Посещений:
ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОК

Роль внутиклеточных коммуникаций

Spatial organization of intracellular communication: insights from imaging
Leif Dehmelt and Philippe I. H. Bastiaens
Журнал и т.п.

Signal transduction is the transfer of information about the compositional state of the extracellular environment to the intracellular cytoplasm that elicits a morphological or genetic response. In more general terms, this can also be the communication of the state of supramolecular structures, such as the plasma membrane or chromatin, in the cell. This information is relayed through space by the cytoplasm and is mediated by transitions between the steady states of the cytoplasm’s reaction networks. To uncover the principles that underlie the generation of spatiotemporal patterns of activity which guide cellular behaviour, functional imaging techniques that report on the activity of molecules must be combined with imaging techniques that report on the mobility of molecules

Dissipative system A dynamic system that operates far out of equilibrium and exchanges energy and matter with its environment.
Stigmergy
Derived from the Greek ‘stigma’, meaning mark or sign, and ‘ergon’, meaning work or action. This concept was used to describe termite mound construction, in which the work in progress provides marks for further work.
Cytoplasmic state
One of a limited number of dynamically maintained, inter-converting states of an intracellular signalling network that define distinct cellular behaviours.
Fluorescence photobleaching
Irreversible photo-destruction of fluorescent molecules by prolonged and/or intense illumination.
Quantum dots
Inorganic, semi-conductor crystals, which are used as alternatives to organic fluorophore dyes owing to their bright fluorescence and high photostability
Diffraction pattern
A pattern, forming by constructive and destructive interference, that occurs if waves encounter an obstacle or a medium with varying refractive index. The interference pattern sets a limit to resolve two closely spaced structures by optical methods.
Total internal reflection fluorescence microscopy
A microscopy method in which total reflection is used to generate an exponentially decaying evanescent wave at a glass–water interface, with a depth of 50–300 nm, to selectively excite fluorescent molecules near a surface.
Multifocal plane microscopy
An extension to standard microscopy techniques in which multiple images at distinct focal planes are recorded simultaneously to allow the accurate positioning of particles in 3D.
Fluorescence correlation spectroscopy
A microscopic method to measure diffusion coefficients and concentrations of fluorescent molecules by detecting their passage through a small volume generated by the focus of a confocal microscope.
Fluorescence speckle microscopy
A microscopy method to determine protein mobilities by substochiometric fluorescent labelling of intracellular supramolecular structures.
Chromophore
The part of a molecule that absorbs visible light and thereby provides colour to the molecule. If the molecule re-emits excited-state energy as light, it is also a fluorophore.
Acceptor-sensitized emission
Fluorescence emission of an acceptor fluorophore that is excited by FRET.
Fluorescence lifetime imaging microscopy
A microscopy method to image the excited state lifetimes of fluorophores.
Solvatochromic dye
A fluorophore that changes its spectral properties owing to a change in solvent polarity.
Michaelis constant
The substrate concentration atwhich the rate of an enzymatic reaction (that is governed by Michaelis–Menten kinetics) is at half of its maximal value.
Michaelis–Menten kinetics
A widespread model for saturable enzyme kinetics, described in Michaelis, L., Menten, M. L. Biochem. Z. 49, 333–369 (1913).
Hysteresis
A path-dependent lag in a dynamic process, which leads to an asymmetry in forward and backward transitions.
Shmoo
A tip structure (named after a cartoon character) involved in cell fusion of mating yeast that emerges after pheromone stimulation.
Hydrodynamic radius
The radius of a hypothetical solid sphere that has the theoretical diffusional mobility of a measured particle in a given solvent.
Aster
The star-shaped geometric arrangement of filaments.
Живая материя характеризуется как оперирующая далеко от равновесного состояния, это означает, что она поддерживает свою организацию за счёт потребления энергии. Такие системы обозначаются как dissipative системы, которые отличаются от само-собирающихся систем, которые обладают стабильными структурами при энергетическом минимуме, напр.. кристаллы. Клетки являются диссипативными системами, состоящими из агентов (белков) в нанометровой шкале, которые могут самоорганизовываться в динамически поддерживаемые микроскопические паттерны. Локальные взаимодействия между агентами и флюктуации в их плотностях являются критическими компонентами для само-организации1.
Рассмотрим строительство термитника тысячами термитов. Ясно, что не существует проекта или лидера, для координации строительства этой сложной структуры, которая превышает продолжительность жизни индивидуальных агентов, которые её конструируют. Grasse описал в 1959 минимальную модель того, как термиты координируют свою строительную активность посредством средств коммуникаций когда идет работа, процесс он назвал stigmergy2. Этот процесс обнаруживает типичные компоненты само-организации: флюктуации в плотности термитов за счёт их случайных перемещений и локальных взаимодействий с катышами растительной земли, которые являются строительным материалом (FIG. 1). Термиты общаются посредством структур, которые строятся путем отложение феромонов на грязевых катушках, которые затем поднимаются, переносятся и опускаются случайно. Шансы поднятия грязевых катышков или опускания их на др. недавно отложенные катушки увеличиваются с концентрацией феромонов, которые генерируют локальную позитивную петлю обратной связи. Истощение грязевых катышков между областями отложения составляет дальнодействующую негативную систему обратной связи. Эта простая система, диктуемая правилами локального взаимодействия и флюктуациями в плотности термитов и катышков, генерирует структуру, состоящую из столбов с регулярными расстояниями3,4. Такое stigmeric взаимодействие между формированием пространственного паттерна и флюктуирующими агентами также происходит в клетках; напр., в сигнальной передаче, обеспечиваемой с помощью нейротрансмиттера GABA (γ-aminobutyric acid), который. помимо др. функций, регулирует хемотактическую ориентацию ростового конуса нейронов5 (FIG. 1). В этом случае флюктуирующими единицами являются микротрубочки в ростовом конусе, которые отбирают образцы среды путем постоянного роста и сокращения во всех направлениях, свойство наз. динамической нестабильностью 6. The GABAA receptor (GABAAR) постоянно перенаправляется в ростовой конус в результате временных взаимодействий со случайно растущими микротрубочками. Внеклеточный градиент GABA ориентирует рост ростового конуса путем соединения с GABAAR, в результате чего происходит локальное увеличение Ca2+ в цитоплазме. Этот Ca2+ затем локально увеличивает скорость роста и стабильность микротрубочек, вызывая большее транспортирование GABAAR в этом направлении и в конце концов увеличивая уровни локально высвобождаемого Ca2+ . Флюктуации в плотности микротрубочек т. о. локально умножаются в этой stigmergic системе обратной связи. Однако в этом случае внешние неравномерно распределенные матрицы(GABA градиент) оказывается воспринимаемым и амплифицируемым в ростовом конусе. Такие матрицы, которые приводят к процессам самоорганизации также присутствуют внутри клеток. Напр., хроматин передает сигналы о своём положении посредством градиента активности малых GTPase RAN микротрубочкам веретена и управляет самоорганизацией микротрубочек в веретено в этой области (see below). Интересно, что королева горы у термитов также передаёт сигналы о своём положении термитам

