AV | CCS | l-LPM | PNC | si | ss | TGA

Все позвоночные обладают асимметричным расположением большинства внутренних органов вдоль left-right (LR) оси тела. Напр.. количество легочных долей отличается на левой и правой стороне, желудок и селезенка обнаруживаются слева, а верхушка сердца также располагается слева (Hamada et al.,[2002]). Эксперименты на модельных организмах выявили несколько законсервированных генов, которые влияют на эмбриональное развитие LR оси (Levin,[2005]). Манипуляции с избытком и недостатком функции могут изменять положение органов от (situs solitus, ss) до situs inversus (si), heterotaxia или зеркальнце удвоения индивидуальных асимметричных органов, таких как легкие (isomerism).

Заинтересованные гены могут действовать в разные временные точки развития. На стадиях гаструлы/нейрулы реснички, управляющие левонаправленным током жидкости, функционируют как детерминирующее латеральность событие у эмбрионов рыб, амфибий и млекопитающих (Nonaka et al.,[1998]; Kramer-Zucker et al.,[2005]; Okada et al.,[2005]; Schweickert et al.,[2007]). Следствием этого является асимметричная экспрессия TGF ростового фактора Nodal, активируемого в left lateral plate mesoderm (l-LPM). Посредством механизма позитивной обратной петли связи, экспрессия мРНК Nodal распространяется быстро вдоль всей длины l-LPM вплоть до зачатка сердца и непосредственно индуцирует транскрипцию ингибитора обратной связи Lefty2 и гомеобоксного транскрипционного фактора Pitx2c (Shiratori and Hamada,[2006]). В то время как экспрессия Nodal и lefty2 лишь преходящая, левая асимметричная экспрессия Pitx2c сохраняется в зачатках органов. Pitx2c, как полагают, регулирует и управляет асимметричным морфогенезом органов (Gage et al.,[1999]; Franco and Campione,[2003]).

Благодаря своей асимметричной функции по контролю кровотока сердце возможно наиболее критическая мишень для LR пути (Harvey,[1998]; Franco and Campione,[2003]). Часто LR мутантный фенотип сердца проявляется в transposition of the great arteries (TGA). TGA вызывает короткое соединение богатой кислородом атриальной и бедной кислородом венозной крови благодаря неправильному соединению аорты с правым. а легочной артерии с левым желудочком. TGA наблюдается в некоторых линиях нокаутных мышей, таких как , напр., Pitx2 и cryptic мутантных эмбрионов (Gage et al.,[1999]; Gaio et al.,[1999]; Yan et al.,[1999]).

Петлеобразование сердца первая видимая ступень асимметричного морфогенеза во время органогенеза. Помимо локализации верхушки зрелого сердца на левой стороне тела, процесс петлеобразования сам по себе необходим для предопределения разных функций сердца вдоль LR оси (Harvey,[1998]; Srivastava,[1999]; Kathiriya and Srivastava,[2000]). Во время петлеобразования sinus venosus (тракт притока) транслоцируется из его первоначально билатерально симметричной и задней позиции в линейной сердечной трубке на правое предсердие четырехкамерного сердца. Это событие является важным, поскольку эта область д. сформировать первичный водитель ритма (pace maker) cardiac conduction system (CCS; Gourdie et al.,[2003]). CCS представлена тремя компонентами: sino-atrial node (SAN; первичным ритмоводителем), который инициирует сердцебиения и контролирует скорость и ритм сокращений; atrio-ventricular (AV) узел и кольцо (вторичный ритмоводитель), который действует в качестве генератора задержки; и пучки His/Purkinje, которые распространяют действие потенциала на желудочки (Gourdie et al.,[2003]; Christoffels et al.,[2004]).

Т.к. некоторые гены, как известно, маркируют всю CCS, такие как Tbx3, Connexin 45, Nkx2.5 и трансгенная линия мышей обладающая слиянием engrailed2-LacZ (Coppen et al.,[1999]; Rentschler et al.,[2001]; Hoogaars et al.,[2004],[2007]; Mommersteeg et al.,[2007]), то специфические маркеры для индивидуальных компонентов редки. Недавно гомеобоксный ген Shox2 был описан как центральный фактор для формирования первичного ритмоводителя (Blaschke et al.,[2007]). Shox2 маркирует sinus venosus на эмбриональный день (E) 9.0, и со ст. E10.0 и далее специфически маркирует клетки первичного ритмоводителя в четерёхкамерном сердце (Blaschke et al.,[2007]). Позднее экспрессия Shox2обнаруживается в sinus valves (SV) и в центре самого ритмоводителя, т.e., в SAN, который располагается вблизи правого предсердия. Экспрессия Shox2 совпадает с транскрипцией HCN4, с само-деполяризующим ионным каналом, который является частью функции ритмоводителя (Stieber et al.,[2003]; and our own unpublished data). Делеция обоих Shox2 аллелей у мышей ведет к отсутствию SV и SAN и, следовательно, всего первичного ритмоводителя (Blaschke et al.,[2007]).

