Роль фактора TGFβ3

TGFβ3 is expressed in differentiating muscle of the embryonic mouse tongue AKIRA YAMANE , TADAYOSHI FUKUI, TAKEO SUGA, RYOHEI IIDA and MITSUHIKO MORITO Int. J. Dev. Biol. 54: 221-226 (2010)
The purpose of the present study was to elucidate the involvement of transforming growth factor betas (TGFβs) in the differentiation of tongue striated muscles by analyzing the expression of TGFβs, their receptors and factors of TGFβ signal transduction in the mouse tongue between embryonic days 11 (E11) and E15. The expression levels of TGF(i3 mRNA and protein were much higher than those of TGFβi and TGF/32, and the immunolocalization of TGFβ3 was more consistent with the differentiating muscle cells in comparison with those of TGFβi and 2 between E12 and E15. TGFβRI and II were localized to the differentiating muscle cells between Ell and E15. Phosphorylated-smad2/3 was localized to the nucleus of muscle cells which just began to differentiate. These results suggest that the signal of TGFβ3, but not that of β1 or β2, may be involved in the early stages (particularly the beginning) of differentiation of mouse tongue muscle cells through TGFβRI, TGFβRII, and smad2/3.	Поперечно полосатые мышцы языка участвуют в выполнении нескольких важных физиологических задач, таких как жевание, глотание, дыхание и речь человека. Клетки предшественники мышц языка подвергаются детерминации в окципитальных сомитах (сомиты 2-5) между embryonic days (E) 8 и E11 (Mayo etal., 1992). Они мигрируют в первую бранхиальную дугу между E9 и E11 и становятся миобластами (Mayo etal., 1992)перед слиянием, чтобы сформировать мышечные трубки между E13 и E15 (Yamane, 2005; Yamane etal., 2000a). Эти мышечные трубки затем созревают в быстро сокращающиеся миофибриллы между E15 и рождением (Yamane, 2005; Yamane etal., 2000a). Ранее мы исследовали роль ростовых факторов, таких как transforming growth factors α (TGFα), insulin-like growth factor (IGF) и hepatocyte growth factor (HGF), используя систему органных культур языка и нижней челюсти мыши (Yamane et ai, 2003). Роли IGF-I, HGF и TGFα в миогенезе языка почти идентичны с ролью в миогенезе конечностей и культивируемых миогенных клеточных линий, таких как C2 и L6, это указывает на то, что программа, которая управляет миогенезом языка сходна с программами в конечностях и культивируемых миогенных клеточных линиях. Однако в некоторых сообщениях предполагается, что в действительности программа отличается от таковых в конечностях и культивируемых линиях клеток; они показали, что миогенез и синаптогенез языка мыши завершается на гораздо более ранних стадиях, чем в мышцах конечностей (Yamane, 2005) и что профили экспрессии miRNAs в развивающихся поперечнополосатых мышцах языка, которые как было показано, играют важную роль в миогенезе, отличаются от таковых в конечностях и культивируемых линиях мышечных клеток (Yamane and Fukui, 2007). Transforming growth factor-β (TGFβ) семейство у млекопитающих состоит из трех разных белков TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3, которые играют важную роль в развитии многих типов тканей и клеток (Dunker and Krieglstein, 2000: Nilsen-Hamilton, 1990). Три индивидуальных TGFβ null-мутанта обнаруживают самостоятельные, лишь частично перекрывающиеся фенотипы. У мыши целенаправленное разрушение гена TGFβ1 приводит к диффузному и летальному воспалению спустя примерно 3 недели после рождения, указывая на важную роль TGFβ1 в регуляции пролиферации иммунных клеток и просачивания в ткани (Kulkarni et ai, 1993; Shull et at., 1992). TGFβ2 нулевые мыши обнаруживают широкий круг онтогенетических дефектов, включая сердце, лёгкие, конечности, глаза, уши и мочеполовые дефекты (Sanford et at.. 1997). TGFβ3 нулевые мутации вызывают исключительно дефектный генез нёба и задержку легочного развития (Kaartinen et ai, 1995; Proetzel et at., 1995). Однако у этих TGFβ нулевых мышей развитие