Figure 1 | Comparison of macroscopic and microscopic self-organization. a | Random walks of termites, diffusion of molecules or stochastic, alternating microtubule growth and shrinkage allow dynamic sampling of possible spatial configurations. b | Local interactions between agents, such as the termites or microtubule ends, and building blocks, such as soil pellets or transported GABAAR (γ-aminobutyric acid receptor), enable a dynamic building process based on exploratory fluctuations. c | If the building process itself can send positive feedback signals to the fluctuating entities (black arrows), a stigmergic growth process can be initiated. d | In termite building behaviour, the complex interplay of many dynamic processes involving stigmergy and other self-organizing processes aided by structural templates are thought to be responsible for the emergence of higher-order structures in the termite mound, without a blueprint. In cells, similar stigmergic building principles might be responsible for the emergence of cellular morphologies such as neurites. The figure shows neuroblastoma cells in which neurite protrusions were induced by the expression of the neuronal microtubule stabilizer microtubule-associated protein 2C (MAP2C; microtubules are shown in green and the actin cytoskeleton in red).

с помощью градиента феромона, вокруг которой описанные выше stigmergic термиты создают динамическую структуру, которая адаптирована к её размеру3. Следовательно, марицы, на которых структуры само-организуются, по-видимому, общий феномен для разных шкал.
Чтобы понять как информация перерабатывается клетками, чтобы вызывать изменения в их морфологии, необходимо знать, как подвижность и локальные взаимодействия молекул наномолекулярных размеров приводят к созданию внутриклеточных паттернов на микрометровой шкале. Как затем отображаются молекулярные процессы в сигнальной трансдукции, чтоб помочь нам лучше понять переработку информации клетками? На фундаментальном уровне флюктуации в позиции молекул внутри клетки могут осуществляться за счет диффузии, (BOX 1), которая аналогична случайным перемещениям термитов, описанных выше10. Альтернативные пути перемещения молекул включают процессы динамического роста и механизмы транспорта, управляемые молекулярными моторами. Наблюдения за флюоресцентными биосенсорами позволяют измерять паттерны молекулярной активности в клетках. Однако из-за динамического взаимодействия между реактивностью и подвижностью молекул, наблюдения таких паттернов самих по себе не выявляет фундаментальных механизмов их образования. Чтобы получить доступ к этим фундаментальным молекулярным процессам сигнальной трансдукции, которые передают информацию (белковые активности) через пространство (за счет подвижности белков), измерения активностей необходимо комбинировать с оптическими методами, которые позволяют измерять подвижность белков внутри клеток.

Microscopic imaging of protein mobility


Внутриклеточная подвижность белков может быть сильно гетерогенной в пространстве и времени. Следовательно, микроскопические методы необходимы для картирования этого свойства в клетках. Два концептуально различных способа оценки подвижности белков - это измерение транспорта больших масс и измерение подвижности на уровне одиночных частиц.
Measurements of protein ensemble mobility. Подвижность больших масс белков может быть определена с помощью photoconversion флюоресцентно меченных молекул в определенных регионах и последующего измерения восстановления или дисперсии флюоресценции. В последнее время это было достигнуто с помощью fluorescence photobleaching, с использованием высокой силы света, чтобы обратимо разрушать яркие флюорофоры и затем измерять динамику восстановления флюоресценции11,12. FIGURE 2a иллюстрирует использование недавно разработанного photoactivatable13 и



Box 1 | Intracellular communication by diffusion or directional transport
Changes in the extracellular environment are usually transmitted in the cell through changes in the conformation or association of intracellular proteins. In the simplest case, the information contained in the state of these proteins is transmitted through space by their diffusional mobility. According to Fick's first law of diffusion, the mass transfer J of such a protein through an area is proportional to the gradient of its concentration (that is, the change of concentration δc per change in position δx): J = -D δc/δx.
The proportionality factor is called the diffusion coefficient D. If this component is an active form of a signal molecule, J also represents the transfer of signalling information in space. Fick's second law of diffusion, δc/δt = Dδ2/δx2 , describes the change of concentration gradients over time δc/δt, which is proportional to the second derivative (that is, the curvature) of the protein concentration δ2c/δx2. For the initial conditions of a point source of material and the border conditions of finite amount of material n0 in a three-dimensional (3D) volume, a solution of Fick's second law can be found, which describes the concentration at the distance x from the point source over time: c(x,t) = n0/8(πDt)3/2 exp(-x2/4Dt). From this equation, the mean square displacement can be derived by volume integration: 2> = 6Dt (for 3D diffusion). Einstein also derived this relationship from a model of random walk10. Similar relationships can be derived for the 1D (x2 = 2Dt) and 2D (x2 = 4Dt) cases.
The average radius (r) that is sampled by randomly diffusing molecules at a given time is: = 4v(Dt/π) (for 3D diffusion). This equation implies that the average travel distance for information flow on the basis of diffusion is proportional to the square root of time and, as a result, diffusion-based information transfer becomes increasingly slower when a molecule has to travel over larger length scales71,114 . Diffusion coefficients of typical proteins that range in size from 20 to 100 kDa are 10-75 µm2 sec-1 (REF. 115). Therefore, signal propagation on the length scale of tens of micrometres, which is relevant for signal propagation from the plasma membrane to the nucleus, will take seconds to minutes. In contrast to diffusion, the speed of information transfer through directional transport116,117 or reaction wave propagation scales linearly with time and is therefore more suitable to transmit signals over longer distances (represented as flat slopes in the double logarithmic graph shown).

Efficient mass transport of proteins over longer distances (for example, fast axonal transport) is typically achieved by directional transport along cytoskeletal tracks116. Wave propagation uses efficient coupling of many rapid small-scale diffusion processes with reactions114. In this case, the cytoplasm is viewed as an excitable medium. This is analogous to a fire spreading in the dry grass of a savannah. Classical examples in cell biology include electrical signal propagation in axons118 and Ca2+ waves in oocytes119. Similar rapid propagation mechanisms were also proposed for kinase-phosphatase reaction cycles at growth factor receptors in the plasma membrane. Thus, to understand how information travels through space, two molecular properties in cells need to be analyzed: diffusion and reaction. In the graph, ? indicates proportionality. GFP, green fluorescent protein.


