Посещений:
ПЕРЕДАЧА СИГНАЛОВ WNT

Интеграция Wnt Сигналов

Towards an integrated view of Wnt signaling in development
Renee van Amerongen и Roel Nusse*
Development 136, 3205-3214 (2009) doi:10.1242/dev.033910

Wnt signaling is crucial for embryonic development in all animal species studied to date. The interaction between Wnt proteins и cell surface receptors can result in a variety of intracellular responses. A key remaining question is how these specific responses take shape in the context of a complex, multicellular organism. Recent studies suggest that we have to revise some of our most basic ideas about Wnt signal transduction. Rather than thinking about Wnt signaling in terms of distinct, linear, cellular signaling pathways, we propose a novel view that considers the integration of multiple, often simultaneous, inputs at the level of both Wnt-receptor binding и the downstream, intracellular response.

D. Wang, B. Huang, S. Zhang, X. Yu, W. Wu, X. Wang, Structural basis for R-spondin recognition by LGR4/5/6 receptors. Genes Dev. 27, 1339–1344 (2013).

P.-H. Chen, X. Chen, Z. Lin, D. Fang, X. He, The structural basis of R-spondin recognition by LGR5 and RNF43. Genes Dev. 27, 1345–1350 (2013).


R-spondins (RSPOs) являются секретируемыми ростовыми факторами, которые усиливают передачу сигналов Wnt/β-catenin посредством соединения с leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptors (LGRs). RSPOs также соединяются с трансмембранными E3 ubiquitin лигазами RNF43 и ZNRF3 и запускают их интернализацию. Поскольку RNF43 и ZNRF3 способствуют деградации Wnt рецепторных комплексов, то интернализация этих E3 лигаз усиливает передачу сигналов Wnt. Два исследования описывают структуры RSPOs человека, связанных с внеклеточными доменами LGRs и RNF43. Wang et al. установили кристаллическую структуру внеклеточного домена (ECD) в LGR4, N-терминальной части RSPO1 и связи этих белков др. с др. ; Chen et al. описывают структуру LGR5-RSPO1-RNF43 комплекса, используя LGR5 ECD, внеклеточный домен RNF43, ассоциированный с протеазой и N-терминальную часть RSPO1. Wang et al. установили, что LGR4 ECD образует подковообразную структуру, вогнутая сторона которой контактирует с furin-подобными cysteine-богатыми доменами (CRDs) в N-терминальной части RSPO1. Используя сайт-направленный мутагенез, авт. подтвердили, что аминокислоты RSPO1, которые контактируют с LGR4 являются критическими для соединения, обеспечивая как гидрофобные, так и гидрофильные взаимодействия. Эти RSPO1-LGR4 взаимодействия сравнимы с RSPO1-LGR5 взаимодействиями в структуре LGR5-RSPO1-RNF43 комплексов, изученных Chen et al. Это исследование также выявило, что ?-шпилька RSPO1 вставляется в борозду в RNF43, но что кристаллизованные внеклеточные домены RNF43 и LGR5 не контактируют др. с др. Соединение RSPO1 с LGR5 увеличивает сродство RSPO1 с RNF43, подтверждая, что взаимодействие между RSPO1 и LGR5 стабилизирует ?-шпильку RSPO1, что способствует взаимодействию RSPO1-RNF43. Остатки, соответствующие известным мутациям в RSPO4 и RNF43, ассоциированным с болезнью, картированы на сторонах взаимодействия (interface) RSPO-RNF43 . Что это соединение RSPO1 с LGR5 способствует взаимодействию между RSPO1 и RNF43 согласуется с предыдущими наблюдениями, что хотя RSPO1 может соединяться с ZNRF3 в отсутствие LGR4, RSPO1-обусловленное очищение мембраны от ZNRF3 зависит от присутствия LGR4. Эти структурные исследования подкрепляют модель, согласно которой LGRs способствуют соединению RSPOs с RNF43 или ZNRF3, приводя в конечном итоге к снижению деградации Wnt рецепторных комплексов и усилению передачи сигналов Wnt.
Независимо от того, результатом является круглый червь C. elegans, состоящий точно из 959 соматических клеток, или новорожденное дитё, в котором содержатся триллионы клеток, любая программа развития внушает благоговение. На клеточном уровне все процессы развития в конечном итоге контролируются кооперативным действием разных путей передачи сигналов. Среди них передача сигналов Wnt обязательна для организации сложных клеточных поведений, которые происходят во время развития (rev. Croce и McClay, 2008). Wnt передача сигналов контролирует пролиферацию клеток, поддержание стволовых клеток c и выбор клеточных судеб, а также организованные клеточные перемещения и становление тканевой полярности. Она часто нарушена в раковых опухолях человека и сопричастна к дегенеративным болезням. В качестве потенциальной мишени для терапевтического вмешательства она также несет новые обещания в области биологии стволовых клеток и регенеративной медицины.
Как можно заключить, исходя из участия её в столь разнообразных биологических процессах, передача сигналов Wnt сама по себе прирожденно сложна. Во-первых, и лиганды и рецепторы, участвующие в передаче сигналов Wnt, принадлежат к крупным мультигенным семействам, это делает возможными большое количество лиганд-рецептор взаимодействий (rev. Kikuchi et al., 2009). Во-вторых, Wnt-рецептор взаимодействия могут выявлять разнообразные внутриклеточные реакции, наиболее известные из которых ведут к активации β-catenin/TCF транскрипционных комплексов. Однако, Wnt белки также участвуют в активации др. внутриклеточных мессенджеров, включая токи кальция, Jnk и Src киназы, чтобы назвать хоть несколько. С годами мы приходим к точке зрения, что разные реакции, стоящие ниже Wnt-рецептор соединений, являются самостоятельными, линейными путями (rev. James et al., 2008; Komiya и Habas, 2008) (Box 1). Однако в свете появляющихся экспериментальных доказательств, мы понимаем, что мы д. отойти от этой концепции, т.к. современные модели недостаточны для объяснения сложных реакций, которые часто наблюдаются в развивающихся организмах.
Отметим, что компоненты действительно на каждом уровне передачи сигналов Wnt, как было установлено, затрагивают как β-catenin зависимые так и -независимые реакции в зависимости от клеточного контекста. Как мы обсудим ниже, это верно как для самих Wnt белков, так и для их рецепторов и некоторых внутриклеточных мессенджеров. Вряд ли мы придем к заключению, что эти белки общие между путями, вместо этого мы предположим, что существует тотальная сеть сбалансированных сигналов, которые в конечном итоге предопределяют реакцию воспринимающей клетки. В контексте интактного и развивающегося организма, клетки, получающие множественные, динамические, часто одновременные и иногда даже конфликтующие сигналы, все они интегрируются, чтобы вызвать в ответ соответствующее клеточное поведение. В этом случае разные сигнальные пути могут т.о. могут быть более интимно переплетены, чем предполагалось ранее. Фактически, с перспективы биолога развития, неправильно рассматривать их как отдельные пути вообще.