Морфогенез первичного ритмоводителя демонстрирует, что асимметричное петлеобразование первичного ритмоводителя per se, иное, чем позиционирование верхушки сердца, это крайне важно для функции развивающегося сердца. Неожиданно, петлеобразование не нарушено у нокаутных по Pitx2 и cryptic эмбрионам (Gage et al.,[1999]; Gaio et al.,[1999]; Franco and Campione,[2003]; Shiratori et al.,[2006]), хотя тяжелые пороки сердца, такие как TGA возникают у таких экземпляров. Образование петли сердца, однако находится под контролем основных компонентов LR пути, т.к. оно изменяется у LR мутантов таких как iv/iv и inv/inv (Hanzlik et al.,[1990]; Lowe et al.,[1996]). Следовательно, и др. асимметрично экспрессируемые факторы д. существовать, которые регулируют направление петлеобразования сердца.

При скрининге новых асимметрично экспрессирующихся генов мы идентифицировали у мышей Gal, кодирующий нейропептид Galanin (Gaio and Britsch, unpublished results). Gal специфически экспрессируется на левой стороне линейной трубки сердца у эмбрионов E8.5. В четырехкамерном сердце Gal mRNA локализуется в центре вторичного ритмоводителя, AV кольце и AV узле. Gal асимметрия находится под LR контролем, т.к его экспрессия оказывается правосторонней у inv/inv и рандомизированной у эмбрионов iv/iv. Неожиданно асимметрия Gal оказалась независимой от cryptic, демонстрируя, что cryptic-независимый механизм участвует в латерализации сердца.

DISCUSSION

Полученные данные выявили три свойства гена Gal у мыши: (1) Gal является первым специфическим маркером AV уза и колец, т.е. вторичного ритмоводителя в развивающемся сердце; (2) Gal является первым сердце-специфическим асимметричным маркерным геном; (3) Gal является первым асимметрично экспрессирующимся геном, независимым от cryptic.

Galanin and Heart

Несколько сообщений уже указывало на связь Galanin и сердечно-сосудистой системы. Напр., интрацистернальное или прямое воздействие полной длины или укороченной формы Galanin на кровоток взрослых крыс индуцирует гипотензию и тахикардию (Diaz-Cabiale et al.,[2002],[2005]). Специфичность этих эффектов продемонстрирована с использованием фармакологических ингибиторов рецепторов Galanin, которые вызывали изменения сердцебиений и кровяного давления (Diaz-Cabiale et al.,[2005]). Однако эти данные были интерпретированы как эффекты на симпатическую или парасимпатическую иннервацию сердца, т.е. были отнесены к известной функции Galanin в нервной системе (Bedecs et al.,[1995]). Дополнительным подтверждением этого мнения стали эксперименты, в которых propranolol, a β-adrenergic антагонист устранял Galanin индуцированную тахикардию и гипотензию (Diaz-Cabiale et al.,[2002]).

Наша находка, что Gal экспрессируется в развивающейся проводящей системе, а именно в AV узле и кольцах, подтверждает функцию Galanin в сердце, но говорит в пользу его роли в самом сердце, специфически в эмбриональной CCS. Воздействие на сердца эмбрионов мышей и крыс Galanin и антагонистами Galanin может открыть специфические функции Galanin по задержке генератора вторичного ритмоводителя.