photoconvertable14,15 флюоресцентных белков, которые делают возможным быстрое переключение свойств флюоресцентных белков меньшими количествами фотонов за счет избирательного освещения специфической длиной волны. В этом примере быстрая дисперсия prenylated, palmitoylation-дефицитной Ras мутации во всех клеточных мембранах демонстрирует, что monolipidated сигнальные белки могут быстро двигаться между компартментами мембран и тем самым распространять сигналы16.
Однако поскольку photoconversion необратима в этих методах, то повторные измерения, чтобы выявить отклонения в подвижности белков ограничены количеством фотоконвертируемого материала в клетке. Это ограничение устраняется с введением фотохромных белков и краски, которые могут включаться и выключаться светом17,18 . Напр., повторяющиеся циклы переключений фотохромных белков делают возможными множественные измерения быстрых перемещений (shuttling) между ядром и цитоплазмой mitogen-activated protein kinase (MAPK) во время стимуляции фактором роста в индивидуальных клетках18. Чтобы количественно оценить подвижность белков, экспериментально полученные кинетики дисперсии обычно сравнивают с математическими моделями. Применяя правила Fick's (BOX 1) и кинетику базовых потоков, эти модели могут давать относительные вклады и скорости диффузии и направленный транспорт подвижных белков11,19,20.
Single molecule mobility measurements. Измерения масс подвижных белков позволяют оценить группу в среднем. Эта средняя подвижность может базироваться на самостоятельных субпопуляциях молекул, которые трудно отличить. Напр., неожиданно низкая диффузия растворимых белков может быть вызвана повторными временными взаимодействиями с неподвижными supramolecular структурами, такими как хроматин в ядре или актиновые сети в плазматических мембранах. Чтобы лучше различать такие различающиеся субпопуляции, необходимо отслеживать траектории индивидуальных белков с помощью отслеживания одиночных частиц, используя метки, такие как частицы золота21, химические флюорофоры22,23 или quantum dots24. Такие траектории непосредственно выявляют различные вклады в подвижность белка. Чистая диффузия может генерировать траектории, которые соответствуют случайным перемещениям, это проявляется в виде линейных взаимоотношений между средне квадратическим отклонением и временем (FIG. 2b). Дополнительные неслучайные поведения, такие как склонность к направленному действию, перемежающаяся иммобилизация и отлавливание субклеточными доменами, могут наблюдаться непосредственно25,26 и проявляться в виде отклонения от этой линейности27. Важно, что при сравнении паттернов дифракции для индивидуальных частиц, аккуратность отслеживания в пространстве не ограничена разрешением микроскопа. Путем комбинирования наблюдения с высоким разрешением с photoactivatable флюорофромами, можно наблюдать траектории многих индивидуальных частиц с помощью повторяющейся photoconversion, это делает возможным пространственно-временное картирование с высокой плотностью и с разрешением на нанометровой шкале подвижности белков в индивидуальных клетках25.
Total internal reflection fluorescence (TIRF) микроскопия, которая использует селективно освящаемые интерфейсы между стеклянной подложкой и сплющенной плазматической мембраной из адгезивных клеток с помощью рассеянного поля в глубину на 50-300 nm, особенно пригодна для аккуратного отслеживания медленных боковых перемещений плазмы или



Figure 2 | Measurement of protein mobility in cells. a | Photoactivatable green fluorescent protein (paGFP) was fused to a monolipidated Cys181Ser and Cys184Ser mutant of the small GTPase HRAS (paGFP HRAS Cys2Ser). A short pulse of blue light converts the dark fluorophore into a green fluorescent form in a small region. Within seconds, the fluorescent species diffuses away from the photoactivation site (upper panels). The lower panels show the intensity profiles along the indicated lines at the successive time points. Intensity profiles are measured in arbitrary units (AUs). b | The mobility of proteins measured directly by single particle tracking. The trajectory of an individual particle is consistent with a random walk, which is revealed by a linear relationship in the plot of the mean square displacement (MSD) versus time. c | Single molecule mobility measured by fluorescence correlation spectroscopy. The passage of a fluorescent protein through an illuminated volume gives rise to a transient burst of fluorescence with a duration (Δt) that corresponds to its passage time (left). For many molecules, multiple bursts are visible as fluorescence intensity fluctuations around an average value (middle). The mathematical operation of autocorrelating the fluorescence fluctuations reveals the average number of molecules (N) in the illuminated volume and their average passage time (Δt right). G(τ) is the correlation amplitude and τ is the correlation time. Image in part b is modified, with permission, from REF. 26 © (2005) Elsevier.

ассоциированных с мембраной белков. Это происходит из-за того, что эти белки ограничены симультантным (single plane) очагом и при достаточных количествах фотонов могут быть собраны, поскольку эти белки диффундируют слабо. Напротив, тщательное отслеживание растворимых, цитозольных белков более затруднительно из-за их быстрых перемещений в трех измерениях (3D). Новые технические разработки, такие как rapid 3D imaging с помощью мультифокальной плоскостной микроскопии в комбинации с широкими quantum dots28, могут обеспечить необходимую скорость и интенсивность сигнала, чтобы определить аккуратно 3D траектории. Вновь разработанные блестящие, базирующиеся на алмазных наночастицах, которые не отбеливаются (bleach) и обладают устойчивой флюоресценцией, как ожидается ещё больше расширят границы способности к отслеживанию29,30. В качестве альтернативы отслеживанию индивидуальных диффундирующих цитозольных белков, является их прохождение через определенный освещаемый объём, которые фиксирован в пространстве и которое может быть измерено с помощью fluorescence correlation spectroscopy (FCS) или сходных методов 31-34 (FIG. 2c). При FCS, флюктуации интенсивности флюоресценции определяются как индивидуальные флюоресцентно меченные белки вступающие и выходящие из фокуса конфокального микроскопа, который имеет объём ~0.3 femtolitre (~0.3х10-15 литра). Коэффициент диффузии может быть получен из продолжительности этих флюктуаций с уже известным независимо измеренным объёмом освещенности. Кроме того, абсолютная концентрация меченного белка может быть определена из амплитуды флюктуаций флюоресценции. Это является важным ценным вкладом в quantitative биологов, которые интересуются концентрациями белков и их комплексов в клетке (see below).
Супрамолекулярные структуры, такие как филаменты цитоскелета в клеточной коре или в митотическом веретене часто поддерживаются с помощью молекулярного притока своих компонентов, который является медленным по сравнению со свободной диффузией. Чтобы проанализировать эти направленные подвижности, была разработана альтернативная микроскопия для наблюдения за отдельными частицами, наз. fluorescence speckle microscopy (FSM)35-37. При FSM, небольшие количества флюоресцентно меченных флюорофор стохастически инкорпорировались в индивидуальные филаменты, такие как микротрубочки или актин. Эти флюорофоры могут служить в качестве точек отсчета для аккуратного отслеживания за оборотом и скольжением филамент в клетках. Быстро диффундирующие флюоресцентно меченные строительные блоки, которые не являются полимерами (такие как мономерные глобулярные актины ил димеры тубулина) не наблюдаются из-за пространственно-временного усреднения их флюоресцентного сигнала.