historical perspective of Wnt signaling in development


Основы изучения передачи сигналов Wnt были сформированы в 1980s и начале 1990s, когда генные продукты генов Drosophila wingless (wg) и мышиного Int1 (позднее Wnt1) , как было установлено, принадлежат большому семейству, эволюционно консервативных белков внеклеточных сигнальных молекул (Rijsewijk et al., 1987). Название 'Wnt' происходит от комбинации wingless и Int1. Ген Int1 первоначально был идентифицирован как онкоген, который после инсерционной активации с помощью mouse mammary tumor virus (MMTV), вносил вклад в формирование карцином молочных желез (Nusse и Varmus, 1982). Когда у Drosophila был выделен ген wg и затем было установлено, что он гомологичен Int1 (Baker, 1987; Cabrera et al., 1987; Rijsewijk et al., 1987).
Др. компонент передачи сигналов Wnt идентифицирован при прогрессивном генетическом скрининге и функциональном картировании с помощью экспериментов по эпистазу (тест на способность одного гена супрессировать эффекты др. гена, позволяя тем самым поместить их выше или ниже один др. ) у Drosophila, при этом выявлено и консервирование у разных видов. Это Frizzled (Fz) трансмембранный рецептор и нижестоящие эффекторы Dishevelled (Dsh; Dvl), β-catenin/Armadillo и T cell factor (TCF)/Pangolin (Brunner et al., 1997; Dominguez et al., 1995; Noordermeer et al., 1994; Peifer et al., 1991; Siegfried et al., 1994; Sokol et al., 1995; Sussman et al., 1994; van de Wetering et al., 1997). Эти исследования построили каркас того, что стало известно как Wnt/β-catenin путь (Box 1).
В течение ряда лет область Wnt была сфокусирована на выяснении биохимических механизмов, которые контролируют активность β-catenin/TCF (rev. Barker, 2008; Huang и He, 2008; Moon et al., 2004). Это обусловливалось в основном тем фактом, что β-catenin часто обнаруживался мутантным в раковых опухолях человека, вызывая гиперактивацию передачи сигналов Wnt/β-catenin практически во всех раках кишечника и в различных др. злокачественных новообразованиях. Лишь недавно внимание сместилось обратно на клеточные мембраны, где передача сигналов инициируется связыванием Wnt белков с мембранными рецепторами.
Мы знаем, что геномы Drosophila, C. elegans, Xenopus и высших позвоночных обладают множественными Wnt генами (всего 19 у млекопитающих). Отметим, что удивительно разнообразный репертуар Wnt уже присутствует у Cnidarians, старейшего phylum метазоа, который включает пресноводные полипы и морских анемон (Guder et al., 2006). Это не только указывает на то, что разнообразие генов Wnt возникает рано, но и также, что это существенно для собственно развития многоклеточных организмов. Такая генетическая сложность обнаруживается также на уровне прототипного Wnt рецептора, Frizzled, рецептора клеточной поверхности с 7 трансмембранными сегментами, и Wnt-связывающего сайта в форме cysteine-rich domain (CRD) (Bhanot et al., 1996). В целом 4 Frizzled рецепторов было идентифицировано у Drosophila и C. elegans, и 10 Frizzled рецепторов найдено у мыши и человека [see Table 1 for an overview of the Wnt и receptor proteins that have been identified in commonly utilized model organisms; таблица даёт детальный обзор разных взаимодействий Wnt-рецептор (Kikuchi et al., 2009)].
C самого начала исследователи пытались сгруппировать Wnt белки в классы со специфическими активностями. Это привело к подразделению Wnts на 'canonical' или 'non-canonical', исходя из способности первых, но не последних, индуцировать эктопическую ось у эмбрионов Xenopus (McMahon и Moon, 1989) и вызывать морфологические трансформации C57MG молочных клеток мыши (Wong et al., 1994). Обе эти активности коррелируют с увеличением уровней β-catenin и сопутствующим увеличением передачи сигналов β-catenin/TCF (Shimizu et al., 1997). Исследования на Drosophila показали, что frizzled и dishevelled необходимы для установления тканевой полярности независимо от β-catenin/TCF (Strutt et al., 1997; Theisen et al., 1994; Vinson и Adler, 1987). Если определенные неканонические Wnts, как было установлено, участвуют в родственных процессах, которые контролируют движения конвергентного удлинения (convergent extension) во время развития позвоночных (Heisenberg et al., 2000; Tada и Smith, 2000;