Были получены нокаутные мыши, но не был описан фенотип сердца (Holmes et al.,[2000]; Kerr et al.,[2000]). Новое исследование мышей выявило ранее не обнаруженные дефекты сердца. Gal-специфический фенотип отсутствует, если функция вторичного ритмоводителя нарушена лишь слегка. Альтернативно, дополнительные факторы могут действовать в AV узле и кольцах. Левая асимметричная экспрессия Gal коррелирует неожиданно с началом асимметричных эмбриональных сердцебиений (Satin et al.,[1988]; Fishman and Chien,[1997]; Harvey,[1998]). У эмбрионов крыс левая и правая сторона зачатка сердца бьётся асимметрично до слияния (Fishman and Chien,[1997]). Интересно, что левая сердечная трубка начинает сердцебиения приблизительно на 2 ч раньше правого и со значительно более высокой частотой (Fishman and Chien,[1997]). Тот же самый феномен был описан у эмбрионов кур (Satin et al.,[1988]). Кроме того, если слиянию зачатков сердца препятствуют у эмбрионов кур за счет рассечения, то в возникающих в результате двух сердцах левое сердце бьётся раньше и быстрее (Satin et al.,[1988]). Базируясь на наблюдаемых паттернах экспрессии Gal, можно предположить, что Galanin может быть , по крайней сере, частично ответственен за эти L/R различия. Кроме того, многие пациенты, страдающие от синдромов heterotaxia, обнаруживают дефекты AV канала и часто обнаруживают нарушения сердечного ритма от медленного атриального ритма до полной блокады сердца (Bartram et al.,[2005]), указывая тем самым на связь лево-правостороннего пути на развитие CCS.

Early Galanin Functions

Самая ранняя транскрипция Gal наблюдается у эмбрионов мышей на ст. гаструлы в первичной полоске и PNC (Fig. 1A). Если в первичной полоске экспрессия соотв. строгая, PNC сигналы отличаются существенно в зависимости от генетического фона эмбрионов. У эмбрионов C57/Bl6 и OLA (cryptic мыши) экспрессия вокруг PNC наблюдается очень временно и исчезает прежде чем эмбрионы достигнут ст. 5-сомитов. Напротив на FVB (inv мыши) и SI/Col (iv мыши) фоне мРНК сигналы оказываются значительно сильнее и обнаруживаются также по всей формирующейся хорде. Кроме того, экспрессия временно увеличивается так. что сигналы исчезают только после эмбрионального превращения (turning) (cf. Figs. 1C, 3A, and Fig. 2B-D; and data not shown). Сходные наблюдения действительно сильных зависимых от линий различий в пространственно-временном паттерне экспрессии генов не были описаны в литературе. Фенотипические вариации в зависимости от генетического фона, однако хорошо известны для многих нокаутных аллелей, поэтому возникает возможность, что различия в фенотипе могут быть, по крайней мере частично, обусловлены различиями в генной экспрессии.

паттерн экспрессии Gal сам по себе очень сильно напоминает Nodal, за исключением того, что Nodal не распространяется на формирующуюся хорду. Чтобы исследовать возможность, что Gal является мишенью для Nodal, необходимы условные cripto или Nodal нокауты, т.к. полная делеция обоих генов ведет к эмбриональной летальности до начала экспрессии Gal (Conlon et al.,[1994]; Ding et al.,[1998]). В любом случае экспрессия нейропептида в гаструле, т.е., в отсутствие какой-либо нервной ткани, является довольно неожиданной. Отсутствие гаструляционного фенотипа у Gal нокаутных эмбрионов демонстрирует, что Galanin не важен для гаструляции (Holmes et al.,[2000]; Kerr et al.,[2000]). Однако близко родственный Galanin-подобный пептид GALP может дополнять Gal функцию у ранних эмбрионов.

Galanin and LR Asymmetry

Наш анализ генной экспрессии во время морфогенеза сердца идентифицировал Gal в качестве нового асимметрично экспрессирующегося гена. Gal отличается от др. асимметричных маркеров, т.к. это первый ген с исключительно лево-специфическим паттерном в линейной сердечной трубке. Гены, такие как Pitx2c или Nodal распространяют свое действие на сердечную трубку, но их экспрессия неотделима от левой LPM. Др. гены. такие как eHand, dHand или Shox2 транскрибируются асимметрично в четырехкамерном сердце (Thomas et al.,[1998]; Blaschke et al.,[2007]). Их экспрессия однако возникает во время события петлеобразования, т.e., скорее всего отражает формирование передне-заднего паттерна, но не регуляцию с помощью L/R пути (Thomas et al.,[1998]). Наблюдение асимметричной экспрессии генов, особенно в сердце, т.о., недостаточно, чтобы судить об участии в развитии латеральности.