Microscopic imaging of protein reactions


Состояние сети внутриклеточных сигнальных белков может быть изменено путем связи лигандов с рецепторами клеточной поверхности в плазматической мембране. Присутствие лиганда во внеклеточной среде передаётся клеткам посредством конформационного изменения его рецептора, процесса который происходит на нанометрической шкале. Передача информационных сигналов, кодируемая этим конформационным изменением, д. каким-то образом передаваться на клеточный уровень, который измеряется порядками микрометров. Необходимость связи этих шкал осуществляется с помощью каскадов клеточных реакций, которые передаются через пространства посредством диффузии. Т.о., помимо описанных выше методов для измерения подвижности белков мы нуждаемся в подходах, которые позволят нам видеть изменения в популяционных средних состояний белковых реакций.
Detecting interactions by spatiotemporal coincidence. Существуют различные фотофизческие методы, которые могут быть использованы в микроскопии, чтобы оценить различные состояния молекул, на простейшем уровне взаимодействия между двумя различимыми, флюоресцентно меченными белками по их ко-локализации в оптически разрешимом объемном элементе, которое измеряется по их пространственному совпадению (FIG. 3a). Взаимодействие между флюоресцентно меченными белками в клетках такж может быть выведено из совпадения их прохождения через освящаемый объем, используя fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS). В этом случае совпадение флюктуаций двух-окрашенных fluor escence определяется как белковые комплексы, вступающие или уходящие из фокуса конфокального микроскопа. Элемент оптического объема, разрешаемый с помощью конфокальной микроскопии находится в объеме порядка 0.3 femtolitre, это примерно на 5 порядков величин больше, чем объем в zeptolitre типичных белков (10-21 litres). Т.о., и ко-локализация и FCCS одинаково ограничены заключениями о прямом взаимодействии белков, поскольку размеры освещаемых объёмов значительно больше, чем размеры самих белков. Однако пространственное или временное совпадение указывает на то, что два белка связаны др. с др. с помощью , по крайней мере соединения с одной и той же супрамолекулярной структурой.
Measuring protein interactions by FRET. Для увеличения вероятности, что совпадения соответствуют непосредственному взаимодействию между двумя белками, размер пространственного объёма, в котором измеряется совпадение д. быть уменьшен до размера белков. Это может достигаться с помощью Forster resonant energy transfer (FRET)39. Этот принцип имеет преимущества благодаря тому факту, что неизлучающая энергия электронного возбуждения может быть перенесена с донорского флюорофора на ацепторный хромофор, который находится в нанометрической близости (FIG. 3a). Важно, что эффективность FRET является функцией инверсии шестой силы расстояния от хромофора r (E = 1/(1+(r/R0)6 В этом случае, R0 является радиусом Forster на котором перенос энергии составляет 50%; , следовательно, эффективность FRET быстро уменьшается с увеличением расстояния между хромофорами. Как результат, FRET обнаружим только для типичных хромофоров, если их дистанция ~10 nm. Т.о., пространственный объём, в котором осуществляется FRET, между донором и акцептором находится в пределах zeptolitres, это в самом деле пределы типичных размеров белков. Детекция FRET может предоставлять качественный показатель белкового взаимодействия в клетке. Несколько экспериментальных стратегий, включая измерение acceptor-sensitized эмиссии40,41, acceptor photo bleaching42 и fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM)43,44, также позволяют количественно оценить эффективность FReT и тем самым сумму взаимодействующих молекул. В частности, FLIM может предоставить количественную информацию о фракции взаимодействующих молекул в каждом пространственно разрешаемом объемном элементе, путем включения a priori знания о количестве взаимодействующих видов белков45. Напр., эта технология была использована для количественной оценки состояния фосфорилирования рецепторов epidermal growth factor (EGF) во время распространения латеральной сигнальной волны46. Такие количественные измерения состояний белков являются критическими для разработки и верификации моделей, которые связывают реакции белков с диффузией белков (reaction-diffusion модели).
Imaging protein conformational changes. Ферментативная активность белков часто регулируется с помощью конформационных изменений, которые индуцируются с помощью аллостерических регуляторов, пост-трансляционных модификаций или белковых взаимодействий. Конформационные изменения белков могут быть измерены с помощью FRET путем помещения донорских и акцепторных флюорофоров на стратегически избранные регионы белков47-52 (FIG. 3b,c). Расстояние между донором и акцептором д. быть оптимальным вблизи Forster радиуса R0, (т.е. расстояния при котором перенос энергии равен 50%), при котором изменения эффективности FRET в отношении дистанции максимальны. Такая стратегия была, напр., использована для измерения активности регулятора микротрубочек



Figure 3 | Measurement of protein reactions in cells. a | Colocalization is a measure of the spatial coincidence of two fluorescent proteins in an illuminated volume that is defined by the resolution limit of the microscope, which is several orders of magnitude larger than the size of molecules. Coincidence defined by the physical basis of Forster resonant energy transfer (FRET) sets much stronger constraints on the detection of proximity of two fluorescent proteins and is usually sufficient to discriminate direct from indirect interactions. b | A biosensor to detect the activity state of the microtubule regulator stathmin (also known as OP18) is shown, which adopts an extended conformation on interaction with tubulin (tub) following dephosphorylation. c | A steep distance dependence of FRET efficiency allows the sensitive detection of conformational changes (left) in which R is the distance between donor and acceptor chromophores and R0 is the distance at which the FRET efficiency is 50% (typically at 3-6 nm). An example of the spatial gradient of stathmin phosphorylation (right). The colour bar indicates a measure of FRET efficiency between cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP), and thereby the conformational state of stathmin. d | The conversion of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) into phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3) by phosphoinositide 3-kinase (PI3K) is measured by the translocation of a pleckstrin homology (PH) domain to the plasma membrane. In this example, the image shows membrane localization of the protein kinase B (PKB) PH domain following conversion of PtdIns(4,5)P2 into PtdIns(3,4,5)P3 by PI3K in Dictyostelium discoideum e | Enzymatic activities can be measured by FRET detection of enzyme-substrate complexes that are maintained at steady state by a reaction cycle in cells. In the scheme summarizing the reaction cycle, the donor fluorophore is green fluorescent protein (GFP) and the acceptor fluorophore is rhodamine (Rh). The image of the fraction of enzyme-substrate complex shows a gradient of protein Tyr phosphatase 1B (PTP1B; also known as PTPN1) activity in MCF7 cells. Image in part c is reproduced, with permission, from REF. 52 © (2004) The American Association for the Advancement of Science. Image in part d is reproduced, with permission, from The EMBO Journal REF. 60 © (1999) Macmillan Publishers Ltd. All rights reserved. Image in part e is reproduced, with permission, from REF. 67 © (2007) The American Association for the Advancement of Science.