Box 1. Intracellular responses downstream of Wnt-receptor binding Wnt-receptor binding can elicit a variety of intracellular responses. (A) The interaction of Wnt with Frizzled и low-density lipoprotein receptorrelated protein (LRP) results in the activation of β -catenin/T cell factor (TCF) signaling. This requires inactivation of a 'destruction complex', comprising Adenomatosis polyposis coli (APC), Axin, glycogen synthase kinase 3b (Gsk3b) и Casein kinase I(CKI) that normally sequesters и phosphorylates newly synthesized β-catenin, targeting it for degradation by the proteasome. Phosphorylation of the cytoplasmic tail of LRP has also been shown to be crucial for Wnt/β-catenin signaling. Although direct evidence demonstrating an endogenous Wnt-Frizzled-LRP complex is lacking, there are sufficient data to conclude that such a trimeric complex exists in vivo (e.g. Bilic et al., 2007; Holmen et al., 2005; Liu et al., 2005). (B) Binding of Wnts to the receptor tyrosine kinase (RTK) Ror2 can inhibit β-catenin/TCF signaling и activate Jnk. The mechanisms that underlie these activities are still incompletely understood. (C) Frizzled receptors are implicated in the establishment of planar cell polarity (PCP) и in the control of polarized cell migration (reviewed by Simons и Mlodzik, 2008). In flies, but not vertebrates, these responses appear to occur independently of a Wnt-Frizzled interaction (as indicated by a question mark in the figure). Rather than β-catenin/TCF complexes, the establishment of PCP is thought to involve a set of distinct downstream messengers that include Dishevelled (Dvl), small Rho GTPases и Jnk. In some cases, Frizzled receptors can induce Ca2+ fluxes. (D) Wnt proteins have also been shown to bind to Ryk RTKs, mostly in the context of neuronal development, resulting in the activation of Src proteins. Although this article focuses on the integration of signals at the level of Wnt-receptor binding, it is important to note that integration also occurs further downstream, as it is a general feature of any signaling network. Many of the depicted players have been implicated in more than one cellular response. For instance, Dvl is generally thought to function at the crossroad of Wnt/β-catenin и Frizzled/PCP signaling (Boutros и Mlodzik, 1999), whereas Rac и Jnk, which have been implicated in a β-catenin-independent response downstream of Dvl, were recently shown to activate β-catenin/TCF (Wu et al., 2008). Other proteins, such as Nkd, Inversin и Diversin, have been considered to function as molecular 'switches', by inhibiting one intracellular response и promoting another (Schwarz-Romond et al., 2002; Simons et al., 2005; Yan et al., 2001), и they too might be prime examples of nodes in the network that integrate different signaling inputs.



Tabl.1. Conservation of Wnt and Frizzled proteins across metazoan species



  • Overview of the different Wnt proteins and Frizzled cell surface receptors found in several metazoan species. Orthologs are grouped together based on published phylogenetic analyses (Huang and Klein, 2004; Kusserow et al., 2005; Lengfeld et al., 2009; Minobe et al., 2000; Momose and Houliston, 2007; Prud’homme et al., 2002; Schubert et al., 2000).
  • *Of note, 11 out of the 12 Wnt subfamilies found in mammals are also found in the sea anemone Nematostella vectensis, which suggests that the high genetic complexity that was present in a common metazoan ancestor has been lost in Drosophila and C. elegans.
  • †The nomenclature of Wnt proteins and receptors in C. elegans (and, to a lesser extent, Drosophila) does not follow that of vertebrate species.
  • ‡The Xenopus genome has not yet been sequenced completely; therefore, additional Wnt proteins and/or receptors might still be identified.


    • Wallingford et al., 2001), то различие между двумя группами лигандов резко очерчены: канонические Wnts соединяются с Frizzled и активированным β-catenin/TCF, тогда как неканонические Wnts соединяются с Frizzled и активированными малыми Rho GTPases, c-Jun N-terminal kinase (Jnk) и др. β-catenin-независимыми сигнальными событиями. Однако, прирожденные свойства индивидуальных Wnt белков лишь часть истории и в свете сегодняшних знаний, кажется нелепым обозначать данные Wnt как канонические и неканонические. Во-первых, идентифицированы члены low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP; Arrow у Drosophila) семейства как трансмембранные ко-рецепторы для Frizzled (Mao et al.,

    Fig. 1. Wnt proteins и their interaction partners. Depending on the developmental time-point, as well as on the tissue и cell type, Wnt proteins (with different family members depicted in blue и yellow) can encounter a multitude of different interaction partners that determine the response of the signal-receiving cell, with most Wnt signal transduction components not dedicated to a single intracellular response. Proteins that promote Wnt-Frizzled activity are depicted in green; proteins that impede Wnt-Frizzled activity are in red. See text for details. (A)Wnt proteins can engage with a variety of cell surface receptors, including members of the Frizzled seven-transmembrane-spanning receptor family. In order for β-catenin/TCF signaling to occur, the LRP co-receptor must be recruited into the Wnt-Frizzled complex. LRP availability is determined by the balance between its internalization и plasma membrane presentation (mediated by Dkk и Kremen). Other co-factors, such as R-Spondin и Wise, also affect Wnt-receptor complex activity, with R-Spondin competing with Dkk for binding to Kremen (Binnerts et al., 2007), и with Wise capable of both promoting и inhibiting Wnt signaling. Finally, non-Wnt proteins, such as the unrelated ligand Norrin, can compete for binding to Frizzled receptors (Xu et al., 2004). (B,C)Wnt proteins can also bind to single-pass transmembrane RTKs of the Ryk и Ror families. (D)In some cases, the Wnt-receptor interaction might require the recruitment of additional co-factors. For instance, Cthrc1 can promote the formation of a Wnt-FrizzledRor complex (see text for details). (E)Little is known about the active conformation of Wnt proteins. They might signal as monomers, or in homo-, hetero- or oligomeric complexes. (F)In the extracellular space, Wnt proteins can encounter secreted inhibitors, such as Wifs и Sfrps, both of which bind и inhibit Wnt proteins directly.