поперечнополосатых мышц языка не было тщательно проанализировано. При развитии скелетных мышц функция TGFβs в основном изучалась на культивируемых миогенных клетках, таких как C2C12 (De Angelis etal., 1998; Florini etal., 1986; Olson etal., 1986), L6 (Matsushita etal., 2004) и культивируемом органе (Stern etal., 1997), и встречается мало in vivo исследований в литературе (Cusella-De Angelis et al., 1994; Kollias and McDermott, 2008). Исследования in vivo показали, что TGFβ1 ингибирует дифференцировку клеток скелетных мышц, указывая на то, что TGFβs играют роль в развитии поперечнополосатых мышц языка. Однако нет сообщений о роли TGFβs в развитии поперечнополосатых мышц языка. Discussion В данном исследовании уровни экспрессии TGFβ3 vHYR и белка были значительно выше, чем таковые TGFβ1 и 2, а иммунолокализация TGFβ3 лучше всего согласовалась с дифференцирующимися мышечными клетками языка мыши по сравнению с TGFβ1 и 2 между E12 и E15. Эта наивысшая экспрессия и соответствие локализации TGFβ3 с дифференцирующимися мышечными клетками языка указывают на то, что TGFβ3, но не TGFβ1 и 2, участвует в ранних стадиях дифференцировки мышечных клеток языка. Имеются доказательства, подтверждающие, что воздействие TGFβ3, но не TGFβ1 и 2, ингибирует дифференцировку L6 миогенных клеток (Matsushita et ai., 2004). Известны несколько сообщений, что TGFβ ингибирует дифференцировку клеток скелетных мышц путем репрессии семейства myoD, включая myf5, myoD, myogenin и MRF4, которые являются ключевыми регуляторами развития скелетных мышц. TGFβ ингибирует транскрипционную активность myogenin не затрагивая его сродства связывания с ДНК. TGFβ находит bHLH регион у всех членов семейства myoD, снижая их ДНК транскрипционную активность, не затрагивая их свойств связывания, кроме того, TGFβ также ингибирует транскрипцию гена MyoD, снижая тем самым как его уровень, так и активность. Поскольку уровни экспрессии членов семейства myoD, за исключением MRF4, высокие между Е11 и Е15 и поскольку мышечные клетки языка активно дифференцируются между Е12 и Е15, то TGFβ сигнал может использоваться для контроля хода дифференцировки мышечных клеток языка в физиологических рамках и для предупреждения избыточной дифференцировки за счёт репрессии транскрипционной активности высоких уровней экспрессии myf5, myoD и myogenin. Фосфорилирование TGFβRI в гетеромерных рецепторных комплексах активирует smad2/3 за счет C-терминального фосфорилирования smad2/3. Из рецепторного комплекса высвобождается p-smad2/3, транслоцируется в ядро и регулирует трансляцию генов мишеней (Derynck and Zhang, 2003). В данном исследовании p-smad2/ 3 был локализован в ядрах дифференцирующихся мышечных клеток в мышцах языка на ст. E12, тогда как smad2/3 был локализован в цитоплазме дифференцирующихся мышечных клеток. Поскольку дифференцировка мышечных клеток языка начинается приблизительно на ст. E12 (Yamane, 2005; Yamane et al., 2000a), расположение p-smad2/3 в ядре может участвовать в начале фи мышечных клеток языка. В данном исследовании при дифференцировке мышечных клеток языка выявляется только белок TGFβ3 с помощью Western blotting анализа и анализа RT-PCR, которые продемонстрировали более высокие уровни экспрессии TGFβ3 мРНК по сравнению с таковыми TGFβ1 и 2. Эти результаты Western blotting и RT-PCR анализа согласуются с тем, что TGFβ3, а не TGFβ1 и 2, участвует в дифференцировке мышечных клеток языка. Результаты Western blotting анализа показали, что уровни экспрессии TGFβRI и p-smad2/3 постепенно снижаются между E11 и E15. Иммуногистохимический анализ продемонстрировал, что дифференцировка мышечных клеток языка активно прогрессирует между E11 и E15 и практически завершается на ст. ~E15, это согласуется с предыдущими сообщениями (Yamane, 2005; Yamane etal., 2000b). Эти результаты показывают, что TGFβ3 сигнал участвует на ранних стадиях (особенно вначале) дифференцировки мышечных клеток языка ~ на ст.E12.