stathmin (также известного как OP18), который принимает открытую конформацию со снижением эффективности FRET после того как он дефосфорилируется и делает возможным взаимодействие с tubulin52 (FIG. 3b). Альтернативные стратегии для измерения конформационных изменений белков включают прикрепление solvatochromic краски, которые могут быть использованы для детекции вызванных конформацией изменений в локальной гидрофобности53-55 или слияния с чувствительными к конформации циклическими permuted флюоресцентными белками. Обе стратегии были использованы для получения зондов для некоторых биологических активностей56-58, включая сенсоры для уровней внутриклеточного кальция, базируясь на Ca2+ -связывающем белке calmodulin53,56.
Imaging enzymatic activities. В некоторых белках конформационные изменения непосредственно связаны с биологической активностью, такими как изменения проницаемости мембран после открытия каналов или демаскирования доменов белковых взаимодействий. Однако в случае энзимов, конформационные изменения могут не всегда быть адекватными измеряемой активности, поскольку связывание кофакторов и изменения в химическом окружении, таких как локальный pH, redox потенциал или концентрация кофакторов и субстратов, могут добавлять дополнительные уровни регуляции. В принципе ферментативные реакции могут быть отслежены путем наблюдения превращения субстрата в продукт. Напр., уровни сигнального липида phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), продукта конверсии с помощью phosphoinositide 3-kinase (PI3K) - PtdIns-4,5bisphosphate (PtdIns(4,5)P2), могут быть измерены с помощью транслокации флюоресцентно нагруженных PtdIns(3,4,5)P3-соединяющихся pleckstrin homology (PH) доменом с плазматической мембраной59-61 (FIG. 3d). Однако это дает лишь косвенное измерение активности PI3K. Сходным образом, основывающиеся на FRET измерения конформационных изменений в искусственных киназных субстратах или при расщеплении искусственных протеазных субстратов62,63 может предоставлять косвенную информацию об активности, используемой в реакции. В обоих случаях локализация активности также неясна из-за диффузии продукта.
Чтобы непосредственно измерять появление ферментативных реакций в клетках, комплекс энзим-субстрат может быть обнаружен с помощью измерения пространственного совпадения энзима и субстрата в используемом zeptolitre объёме FRET (FIG. 3e). Однако комплексы энзим-субстрат живут недолго, поскольку ферментативные реакции быстры. Поэтому ожидается, что только небольшие количества этого комплекса будут представлены в клетке в любой момент времени. Тем не менее, поскольку клеточные реакции часто обратимы, то высокие концентрации субстрата могут поддерживаться, если скорости прямой и обратной реакций сходны. Кроме того, если энзим оперирует около своего насыщения (т.е., если концентрация субстрата сравнима с константой Michaelis (Km) энзима ), то количество комплексов энзим-субстрат может быть существенным. Эти свойства используются для изучения ферментативной активности белка Tyr phosphatase 1B (PTP1B; также известной как PTPN1) в клетках путем измерения фракции комплексов энзим-субстрат с помощью FLIM измерений эффективности FRET. Эта фракция является локальным измерением константы Михаэлиса Km и , следовательно, локальным показателем ферментативной активности. Этот подход выявил пространственную регуляцию активности PTP1B, открывая механизм контроля продолжительности передач сигналов рецептора ростового фактора67.

Imaging dynamic processes in the cell


Ранне упомянутое развитие микроскопии позволило нам визуализовать, как группы белков перемещаются и реагируют в клетках. Объединение информации, полученной в таких исследованиях существенно продвинуло наше понимание того, как динамические процессы распространяют сигналы в клетках, как обсуждалось выше.
Cytoplasmic states. Сигнальная трансдукция часто воспринимается как последовательность реакционных событий. Внутри клетки аппарат сигнальной трансдукции включается при связывании фактора роста со своим рецептором, это затем передаёт информацию посредством линейной цепочки реакций белков (напр., пост-трансляционные модификации, такие как фосфорилирование) в ядро, чтобы включить экспрессию генов, которые соответствуют этому ростовому фактору. Чтобы выключить этот сигнал клетка д. включить фосфатазу, чтобы дефосфорилировать субстрат. Однако эта упрощенная схематическая последовательность запуска активности фактора роста из неактивного клеточного состояния не согласуется с концепцией, что живые клетки являются динамичными и dissipative системами. В этом обзоре состояния реакций белковых сетей поддерживаются с помощью динамических процессов, п передача информации осуществляется с помощью переключения от одного динамически поддерживаемого устойчивого состояния к др. В самом деле, если голодающие по сыворотке клетки подвергнуть действию ингибиторов фосфатаз, то субстраты быстро фосфорилируются, это указывает на то, что фосфатазы были активны в отсутствие сыворотки46. Т.о., как kinase-, так и phosphatase-катализируемые реакции происходят одновременно в любой момент времени, даже в условиях недостатка сыворотки, и составляют базовый реакционный цикл, который генерирует устойчивое состояние концентрации его продуктов.
Эта наиболее простая топология циклической реакции уже обладает интересными свойствами68 (FIG. 4a). Напр., соединение ростового фактора с рецепторной Tyr kinase (RTK) сдвигает баланс активностей, увеличивая активность внутренне присущих киназ, тогда как активность цитоплазматической фосфатазы остаётся постоянной. Если активности и киназы и фосфатазы следуют кинетике Michaelis-Menten, то дозовая реакция высоко чувствительна69: увеличение концентрации лиганда ведёт к быстрому переходу в субстрате к состоянию фосфорилирования (FIG. 4a). Хотя такой реакционный цикл создает ступенчатый континуум фосфорилированных состояний, которые обратимо следуют оккупации лигандом рецептора, это сдвигает навстречу два дискретных состояния, при этом фосфорилирование включено или выключено. (FIG. 4a,b, steps 1 and 2).
Происходит действительное переключение или прерывистость в дозовой реакции, напр., когда позитивная петля обратной связи добавляется к уже рассмотренному простому реакционному циклу (FIG. 4a). Такого типа реакционная топология является широко распространенной в биохимических сетевых мотивах, которые обладают бистабильностью. Бистабильные сети обладают двумя стабильными устойчивыми состояниями и обладают hysteresis, по-существу, необратимостью (FIG. 4a). Эта асимметрия в дозовой реакции обязывает биологический процесс персистировать, если он однажды был инициирован; напр., логика такой сети является фундаментальным свойством клеточного цикла, это гарантирует его однонаправленность во времени. Такая топология бистабильной сети, как недавно было показано, также частично играет роль в принятии ростовым фактором индуцируемых клеточных решений судьбы PC12 клеток с помощью MAPK сигнальной сети. В этом случае бистабильность предопределяет устойчивое состояние активности, которое является критическим для клеточной дифференцировки. Такие бистабильные сетевые мотивы возникают в различных биологических контекстах и, по-видимому, играют центральную роль в контроле клеточного фенотипа70,74-76.
В гипотетической ситуации, что фосфорилированный субстрат в бистабильной системе активируется цитоскелетным регулятором, таким как стабилизатор микротрубочек, то два состояния представляют собой два динамических состояния цитоскелета микротрубочек и , следовательно, две клеточные морфологии. В действительности множественные цитоскелетные регуляторы могут взаимодействовать др. с др. и менять свои взаимодействующие пары (т.е., изменять топологию своего взаимодействия в комплексе) и тем самым переключать многие аспекты динамики микротрубочек. Напр., было показано на экстрактах яиц Xenopus laevis, что белковый комплекс, сосредоточенный на регуляторах микротрубочек, ассоциированный с микротрубочками белок 215 kDa (MAP215; stabilizer) и член семейства кинезинов 2C (KIF2C; также известен как KCM1; catastrophe inducer) переключает топологию своего взаимодействия в ответ на фосфорилирование с помощью CDK1 и тем самым радикально меняет динамику микротрубочек с

Figure 4 | Kinase-phosphatase reaction cycles. a | Diagrams of kinase activation (input) and the corresponding substrate phosphorylation response. Michaelian-Menten kinetics of the kinase and phosphatase reaction in the cycle lead to high sensitivity in response to kinase activation (ultrasensitivity). Additional positive feedback from the phosphorylated substrate to the kinase leads to a discontinuity in the dose response and irreversibility. b | In quiescent conditions, intracellular phosphatase activity maintains a low net phosphorylation state of receptor Tyr kinases (RTKs) that have a basal kinase activity (1). Extracellular ligand binding increases the kinase activity of the RTKs, shifting the balance towards more phosphorylated receptors (2). Endocytosed receptors maintain their signalling activity (3) until endosomes reach a perinuclear area, where increased phosphatase activity shifts the balance back to dephosphorylated receptors (4). Straight lines are causalities, curved lines represent chemical conversions and thick arrows indicate increased enzyme activity. Transparent RTKs denote low abundance.