    2001; Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000) (Fig. 1A). Фактически, фосфорилирование LRP/Arrow, также как и его способность формировать крупные агрегаты или 'signalosomes', оба необходимые для функции Frizzled, как недавно было показано обязательны для накопления β-catenin в ответ на Wnt стимуляцию у многих видов (Bilic et al., 2007; Tamai et al., 2004; Zeng et al., 2008). Кроме того, определенные non-Frizzled рецепторы, как было установлено, способны передавать Wnt сигналы. Один раз пронизывающие трансмембранные receptor tyrosine kinases (RTKs) из семейств Ryk и Ror, по-видимому, функционируют как настоящие Wnt рецепторы, при этом Wnt взаимодействия обеспечиваются с помощью Wnt inhibitory factor (Wif) доменов в случае Ryk рецепторов и с помощью CRD доменов в случае Ror рецепторов (Forrester et al., 2004; Green et al., 2007; Inoue et al., 2004; Lu et al., 2004; Mikels и Nusse, 2006; Oishi et al., 2003) (Fig. 1B,C). С идентификацией этого нового класса Wnt рецепторов, старые вопросы снова всплыли на поверхность: что же детерминирует специфичность Wnt-рецептор взаимодействий и что диктует нижестоящие клеточные реакции?

    Context-specific responses to Wnt


    По существу все эксперименты, на которых базировалась классификация Wnt белков, были осуществлены до идентификации LRP ко-рецепторов или альтернативных Wnt рецепторов Ryk и Ror. Оглядываясь, эти исследования необходимо рассматривать как отражение экспрессии рецепторов в изучаемой модельной системе, так и активности самих Wnts. Напр., в попытке определить специфичность лиганд-рецептор взаимодействия Takada и colleagues изучали эффект Wnt3A млекопитающих (традиционно рассматриваемый как канонический Wnt) и Wnt5A (как прототип неканонического Wnt) на ряд рецепторов Frizzled млекопитающих, гетерологически экспрессируемых в S2 клетках дрозофилы (Takada et al., 2005). В то время как Wnt3A четко стабилизировал уровни Drosophila β-catenin гомолога Armadillo в комбинации со специфическими рецепторами Frizzled, Wnt5A не способен делать это во всех протестированных условиях. Однако скорее, чем природные отличия в способности Wnt3A и Wnt5A активировать передачу сигналов β-catenin, этот исход может отражать неспособность Wnt5A рекрутировать LRP гомолог Arrow. В самом деле, Wnt5A способен индуцировать передачу сигналов посредством β-catenin/TCF в клетках человеческой 293 embryonic kidney клеточной линии, экспрессирующей Fz4 и LRP5 (Mikels и Nusse, 2006). Сходным образом, Wnt5A может индуцировать эктопическую ось у эмбрионов Xenopus в системе, которая экспрессирует Fz5 (He et al., 1997; Holmen et al., 2002). Эти исследования подчеркивают тот факт, что незначительные различия в сродстве индивидуальных Wnt белков к разным рецепторам и ко-рецепторам могут влиять на результаты эксперимента.
    Можно предположить, что способность Wnt5A индуцировать передачу сигналов β-catenin/TCF посредством Fz4 или Fz5 является артефактом избыточной экспрессии: в обычных биологических условиях, Wnt5A может никогда не встречать комбинации рецепторов, которые необходимы для этой активности. Тот факт, что эта перспектива через чур упрощена лучше всего иллюстрирует недавняя находка, что Wnt11, который также обычно рассматривается как не-канонический Wnt, и впрямь, по-видимому, выполняет двойную роль во время развития. Wnt11 безусловно необходим для движений конвергентного удлинения во время гаструляции амфибий (Heisenberg et al., 2000; Marlow et al., 2002; Smith et al., 2000; Tada и Smith, 2000), матерински же вносимый вклад Wnt11 кроме того инициирует формирование оси у ранних эмбрионов Xenopus, вызывая локальное накопление β-catenin (Tao et al., 2005). Недавняя работа показала, что материнский Wnt5A сходным образом активирует передачу сигналов β-catenin/TCF dj время формирования оси у Xenopus, поскольку истощение материнского Wnt5A фенокопирует потерю материнского Wnt11 (Cha et al., 2008). Конечно повышенная степень осторожности д. быть предпринята при обобщении функции индивидуальных Wnts, базируясь на данных использования кране отличающихся модельных организмов. Т.о., до тех пор, пока не будут картированы все Wnt-рецептор взаимодействия, которые возникают в контексте интактного организма и у разных видов, мы не можем исключить возможность, что Wnts обладают множественными активностями во время развития и современные доказательства подтверждают мнение, что они действительно так действуют. Интересно предположить, как передача сигналов Wnt может генерировать столь разнообразные результаты. Чтобы так действовать, важно реализовать в дополнение к видо-специфическим различиям множество наблюдаемых реакций, которые являются скорее всего стадио- и ткане-специфическими. Исход соединения Wnt-рецептор д. зависеть столь же и от истории развития воспринимающих клеток, как и от стимулов, которые воспринимаются. Напр., передача сигналов Wnt/β-catenin, как было установлено, способствует самообновлению и пролиферации различных стволовых клеток (Reya et al., 2003; Sato et al., 2004), но она и регулирует выбор разных клеточных судеб стволовыми клетками нервного гребня (Lee et al., 2004).
    Наблюдения, приведенные выше, ставят вопрос, почему необходимо столь много Wnt и Frizzled белков. Сам факт, что все виды животных сохраняют большое число разных Wnt белков в ходе эволюции указывает на то, что их функции не перекрываются. Однако в то время как делеция wg у Drosophila вызывает дефекты передачи сигналов β-catenin/TCF, делеция др. Drosophila Wnt генов не вызывает существенных онтогенетических дефектов. Фактически, за исключением Wnt2, мутанты, которых обладают гонадным фенотипом, функции остальных Wnt генов в основном обнаруживаются в контексте ко-делеции wg (Kozopas et al., 1998; Llimargas и Lawrence, 2001). Это может указывать на то, что др. Drosophila Wnts просто служат как ко-факторы, которые тонко настраивают активности Wg, но экспериментальные доказательства, подтверждающие гипотезу, отсутствуют.
    К сожалению, всё ещё остается задача картирования точных отличий в белковой структуре и рецептор-связывающих свойств разных Wnt белков. Попытки кристаллизовать их и определить их трехмерную структуру остались безуспешными и их гидрофобная природа вплоть до недавнего времени затрудняла из очистку (Willert et al., 2003; Willert, 2008). В целом, исследования, которые непосредственно были адресованы сродству связывания Wnt-Frizzled, ограничены. Эксперименты, которые используют закрепленные на мембране Drosophila, C. elegans или Xenopus Wnt белки и растворимые, секретируемые Frizzled CRD домены выявили, что определенные Wnt-Frizzled комбинации, по-видимому, предпочтительнее других (Bhanot et al., 1996; Green et al., 2007; Hsieh et al., 1999; Rulifson et al., 2000; Wu и Nusse, 2002). Однако всё ещё далеко от ясности, до какой степени специфические спаривания Wnt-рецептор, действительно обладают самостоятельными функциями. Более того, эти эксперименты вызывают предостережение, что они не учитывают какие-либо потенциальные модуляции взаимодействий Wnt-рецептор за счёт ко-рецепторов или за счет модификаций самих Wnts, которые могут влиять на реакции, которые возникают в контексте интактного развивающегося организма.

