней части эмбриона также ингибирует экспрессию cyp26a1 . Fgf формирует кпереди снижающийся градиент , который параллелен таковому RA и способствует заднему развитию (Kudoh et al.,[2002]; White et al.,[2007]). Следовательно, противоположные воздействия RA и Fgf регулируют уровни Cyp26a1, при этом RA способствует, а Fgf супрессирует экспрессию, соотв. Мы полагаем, что эти противоположные силы и создают чрезвычайно устойчивую систему (т.e., устойчивую к флюктуациям доступности витамина А и синтеза RA , напр.). Как мы упоминали раньше, путь передачи сигналов RA включает множество обратных связей и петель прямой связи (feed-forward), как это имеет место и в сигнальном пути Fgf и поэтому имеется множество точек взаимодействия между двумя системами (Shiotsugu et al.,[2004]; White et al.,[2007]). Т.о., мы считаем. что дв предполагаемых морфогенетических градиента, которые возникают в задних частях эмбриона, RA и Fgf, формируют интегрированную систему. в
Эта модель поможет разрешить классическую точку зрения на RA как морфоген, по крайней мере, с двумя кажущимися противоречивыми результатами: (1) что обработка RA-дефицитных эмбрионов униформными концентрациями экзогенной RA полностью восстановит формирование паттерна заднего мозга в широком наборе концентраций (Fig. 6), и (2) что ромбомеры не все возникают на одной и той же стадии - гены, специфицирующие задние сегменты экспрессируются позднее, чем гены, которые специфицируют передние сегменты.
Противодействие первой критике было получено в наших компьютерных подходах модели морфогена. Интересно, что одним из следствий, связанным с cyp26a1, индуцируемому с помощью RA и ингибируемому с помощью Fgf, является то, что любая униформная внеклеточная концентрация RA быстро превращается во внутриклеточный концентрационный градиент. Более того, индукция cyp26a1 с помощью RA также делает этот градиент устойчивым к изменениям уровней RA. В соотв. с этой идеей функциональный Cyp26a1 (но не cyp26b1 или cyp26c1) необходим для экзогенной RA, чтобы восстановить формирование паттерна заднего мозга (Hernandez et al.,[2007]). Т.к. нормализация паттерна заднего мозга у RA-дейицитных эмбрионов происходит при концентрациях свыше 20-кратных (Hernandez et al.,[2007]), то устойчивость имеет свои пределы. Воздействия выше верхней границы этих рангов постериоризуют задний мозг (Fig. 6F), в то время как воздействия ниже нижнего предела (0.25 nM) ведут к неполному восстановлению (Fig. 6C).
Противодействие вторичной критике относительно времени получены в работе Maves and Kimmel ([2005]), которые показали, что экспрессия задних генов мишеней для RA в заднем мозге не нуждается в продолжительной экспозиции RA - высокие уровни RA могут активироваться затем постоянно. Это указывает на то, что градиент RA со временем растет. Рост может происходить за счет постепенного увеличения величины синтеза RA или за счет снижения уровня деградации RA. Базируясь на нашей компьютерной модели, мы предположили, что последнее наиболее вероятно - ингибирование cyp26a1 с помощью Fgf снижается по мере увеличения эмбриона. Это ведет к увеличению градиента RA, который остается тонко связанным с гаструляционными движениями, контролируемыми, частично с помощью Fgfs (White et al.,[2007]).в
Наша модель включает только взаимодействия RA и Fgf и они ограничены стадией гаструлы, когда эти сигналы осуществляют свои первые эффекты по формированию A-P паттерна и развитию заднего мозга. Другие взаимоотношения могут существовать на более поздних стадиях. Напр., Fgfs начинают экспрессироваться на границе между средним и задним мозгом и внутри самого заднего мозга в конце гаструляции (напр., r4), и cyp26b1 и cyp26c1 экспрессируются в специфических ромбомерах (see Fig. 4). Т.о., только очень ранние события в формировании A-P паттерна заднего мозга согласуются с нашей моделью, связанной с регуляцией cyp26a1. Позднее деградация с помощью cyp26b1 и cyp26c1 защищает субнаборы клеток в заднем мозге от RA способом, ранее предложенным
(Sirbu et al.,[2005]; Hernandez et al.,[2007]).
PERSPECTIVES: CHALLENGES AND POSSIBLE SOLUTIONS
The discovery of the Cyp26 enzymes and recent investigations into their roles have led to new insights into how cells establish and maintain appropriate levels of RA signaling. Degradation shapes the distribution of RA and is highly regulated, both in vertebrate embryos and presumably later in adults, in the various tissues and organs that RA is known to effect. However, many unanswered questions remain, such as how the complex expression patterns of Cyp26s are regulated. Our work has touched on two of these in the case of Cyp26a1, Fgf signaling and RA itself, but the network of interactions is no doubt much more complex.
It is also unclear if Cyp26-mediated degradation acts primarily in clearing RA from cells completely or more in subtle modulation of RA levels. Previous studies have suggested that Cyp26a1 expressed in the anterior neurectoderm creates a perfect sink, such that essentially all RA is removed. With our discovery of low-level cyp26a1 expression in the hindbrain, a tissue known to require RA, it seems that cells expressing cyp26 can still respond to RA. We have begun to address this question by transplanting small numbers of cells either overexpressing or deficient in Cyp26a1 and examining their responsiveness to RA (White et al.,[2007]).
One huge challenge that remains is visualizing the endogenous RA gradient, something that is currently technically impossible. Previous attempts to demonstrate a gradient have included measuring the amounts of RA using HPLC in the anterior and posterior limb bud and implanting beads soaked in radiolabeled retinoids into limbs to measure the distribution produced (Eichele and Thaller,[1987]; Thaller and Eichele,[1987]). These approaches have shown that artificial RA gradients can form and that some of the differences in RA concentrations one might expect of a morphogen do exist endogenously, but definitive proof is still absent. One approach would be to fluorescently tag RA and introduce it, either on implanted beads or as a caged-molecule, which can be uncaged locally using a laser. This would allow for real-time visualization of an ectopic gradient. Such information is crucial for understanding how differences in the concentration of this small, lipophilic vitamin derivative lead to such specific effects on cell fates, such as the formation of rhombomeres and segment boundaries in the vertebrate hindbrain.