В противоположность асимметричной транскрипции Gal четко зависимой от L/R пути, лево-асимметриная экспрессия Gal присутствует (1) в трубчатом сердце перед петлеобразованием; и (2) изменяется у гомозиготных inv и iv эмбрионов. неожиданная находка, что транскрипция Gal не меняется у cryptic мутантных эмбрионов представляет собой первый пример асимметрично экспрессируемого гена, который не находится под контролем cryptic-зависимой передачи сигналов Nodal в левой LPM. Эти данные согласуются с наблюдением, что петлеобразование сердца не затрагивается у наших cryptic мутантных мышей (Gaio et al.,[1999]; and data not shown). Мы осведомлены об отличии нашего аллеля и аллеля во второй опубликованной cryptic линии, в которой петлеобразование сердца описано как рандомизированное (Yan et al.,[1999]). эта изменчивость однако может быть обусловлена отличиями линии. Имеется прецедент для изменчивости, связанной с LR фенотипами, напр., при ActRIIB нокауте (Oh and Li,[1997]). Альтернативно, Gal экспрессия может затронута в этой второй cryptic нокаутной линии, формальная возможрность этого не тестировалась в этой работе.

Помимо Gal, мы показали, что экспрессия Pitx2c также сохраняется в формирующемся сердце приблизительно у половины cryptic мутантных особей, тогда как транскрипция в LPM постепенно снижается. Предыдущий анализ cryptic нокаутных эмбрионов не выявил резидуальной транскрипции Pitx2c в сердце (Gaio et al.,[1999]; Yan et al.,[1999]). Наша новая находка скорее всего обусловлена техническими улучшениями протокола WMISH. Однако уже в нашем инициальном описании мутантов мы подтвердили, что Lefty выявляется наиболее переднем аспекте LPM домена. т.е. области, соседней с зачатком сердца, у 4/12 cryptic мутантов (Gaio et al.,[1999]).

Исходя из представленного анализа Gal и данных по Lefty и Pitx2c, мы предполагаем существование др. механизма для определения латеральности сердца, отличного от cryptic-специфическогопути в LPM. Зависимость асимметричной генной экспрессии в LPM и сердце от Nodal недвусмысленно была продемонстрирована на эмбрионах, у которых домен PNC экспрессии Nodal был устранен и поэтому весь LPM каскад отсутствовал (Lowe et al.,[2001]; Brennan et al.,[2002]; Saijoh et al.,[2003]). Базируясь на повсеместной экспрессии cripto в линейной сердечной трубке (cf. Fig. 3D and Oki et al.,[2007]), и на том, что экспрессия cripto не меняется у cryptic мутантных эмбрионов (not shown), мы полагаем. что Cripto функционирует как корепрессор Nodal в формирующемся сердце. Ткань сердца д. поэтому быть компетентна отвечать на сигнал Nodal, если он присутствует в сердце. Экспрессия Nodal в самом сердце не описана у эмбрионов мышей. У эмбрионов кроликов, однако сигналы Nodal четко обнаружимы в левой части зачатка сердца (our unpublished results), тем самым открывается возможность, что сигналы у мышей также присутствуют. Альтернативно, белок Nodal может достигать сердца из др. источника, а именно из PNC. Экспрессия Nodal в PNC всё ещё присутствует у cryptic мутантов (Gaio et al.,[1999]; Yan et al.,[1999]). Растут доказательства роли асимметричной дальнодействующей передачи сигналов Nodal в трансдукции асимметричных сигналов, генерируемых левонаправленным током от PNC к левой LPM (Oki et al.,[2007]). Белок Nodal, как было показано, действует на расстоянии у эмбрионов рыбок данио (Chen and Schier,[2001]). Поэтому мы можем предположить, что Nodal индуцирует транскрипцию Gal и Pitx2c в зачатке левой части сердца cripto-зависимым, но cryptic-независимым способом. Пока невозможно прямо проверить эту гипотезу, т.к. cripto нокауты подобно Nodal мутантам погибают в начале гаструляции (Conlon et al.,[1994]; Ding et al.,[1998]).

In summary, we describe Gal as a novel mouse-specific asymmetric gene controlled by the LR pathway, which marks the secondary pace maker in the developing embryonic heart. In addition to its proposed role as a target and potential effector of the LR pathway, Gal should be an ideal marker for future studies on the developing cardiac conduction center.