    Context-specific functions for cell surface receptors


    Клеточные реакции данного взаимодействия Wnt-рецептор, по-видимому, возникают в зависимости, по крайней мере частично, от сигнальной специфичности рецептора. В частности, последовательность C-конце белка Frizzled влияет на способность рецептора активировать передачу сигналов β-catenin/TCF. У Drosophila, Fz участвует в становлении planar cell polarity (PCP). Он обладает более низким сродством к Wg, чем Fz2, который участвует в передаче сигналов β-catenin/TCF скорее, чем в PCP (Bhanot et al., 1996; Bhat, 1998; Tomlinson et al., 1997). Обмен C-терминальной последовательностью Fz и Fz2 меняет их поведение (Boutros et al., 2000).
    Хотя такие разные сигнальные активности согласуются с моделью, в которой исходное событие передачи сигналов Wnt детерминируется рецепторами, с которыми сталкиваются на клеточной поверхности, имеются множество примеров, демонстрирующих, что это может быть слишком упрощенным мнением относительно рецепторов, как единственных детерминантов активации передачи сигналов Wnt. Напр., Xenopus Fz7, как было установлено, обеспечивает множественные внутриклеточные реакции. Fz7 влияет на движения конвергентного удлинения независимым от β-catenin/TCF способом, который использует Dishevelled, Syndecan 4 и Cdc42, но он также необходим для спецификации дорсо-вентральной мезодермы выше β-catenin/TCF (Medina et al., 2000; Munoz et al., 2006; Sumanas и Ekker, 2001; Sumanas et al., 2000). Сходным образом многие исследования продемонстрировали роль Ror2 в передаче сигналов Wnt5A, которые в конечном итоге ингибируют передачу сигналов β-catenin/TCF. Ror2, по-видимому, действует как настоящая RTK в данном случае (Billiard et al., 2005) (Fig. 1C). Недавние сообщения, однако, показали, что в разных клеточных контекстах, Ror2 может действовать, чтобы усиливать передачу сигналов β-catenin/TCF, индуцируемую с помощью Wnt1 или Wnt3A (Li et al., 2008; Winkel et al., 2008). Последний, по-видимому, не нуждается в тирозин киназной активности Ror2, это открывает возможность того, что Ror2 может также действовать как ко-рецептор, который только помогает презентации Wnts для Frizzled (Fig. 1D). Исследования на C. elegans указывают на ещё одну возможную функцию для Ror2. C. elegans. Ror2 гомолог CAM-1 противодействует клеточно-неавтономной передаче сигналов β-catenin/TCF (означая, что действует на клетки, другие, нежели клетки мишени для Wnt) и независимо от его цитоплазматического домена (Green et al., 2007). Т.к. CAM-1 способен взаимодействовать со многими C. elegans Wnts, поэтому авт. предложили модель, согласно которой CAM-1 действует как котлован для секвестрирования Wnt белков, ограничивая тем самым их эффективные диапазоны и концентрации. Остается определить, выполняет ли Ror2 сходную роль у др. организмов. Как иллюстрируется этими примерами, в то время как Wnt белки не могут быть строго подразделены на классы со специфическими активностями, функции Frizzleds и др. Wnt рецепторов и ко-рецепторов также контекст зависимы.