более стабильного интерфазного состояния на высоко динамичное митотическое состояние. Состояние активности сигнальной сети, в которую эти регуляторы внедрены, может быть интерпретировано как состояние цитоплазмы. Биохимическое описание цитоплазматического состояния и понимание его влияния на клеточное поведение в контексте регуляции микротрубочек был внесено в исследовании яйцевых экстрактов X. laevis. В этом исследовании переход между цитоплазматическими состояниями регуляторов микротрубочек измерялось путем наблюдения динамики взаимодействий множественных белков в экстрактах посредством рекрутирования флюоресцентных жертвенных (prey) белков на наживку в виде белком покрытых кусочков77.
Local cytoplasmic states. В соей базовой форме сетевая топология, рассмотренная выше, должна по теории генерировать гомогенные состояния молекул и тем самым глобальные цитоплазматические состояния. Однако разные части клетки могут управляться разными цитоплазматическими состояниями. Одним из примеров является активность RTK и фосфатазы в клетке. RTK фосфорилирование временно усиливается за счет лигандом обусловленного увеличения киназной активности на плазматической мембране (FIG. 4b, step 2), а прекращение передачи сигналов возникает в результате эндоцитоза рецепторов в околоядерную часть клетки, где фосфатазная активность теперь превышает киназную активность RTK (FIG. 4b, step 4). Хотя фосфатазы случайно распределены по всему цитозолю, её внутренне прирожденная активность, как было показано с помощью enzyme-substrate отображения (микроскопическое наблюдение фракции комплекса энзим-субстрат в клетках), строго снижена вблизи плазматической мембраны67. Как достигается подобная сегрегация активностей в субклеточных регионах с высоко подвижными фосфатазами, которые могут достигать всех частей клетки? Одна из возможностей заключается в том, что пространственная сегрегация активности фосфатаз динамически поддерживается с помощью механизма, генерирующего градиент.
В простом случае, когда kinase-phosphatase-катализируемый цикл реакций регулирует активность субстрата, он достаточен, чтобы иметь одну из двух ферментативных активностей, разделенных на супрамолекулярной структуре (такой как плазматическая мембрана) , а др. гомогенно распределены, чтобы генерировать стабильный градиент фосфорилированного субстрата, который исходит от супрамолекулярной структуры. Форма и степень градиента может быть получена путем комбинирования второго правила диффузии Fick's (BOX 1) с реакционной кинетикой71,78. Такие градиенты активности могут тем самым генерировать локальные цитоплазматические состояния вблизи супрамолекулярных структур8.
Функциональные imaging исследования, в которых состояния активности белков могут быть измерены в клетках, оказались важными, чтобы показать, что такие морфогенетические градиенты передают сигналы на расстояние79 вокруг хроматина7,9,52,80. Как упоминалось выше, RAN GTPase является существенной для передачи сигналов во время сборки веретена в митозе и это достигается посредством концентрационного градиента RAN в комплексе с with importin-β вокруг хроматина7-9. Генетически закодированные конформационные биосенсоры способны обнаруживать высокие концентрации свободных активных RAN вблизи хроматина7, а диссоциация нижестоящего RAN эффекторного комплекса,

Figure 5 | gradients generate local cytoplasmic states, which steer morphological processes. a | Stathmin (also known as OP18) and RAN activity gradients around chromatin are generated by reaction cycles involving chromatin-bound activators (the kinases Polo-like kinase 1 (PLK1) and aurora B, and the RAN exchange factor regulator of chromosome condensation 1 (RCC1)) and cytosolic inactivators (phosphatase 2A and RAN GTPase-activating protein 1 (RANGAP1)) to generate local cytoplasmic states that promote self-organized spindle building by local control of microtubule dynamics. b | Mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity gradients in the pheromone response of budding yeast. The Ste5 scaffold protein localizes pheromone-induced phosphorylation of the yeast MAPK Fus3 to the shmoo tip (the phosphorylated Fus3 level is indicated in orange in the cytoplasm and nucleus). The homogenously distributed phosphatases Msg5 and Ptp3 dephosphorylate Fus3 globally. Dissociation and diffusion of phosphorylated Fus3 induces the formation of activity gradients, which propagate signals from the shmoo tip and define local cytoplasmic states дифференцировк, β and γ are the subunits of trimeric GTP-binding proteins, and Ste20, Ste11 and Ste7 are kinases in a phosphorylation cascade.

состоящего из importin-β и and importin-β-связывающих доменов7,80. Взаимодействие RAN-GTP с importin-β запускает высвобождение nuclear localization signal (NLS)-содержащих регуляторов микротрубочек, которое косвенным образом было измерено в этих исследованиях (FIG. 5a). Прямые количественные измерения градиента взаимодействия между флюоресцентно нагруженным RAN и importin-β с помощью FLIM измерений FRET, комбинировали с доступными кинетическими данными, это позволило создать компьютерную модель функционально важного градиента свободных NLS-содержащих регуляторов микротрубочек, который оказался сходным по размеру с митотическим веретеном9. Этот градиент активности, как было установлено, влияет на нуклеацию микротрубочек и стабилизацию на разных расстояниях от хроматина, подтверждая тем самым идею, что градиенты активности локальных цитоплазматических состояний, которые управляют динамикой микротрубочек вокруг хроматина во время морфогенеза веретена81,82. Градиент фосфорилирования регулятора микротрубочек stathmin вокруг хроматина,был показан, используя fluor escent protein-based конформационный сенсор (discussed above)52 (FIG. 3b).
Как для RAN , так и stathmin систем первой ступенью активации локальных цитоплазматических состояний является транслокация активаторов (guanine nucleotide exchange фактор regulator of chromosome condensation 1 (RCC1) для RAN и aurora B kinase и Polo-like kinase 1 (PLK1) для stathmin) на супрамолекулярные хроматиновые структуры. Инактиваторы - RAN GTPase-activating protein 1 (RANGAP1) для RAN и okadaic acid sensitive phosphatase (такая как phosphatase 2A) для stathmin83 - гомогенно распределены в цитоплазме. Поскольку RAN активатор RCC1 содержит NLS, то система формирования градиента RAN д. содержать позитивную петлю обратной связи (в которой RAN-GTP высвобождает RCC1 из importins), которая может обеспечить острый необратимый переход в формировании градиента. Отличающийся градиент киназной активности aurora B вокруг средней зоны веретена, как полагают, локализует будущее место разделения во время анафазы. С помощью проверки динамики анафаз с использованием FRET сенсоров активности для aurora B, авт. описали интересную пространственно регулируемую позитивную петлю обратной связи, которая напоминает stigmergy: микротрубочки срединной зоны веретена активируют aurora B благодаря взаимодействию и сами себя стабилизируют с помощью aurora B, которая поддерживается в центре веретена с помощью plus end motor mitotic kinesin-like protein 1 (MKLP1; также известного как KIF23)84 .
Большинство градиентов, описанных выше, ограничивается передачей сигналов вокруг внутриклеточной супрамолекулярной структуры, такой как хроматин. Недавно, удалось инициировать градиент активности MAPK с помощью внеклеточных pheromone сигналов у почкующихся дрожжей, используя FLIM. Этот градиент активности, как было установлено, ограничивает локальное цитоплазматическое состояние, чтобы поддерживать shmoo путем стабилизации actin85 (FIG. 5b). Сходный градиент активности MAPKs был постулирован на базе теоретических построений в клетках млекопитающих, но это пока не подтверждено с помощью функционального наблюдения (imaging) киназной активности. Хотя внеклеточные, крупномасштабные градиенты давно известны, как координирующие развитие многоклеточных организмов, недавние исследования показали, что внутриклеточные градиенты также играют важную роль на малой шкале внутриклеточной организации, демонстрируя, что они являются масштабно-инвариантным морфогенетическим принципов в биологии86,87.