    Dynamic interactions determine the cellular response to Wnts


    В дополнение к Wnt белкам, обладающим потенциалом использовать разнообразные трансмембранные рецепторы, как Wnts и их рецепторы сталкивались с ко-регуляторами хозяина во внутри- и внеклеточном пространстве, многие из которых, по-видимому, выполняли двойную роль. Ниже мы обсудим некоторые из этих контекст-зависимые модификаторы детальнее, чтобы проиллюстрировать, как кумулятивные взаимодействия между этими разными факторами делают возможными гибкие и динамичные клеточные реакции на присутствие сигнала Wnt. Это - ни в коем случае исчерпывающий список, но служит, чтобы подчеркнуть динамику взаимодействий, которая скорее всего существует между многими из вовлеченных игроков.
    Как упоминалось выше каноническая β-catenin-зависима и неканоническая β-catenin-независимая реакции на Wnt стимуляцию в целом рассматриваются как отдельные пути. В частности, рекрутирование LRP ко-рецептора, по-видимому, является предварительным условием для индукции передачи сигналов β-catenin/TCF (Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000). Недавно, однако, LRP6 оказался также вовлеченным в движения конвергентного вытягивания и в становление тканевой полярности у позвоночных (Bryja et al., 2009; Tahinci et al., 2007). LRP ко-рецептору может помешать вступлению в Wnt-Frizzled комплекс Kremen, пронизывающий один раз трансмембранный рецептор, и Dickkopf (Dkk), растворимый секретируемый белок, который если связан LRP, обеспечивает его интернализацию (Fig. 1A). Чтобы способствовать этой Dkk-обеспечиваемой интернализации LRP, Kremen негативно регулирует передачу сигналов Wnt/β-catenin (Mao et al., 2002). В отсутствие Dkk, однако, Kremen вместо этого способствует локализации на поверхности клетки LRP (Hassler et al., 2007). Как подчеркивается Cselenyi и Lee (Cselenyi и Lee, 2008), стимулирующие активности Kremen, одной стороны, и его ингибирующие активности, с др. стороны, д. позволять генерировать бифазные реакции: в регионах низкой концентрации Dkk Kremen д. усиливать Wnt/β-catenin передачу сигналов, тогда как он может активно ингибировать передачу сигналов Wnt/β-catenin, как только будет превзойдена критическая концентрация Dkk.
    Подобно LRP6, Dkk сегодня связывают как с каноническими, так и неканоническими сигнальными событиями. Делеция материнского Dkk у эмбрионов Xenopus приводит к эктопической активации передачи сигналов β-catenin/TCF, а также нарушает движения конвергентного вытягивания β-catenin-независимым способом как результат усиленной активности Jnk (Caneparo et al., 2007; Cha et al., 2008). Это и др. исследования показали, что каноническая и неканоническая реакции могут быть значительно сильнее интимно связаны, чем это предполагалось ранее.
    LRP6-связывающий белок Wise (Sostdc1) др. прекрасный пример контекст-зависимого модификатора (Fig. 1A). Ранние эксперименты на Xenopus выявили как стимулирующие, так и ингибирующие активности для белка по отношению к передаче сигналов Wnt/β-catenin, а также его роль в регуляции движений конвергентного вытягивания (Itasaki et al., 2003). В завершенном исследовании было показано, что Wise, может ингибировать активности некоторых Wnt белков, но усиливает активность других. Более того, Wise, как было установлено, обладает как внеклеточной, так и внутриклеточной функциями (Guidato и Itasaki, 2007). Мутантный Wise белок, который сохраняется в эндоплазматическом ретикулеме, вызывает снижение экспрессии на клеточной поверхности LRP6. Хотя сегодня неизвестно, продуцируется ли эндогенный Wise в секретируемой, а также во внутриклеточной форме in vivo, важно отметить, что некоторые фенотипы, наблюдаемые вследствие избыточной экспрессии или нокдауна дикого типа Wise лучше всего воспроизводятся с помощью секретируемой формы белка, а др. с помощью эндоплазматической, сохраняемой в ретикулёме формы.
    Недавняя идентификация collagen triple helix repeat-containing protein 1 (Cthrc1) в качестве модификатора передачи сигналов Wnt иллюстрирует важность внеклеточных ко-факторов для генерации функциональной единицы Wnt-рецептор (Yamamoto et al., 2008). В отношении функции, Cthrc1 взаимодействует с основным PCP белком Vangl2у мыши, это указывает на роль его в установлении тканевой полярности. В экспериментах по избыточной экспрессии Cthrc1 физически взаимодействует с рядом Wnts (Wnt3A, Wnt5A и Wnt11) и Frizzleds (Fz3, Fz5 и Fz6) , а также с Ror2. Более того, Cthrc1 специфически усиливает формирование комплекса Wnt-Fz-Ror2 за счёт комплексов Wnt-Fz-LRP6 - активность, которая, как полагают авт., может приводить к одновременному ингибированию передачи сигналов β-catenin/TCF и активации внутриклеточных сигнальных событий, которые вносят вклад в становление тканевой полярности. Хотя Ror2 действует как настоящий Wnt рецептор в силу своего собственного CRD домена (Fig. 1C), исследование Yamamoto et al., указывает на то, что Ror2 может также действовать как часть крупного комплекса, в котором он сотрудничает с рецептором Frizzled (Fig. 1D) (Yamamoto et al., 2008). Это согласуется с ранее опубликованными данными, которые показали физическое взаимдействие между Ror2 и Frizzled (Oishi et al., 2003).
    В свете образования Wnt-Fz-Ror2 комплекса, описанного Yamamoto et al. (Yamamoto et al., 2008) и сообщений о димеризации индивидуальных рецепторов (Carron et al., 2003; Liu et al.,2008), присутствие множественных Wnt рецепторов в одиночном комплексе открывает возможность, что Wnt белки действуют как мультимеры, а не мономеры (Fig. 1E). Недавнее исследование Heasman и co-workers продемонстрировало это: и Wnt5A и Wnt11, как было установлено, формируют гомодимеры, которые затем взаимодействуют, чтобы сформировать функциональные олигомерные Wnt5A-Wnt11 комплексы (Cha et al., 2008).
    Наконец, ещё один дополнительный уровень регуляции связан с секретируемыми Wnt ингибиторами, такими как Wif белок, домен взаимодействия с Wnt которого сходен с таковым у рецепторов Ryk и секретируемыми frizzled-related proteins (Sfrps), которые содержат CRD, который сходен с Wnt-interacting доменами как рецепторов Frizzled, так и Ror (Fig. 1F). Wifs и Sfrps могут непосредственно соединяться с Wnt белками во внеклеточном пространстве, это влияет на расположение рецепторов и в конечном итоге на клеточные реакции (Bovolenta et al., 2008; Kawano и Kypta, 2003).

    Challenges in studying Wnt signaling in development


    В то время как исследования in vitro и биохимические подходы неоценимы для выявления функций индивидуальных компонентов передачи сигналов Wnt, их значение для развития ещё предстоит продемонстрировать in vivo. Здесь ситуация очень быстро усложняется, т.к. клетки могут воспринимать множественные сигналы в одно и то же время и которые могут действовать совместно, чтобы вызывать желаемый эффект. Напр., у C. elegans, два противоположных сигнальных Wnt события сотрудничают в ориентации клеточной полярности (Green et al., 2008). С др. стороны, Wnt/LIN-44 и Wnt/MOM-2, действующие посредством Fz/LIN-17 и Ryk/LIN-18, индуцируют передачу сигналов посредством β-catenin/TCF. Зато, Wnt/EGL-20 действует посредством Ror2/CAM-1, в сотрудничестве с PCP белком Vangl1/VANG-1. Все эти сигналы одновременно управляют ориентированными клеточными делениями, которые необходимы, чтобы поляризовать клетки собственно во время формирования вульвы. Если интерпретировать эти результаты, то мы д. учитывать, что роли разных белков и специфическое поведение клеток, которое они вызывают, скорее всего оказываются диверсифицированными в ходе эволюции. Напр., функция Arrow у Drosophila, по-видимому, ограничена передачей сигналов Wnt/β-catenin. Не идентифицировано очевидных гомологов LRP/Arrow у C. elegans. Всё же у позвоночных, LRP6 участвует как в β-catenin-зависимых, так и -независимых реакциях, как обсуждалось выше. Также установление тканевой полярности у Drosophila, по-видимому, нуждается в Frizzled, но не в Wnt (Chen et al., 2008). Напротив, Wnt белки участвуют в конвергентном удлинении и тканевой полярности у позвоночных (Dabdoub et al., 2003; Heisenberg et al., 2000; Kilian et al., 2003; Qian et al., 2007).
    Принимая во внимание большое количество Wnt и Frizzled гомологов у высших позвоночных, остается обескураживающей задачей определить роль каждого из них в данном онтогенетическом процессе. Даже у Drosophila, исчерпывающие исследования их природы ещё не осуществлены. У C. elegans, однако, Zinovyeva et al. недавно исследовали участие всех 5 Wnt белков и и всех 4-х рецепторов Frizzled в эмбриональной и пост-эмбриональной миграции клеток (Zinovyeva et al., 2008). Они установили, что все они участвуют, также как и Ror2/CAM-1. Более того, сравнение фенотипов, наблюдаемых у пятикратных Wnt мутантов и четырехкратных Frizzled мутантных червей подтвердили существование дополнительных Frizzled-независимых ролей для Wnt, и Wnt-независимых ролей для Frizzled. Авт. полагают, что одновременная экспрессия множественных Wnt гомологов в одной и той же ткани может обеспечивать усиленной позиционной и направляющей информацией и помогать тонкой настройке клеточных реакций.
    У C. elegans, также как и др. видов животных от Drosophila до Xenopus и мыши, белки Wnt и их рецепторы экспрессируются тонко настраиваемым простанственно-временным способом, начиная с раннего развития. Во время имплантации бластоциста мыши, напр., Wnts и Frizzleds уже экспрессируются в виде очень разных и динамических паттернов, которые указывают на столь же динамичную регуляцию нижестоящих сигнальных событий (Hayashi et al., 2009). Недавно были разработаны продвинутые высокопроизводительные подходы и количественные анализы, позволяющие сконструировать более детальную картину динамичных паттернов экспрессии генов Wn, их рецепторов и ко-регуляторов во время развития. В конечностях мыши. напр., Witte и colleagues осуществили детальный анализ локализации транскриптов, которые кодируют белки Wnt и их секретируемые антагонисты, и выявили динамичный паттерн распределения (Witte et al., 2009). Сходная ситуация наблюдалась для экспрессии различных генов рецепторов Frizzled в головном мозге мыши (Fischer et al., 2007). Однако для многих недавно идентифицированных Wnt рецепторов и ко-рецепторов, также как и для большинства анатомических мест, характеристики экспрессии остаются в основном неизвестными. Доступные базы данных, такие как Gene Paint Atlas (http://www.genepaint.org) и Edinburgh Mouse Atlas (http://genex.hgu.mrc.ac.uk/intro.html), становятся всё более информативными в отношении передачи сигналов Wnt по мере накопления этих данных.
    Наконец, более продвинутые техники позволят нам найти ответы на злободневные вопросы широкого диапазона. Каковы сигналы, которые регулируют экспрессию разных лигандов и рецепторов? Каковы механизмы обратной связи, с помощью которых белки Wnt могут влиять на репертуар экспрессии рецепторов? У Drosophila, напр., fz3 является мишенью Wg, и его активация в свою очередь ослабляет передачу сигналов Wg (Sato et al., 1999). У позвоночных, некоторые негативные регуляторы передачи сигналов Wnt, такие как Axin2 и Dkk4, также были идентифицированы как гены мишени для Wnt (Bazzi et al., 2007; Jho et al., 2002). Такие негативные петли обратной связи могут иметь важные онтогенетические следствия. Напр., они могут вызывать стабильные осцилляции, которые наблюдаются во время сомитогенеза, когда перемежаются периоды высокой и низкой сигнальной активности Wnt (Aulehla et al., 2003; Aulehla et al., 2008; Suriben et al., 2006), или в регулярном пространственном распределении волосяных фолликулов на коже (Sick et al., 2006).
    Действительно ли происходят разные сигнальные события внутри одной и той же клетки? Как возникающие сигнальные события в соседних клетках или даже в клетках, которые отстоят далеко, влияют на реакцию ткани как целого? Как. напр., клеточно-неавтономная роль Ror2/CAM-1 у C. elegans (Green et al., 2007), может влиять на реакцию на Wnt путем функционирования в клетках соседних, но отличающихся от клеток мишеней для Wnt. Насколько далеко разные Wnt сигналы распространяются in vivo? Можно ли различить между прямыми реакциями и вторичными эффектами? Последние важные, хотя часто забытые, источники неразберихи. Важно понять, что окончательный онтогенетический результат (read-out) (т.e. фенотип) и прямая, инициальная реакция на стимуляцию с помощью Wnt лиганда (напр.. формирование рецепторного комплекса или стабилизация β-catenin) сильно разделены по времени в онтогенезе и поэтому д. различаться др. от др.
    Новые imaging инструменты д. предоставить нам достаточное разрешение, чтобы увеличить события сигнальной трансдукции Wnt in vivo. С-терминальные хвосты белков Fz и Fz2 дрозофилы, напр., предопределяют их субклеточную локализацию (Wu et al., 2004). С-конец Fz управляет апикальной локализацией в эпителиальных клетках крыловых имагинальных дисков дрозофилы, где он способствует передаче сигналов PCP, но ингибирует передачу сигналов посредством β-catenin/TCF. Напротив С-конец Fz2 способствует более базальной локализации, где он соединяется с Wg и способствует передаче сигналов посредством β-catenin/TCF. Это наблюдение указывает на то, что разные внутриклеточные реакции могут происходит в разных субклеточных компартментах. Сходным образом поляризованное распределение