Future directions


Наблюдение подвижности белков и белковых реакций это первый проблеск в механизмах, которые лежат в основе пространственно-временной организации клеток. Однако вещи часто иные, чем они выглядят на первый взгляд. Это особенно верно для клеточных процессов, которые используют сложную регуляцию с помощью обратных петель и само-организации, такой как клеточный морфогенез, клеточная подвижность и митозы. Чтобы понять организующие принципы этих процессов, необходимо информацию от quantitative imaging скомбинировать с компьютерным моделированием. Такие модели могут затем служить в качестве руководящих принципов, чтобы сформулировать новые гипотезы, чтобы улучшать как эксперимент, так и теорию повторяющимся способом.
Analyzing pattern formation by imaging and modelling. Ограниченное количество пространственных матриц внутри и вне клетки недостаточно, чтобы объяснить формирование чрезвычайно сложных структур, таких как разветвленные актиновые сети в клеточных выпячиваниях88 или ряды микротрубочек в митотическом веретене89. Такие сложные клеточные структуры, которые возникают в результате процессов само-организации (FIG. 1), часто инициируются, осуществляются и/или ограничиваются клеточными матрицами, такими как центромеры, хромосомы, кинетохоры и мембранные органеллы, включая плазматическую мембрану90.
На молекулярном уровне структура белка сама предоставляет собой матрицу для взаимодействия, которая в дальнейшем ограничивает возможности формирования паттернов, которые могут возникать из белковых взаимодействий. Напр., структурная информация в тубулиновых димерах достаточна для сборки пустотелых цилиндрических филамент, которые характеризуются направленной полярностью и несовершенным спиральным расположением субъединиц. Однако изобилие возможных структур высокого порядка, которые могут строиться на базовых принципах сборки, возникает в результате степеней свободы. с которой микротрубочки может быть расположены и сцеплены. Эти структуры могут динамически собираться с течением времени за счет флюктуаций, базирующихся на динамической нестабильности микротрубочек, изгибания филамент и ассоциаций, управляемых моторными белками, между индивидуальными филаментами90.
На простейшем уровне паттерны могут уже возникать в гомогенных реакционно-диффузионных системах. Теоретическая модель такой само-организующейся системы впервые была описана Turing в 1952 (REF. 93). В этой модели аутокаталитическое соединение активирует свой собственный ингибитор. Это ведет к локальным, само-умножающимся флюктуациям в концентрации активатора, которые пространственно ограничиваются более быстро диффундирующим ингибитором (FIG. 6a, left), давая в результате формирование паттерна de novo . Эта модель была применена для формирования многоклеточных структур во время развития животных, напр., в сегментации93,94 и формировании паттерна шерсти95,96. Однако, значительно меньше известно о её пригодности для формирования внутриклеточных паттернов на микрометровой шкале. Проблема в том, что диффузия активатора д. быть более медленно, чем ингибитора, чтобы сформировать стабильный паттерн, который характеризовался бы ограниченным распространением сигнала. Молекулярный вес большинства свободно распространяющихся, цитозольных белков составляет 10-100 kDa. Поскольку их коэффициент диффузии в воде обратно пропорционален их гидродинамическому радиусу, то малые белки д. распространяться в два раза быстрее, чем крупные белки. Напротив, диффузия белков замедляется на два порядка величин, если они ассоциируют с мембранами, это открывает возможный способ тонкого управления различиями подвижности белков, которое необходимо для формирования паттерна на малой шкале в клетке в соответствии с Turing.
Какова может быть роль таких механизмов формирования паттерна в клеточной передаче сигналов? На базе того, что диффузия ассоциированных с мембранами белков значительно медленнее, чем диффузия цитозольных белков, вполне возможно, что взаимодействие между RTKs и растворимыми белками Tyr phosphatases будет генерировать микроструктуры активности RTK на плазматической мембране. Типичные RTKs, такие как EGF рецепторы распространяются медленно (D = 0.1 µm2 s-1) в плоскости мембраны и часто активируются аутокаталитически. Кроме того, они могут активировать свои собственные ингибиторы (Src homology domain-содержащий белок Tyr phosphatases, такой как SHP1 (также известной как PTPN6)97), которые являются быстро распространяющимися цитозольными белками (D = 10 µm2 s-1). Сообщалось, что с помощью Tyr фосфорилирование SHP1 поддерживает её каталитическую активность98,99, которая может персистировать после освобождения от фосфорилированного рецептора, чтобы переносить свою активность на большие расстояния с помощью быстрой диффузии. Следовательно, системы передачи сигналов RTK могут содержать компоненты для паттерн-формирующих систем в соответствии с Turing. Моделирование с использованием правдоподобных параметров м. и в самом деле продуцировать стабильные на микрометровой шкале 2D точечные паттерны активности RTK, которые возникают из гомогенно распространенных компонентов за счет случайных флюктуаций (FIG. 6b). Было бы интересно посмотреть, могут ли такие паттерны активности RTK наблюдаться в живых клетках при функциональном imaging активности сенсоров и может ли компьютерное моделирование, такое каое было показано здесь предсказать модуляции их структуры, которая может быть верифицирована экспериментально.
В простейшей альтернативе модели типа Тьюринга100 , de novo клеточная поляризация дрожжей была воспроизведена с помощью компьютерного моделирования, используя правдоподобные параметры диффузиии реакции компонентов системы, полученная при imaging или биохимическом анализе101. В этом случае малая GTPase Cdc42 выполняет как роль медленно распространяющегося аутокаталитического активатора (связанный с плазматической мембраной активный Cdc42, который рекрутирует свой собственный активатор, guanine nucleotide exchange factor (GEF) Cdc24, с помощью своего эффектора bud emergence protein 1 (Bem1)) и быстро распространяющегося, локально истощаемого субстрата (цитозольного, неактивного, Cdc42; see FIG. 6a, middle). Наблюдения компьютерного моделирования и эксперименты сравнимы др. с др., это указывает, что такого Turing-типа механизм может, в самом деле, играть роль в поляризации дрожжей.
При более отличном, альтернативном механизме малые флюктуации двух компонентов A или B умножают самих себя путем высвобождения их общего ингибитора (FIG. 6a, right). Такой локальный механизм обратной связи был предположен как выполняющий критическую роль в контроле сигналов 'frontness' и 'backness' при поляризации индивидуальный нейтрофилов. Эта идея базируется на большом количестве экспериментальных доказательств из исследований по функциональному imaging. Сюда входят imaging продукции PtdIns(3,4,5)P3 с помощью PI3K (as in FIG. 3d), которая, как полагают, контролирует сигнал frontness, и imaging активности малой GTPase RHOA (с помощью FRET-based сенсора конформации), которая, как полагают, контролирует backness. Эта модель также приложима к полимеризации актина и контракции myosin103-106 ,