    Fig. 2. Signal transduction networks. Textbook molecular biology ascribes that a signal transduction cascade begins with the binding of an extracellular ligand to a membrane receptor, after which cytoplasmic second messengers transduce the signal to the nucleus, resulting in the transcription of a given set of target genes. In reality, the situation is not that simple, и complications exist at practically every level. A wide variety of ligands exists. The mammalian genome, for instance, encodes 19 different Wnt ligands. The same holds true at the receptor level. Multiple receptor homologs (ten Frizzled receptor homologs in mammals), different receptor families и additional co-receptors further diversify the signal transduction cascade. To think of intracellular signaling events as linear pathways is another over-simplification. In reality, biology does not follow a straight line. Signals can branch off at virtually every step, modifiers can represent a parallel input that affects the outcome of signal transduction independently of extracellular ligand stimulation, intense cross-talk (depicted by double-headed arrows) exists between different signaling cascades, и feedback mechanisms provide an additional layer of control. So, although we often still think in very linear terms, we are actually dealing with ever-evolving и intertwined signal transduction networks in which multiple inputs are integrated at virtually every level.

    LRP6, обнаруживаемое в клетках, которые подвергаются движениям конвергентного вытягивания (Tahinci et al., 2007), указывают на то, что может быть необходимо наблюдение с близкого расстояния, чтобы выявить незначительные различия, которые могут быть важны для онтогенетических последствий.

    Conclusions


    For many years, most of our efforts in studying Wnt signal transduction have focused on resolving the biochemical nature of downstream signaling events. In the past decade, however, attention has shifted back to the plasma membrane. How all the various pieces of information obtained from these studies fit together in the puzzle of a complete signal transduction network within the context of a living organism remains to be resolved. These studies have revealed the existence of extensive cross-talk between the numerous ligands, receptors, co-receptors и additional regulators, as well as between downstream intracellular messengers. As a result, the outcome of a given Wnt signal is highly unpredictable. As much as we still like to think of signal transduction pathways in terms of linear cascades и stable, well-defined interactions, reality teaches us that things are more flexible, dynamic and, as a result, more complicated (Fig. 2). This is especially true in an intact organism, where cells exist in the context of complex tissues in which numerous cell types communicate with one another. An important feature of a system that depends on the proper integration of multiple inputs is its sensitivity to small changes in the dose or gradient of extracellular factors, as well as to the absolute levels of the different receptors и co-receptors involved. This realization brings with it the requirement for a new way of thinking about signaling events that also integrates more advanced experimental analyses и novel bioinformatic modeling tools (Kestler и Kuhl, 2008).
    As the response to a specific signal is cell type specific и context dependent, we urge caution in concluding which particular molecular components are recruited for this purpose within a cell. Whereas multiple tools exist to monitor the involvement of β-catenin/TCF signaling, many of the other downstream signaling events still lack specific read-outs. We strongly emphasize that we should no longer think of Wnt signal transduction in terms of linear pathways, either intracellularly or extracellularly. As helpful as breaking down the signaling cascade into different pieces has been for resolving the functions of its core components, it is now time to see Wnt signal transduction for what it truly is: a complex network of protein interactions, with multiple outcomes, cross-talk и regulatory inputs at practically every level.