Figure 6 | Self-organization in intracellular pattern formation and structural growth processes. a | Coupling of reaction-diffusion mechanisms with positive feedback regulation can lead to the emergence of stable patterns from homogenous mixtures through intermediate, self-amplifying random fluctuations. The classical Turing model describes a system with short-range activation coupled to long-range inhibition (left). The substrate depletion variant of the Turing model does not require an explicit inhibitor (middle). Mutual inhibition is an alternative to self-amplification and can also produce positive feedback and the emergence of patterns from homogenously distributed activity states (right). b | Cellular automaton simulation for hypothetical Turing-based pattern formation of receptor Tyr kinase (RTK) activity. RTKs (green) are autocatalytic, membrane-associated, slowly diffusing activators of their own rapidly diffusing inhibitor, a protein Tyr phosphatase (PTP; red). Within ~ 5-10 seconds, spotted RTK activity patterns on a micrometre scale emerge spontaneously from fluctuations in a homogenous RTK activity distribution. c | Force-mediated positive feedback in a stigmergic morphological growth process can lead to the focusing of pushing forces into cell protrusions in a model system for neurite initiation. White arrows indicate foci in which the membrane curvature is locally increased by microtubule clustering. Image in part b is courtesy of M. Schmick, Max Planck Institute, Dortmund, Germany. Image in part c is reproduced, with permission, from REF. 113 © (2006) Springer.

которые, как полагают, исключают один др., исходя из механохимического сцепления107 и которые интимно связаны с противоположными frontness и backness сигнальными модулями103,104 (хотя детали того, как динамика актомиозина снабжается PI3K и RHOA сегодня отсутствуют в этой системе). Интересно, что оборот актина медленны по сравнению с диффузией участвующих сигнальных белков, это может облегчать формирование стабильного паттерна на шкале клетки по аналогии с моделью Turing.
Stigmergy and force-mediated feedback. Системы, такие как модель поляризации нейтрофилов, в которой возникают реакции само-организации, во время роста или ремоделирования физически ригидных структур, таких как актомиозин, часто организуются с помощью stigmergy2. Определенные аналогии между stigmergy в колониях насекомых и клеточной организацией очевидны (FIG. 1). Др. пример связывает феромоном-управляемые следы термитов со следами истощения тубулина при само-организации пространственно ограниченного роста микротрубочек108. Однако принципы stigmergy явно превосходят эти простые аналогии. Многие сложные клеточные структуры, такие как митотическое веретено, как полагают, возникают при комбинации преформированных матриц, само-сборкой управляемого роста, структурными перестройками управляемых направляющих сил и регуляции сомо-организющихся обратных связей109,110. Динамика таких само-организующихся процессов может быть снова понята при комбинировании микроскопического наблюдения с компьютерным моделированием. Такой подход особенно подходящий для минимальных, воспроизводимых систем, которые осуществляют контроль своего собственного состава. Напр., формирование полярных звезд микротрубочек, было воспроизведено в минимальной системе, в которой динамика микротрубочек переорганизовывалась при добавлении одиночного перекрестно-связывающего микротубулярного мотора. По аналогии с концепцией stigmergy, звезды могут расти за счет усиления фокусирования на полярных концах, которое может стимулировать усиление отлавливания микротрубочек и тем самым умножать свой собственный рост.
Сходные силы, обеспечивающие обратную связь видны в упрощенной клеточной модельной системе инициации неритов, в которой направленный транспорт микротрубочек из первоначально случайно ориентированных микротрубочек в outward-ориентированные, собранные в пучки наборы микротрубочек, наблюдаемые непосредственно с помощью imaging живых клеток. В этом случае, собранные в кластеры массивы микротрубочек, по-видимому, формируют малые локальные выпячивания за счет механизма само-усиления, при котором микротрубочки энергично толкаются в сторону плазматической мембраны, увеличивая изгиб мембраны, приводя к усилению отлавливания микротрубочек и образования кластеров и формирования само-собирающихся выпячиваний (FIG. 6c). Очевидно, что негативная обратная связь за счёт клеточной контрактильности препятствует формированию массивных выпячиваний до тех пор, пока она не будет устранена с помощью фармакологического ингибирования113. Т.о., само-организация, по-видимому, также является феноменом, которые переступает пределы шкал в живых организмах. Однако её роль во внутриклеточных взаимодействиях и клеточном морфогенезе далека от экспериментальных исследований.

Conclusion


Cell biology has moved from a descriptive science on the genes and gene products involved in a biological process to a more predictive, quantitative science on how the collective behaviour of molecular ensembles generate biological functionality on the scale of cells. For example, signal transduction has been perceived as a linear chain of events from the plasma membrane to the nucleus that is switched on by growth factor binding at the cell surface. Functional microscopic imaging studies of protein mobility and reactions in cells have substantially contributed to altering this concept to a more holistic view of interconverting, spatially organized states of the cytoplasm that are dynamically maintained by reaction cycles.
However, despite a large body of work focused on imaging biological activities and reactions in cells, the observed spatial and temporal patterns are often reported in a descriptive way. By contrast, theoretical and conceptual principles such as reaction–diffusion and selforganization are well-developed to interpret the dynamic properties of molecules within the ecology of a cell. The synergistic development of genetically encoded fluorescent probes and functional microscopic imaging technologies increases our ability to observe molecules in action in living cells. In combination with computational tools for the simulation of the spatiotemporal evolution of multiple coupled biochemical reactions, these approaches enable a recursive feedback loop between experimentation and modelling that will give us a deeper insight into the collective behaviour of nanometre-sized molecules and how this generates biological function on the micrometre scale of cells.
Сайт создан в системе uCoz