Поперечно полосатые мышцы языка участвуют в выполнении нескольких важных физиологических задач, таких как жевание, глотание, дыхание и речь человека. Клетки предшественники мышц языка подвергаются детерминации в окципитальных сомитах (сомиты 2-5) между embryonic days (E) 8 и E11 (Mayo etal., 1992). Они мигрируют в первую бранхиальную дугу между E9 и E11 и становятся миобластами (Mayo etal., 1992)перед слиянием, чтобы сформировать мышечные трубки между E13 и E15 (Yamane, 2005; Yamane etal., 2000a). Эти мышечные трубки затем созревают в быстро сокращающиеся миофибриллы между E15 и рождением (Yamane, 2005; Yamane etal., 2000a).

Ранее мы исследовали роль ростовых факторов, таких как transforming growth factors α (TGFα), insulin-like growth factor (IGF) и hepatocyte growth factor (HGF), используя систему органных культур языка и нижней челюсти мыши (Yamane et ai, 2003). Роли IGF-I, HGF и TGFα в миогенезе языка почти идентичны с ролью в миогенезе конечностей и культивируемых миогенных клеточных линий, таких как C2 и L6, это указывает на то, что программа, которая управляет миогенезом языка сходна с программами в конечностях и культивируемых миогенных клеточных линиях. Однако в некоторых сообщениях предполагается, что в действительности программа отличается от таковых в конечностях и культивируемых линиях клеток; они показали, что миогенез и синаптогенез языка мыши завершается на гораздо более ранних стадиях, чем в мышцах конечностей (Yamane, 2005) и что профили экспрессии miRNAs в развивающихся поперечнополосатых мышцах языка, которые как было показано, играют важную роль в миогенезе, отличаются от таковых в конечностях и культивируемых линиях мышечных клеток (Yamane and Fukui, 2007).

Transforming growth factor-β (TGFβ) семейство у млекопитающих состоит из трех разных белков TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3, которые играют важную роль в развитии многих типов тканей и клеток (Dunker and Krieglstein, 2000: Nilsen-Hamilton, 1990). Три индивидуальных TGFβ null-мутанта обнаруживают самостоятельные, лишь частично перекрывающиеся фенотипы. У мыши целенаправленное разрушение гена TGFβ1 приводит к диффузному и летальному воспалению спустя примерно 3 недели после рождения, указывая на важную роль TGFβ1 в регуляции пролиферации иммунных клеток и просачивания в ткани (Kulkarni et ai, 1993; Shull et at., 1992). TGFβ2 нулевые мыши обнаруживают широкий круг онтогенетических дефектов, включая сердце, лёгкие, конечности, глаза, уши и мочеполовые дефекты (Sanford et at.. 1997). TGFβ3 нулевые мутации вызывают исключительно дефектный генез нёба и задержку легочного развития (Kaartinen et ai, 1995; Proetzel et at., 1995). Однако у этих TGFβ нулевых мышей развитие поперечнополосатых мышц языка не было тщательно проанализировано.

При развитии скелетных мышц функция TGFβs в основном изучалась на культивируемых миогенных клетках, таких как C2C12 (De Angelis etal., 1998; Florini etal., 1986; Olson etal., 1986), L6 (Matsushita etal., 2004) и культивируемом органе (Stern etal., 1997), и встречается мало in vivo исследований в литературе (Cusella-De Angelis et al., 1994; Kollias and McDermott, 2008). Исследования in vivo показали, что TGFβ1 ингибирует дифференцировку клеток скелетных мышц, указывая на то, что TGFβs играют роль в развитии поперечнополосатых мышц языка. Однако нет сообщений о роли TGFβs в развитии поперечнополосатых мышц языка.

Discussion

В данном исследовании уровни экспрессии TGFβ3 vHYR и белка были значительно выше, чем таковые TGFβ1 и 2, а иммунолокализация TGFβ3 лучше всего согласовалась с дифференцирующимися мышечными клетками языка мыши по сравнению с TGFβ1 и 2 между E12 и E15. Эта наивысшая экспрессия и соответствие локализации TGFβ3 с дифференцирующимися мышечными клетками языка указывают на то, что TGFβ3, но не TGFβ1 и 2, участвует в ранних стадиях дифференцировки мышечных клеток языка. Имеются доказательства, подтверждающие, что воздействие TGFβ3, но не TGFβ1 и 2, ингибирует дифференцировку L6 миогенных клеток (Matsushita et ai., 2004).

Известны несколько сообщений, что TGFβ ингибирует дифференцировку клеток скелетных мышц путем репрессии семейства myoD, включая myf5, myoD, myogenin и MRF4, которые являются ключевыми регуляторами развития скелетных мышц. TGFβ ингибирует транскрипционную активность myogenin не затрагивая его сродства связывания с ДНК. TGFβ находит bHLH регион у всех членов семейства myoD, снижая их ДНК транскрипционную активность, не затрагивая их свойств связывания, кроме того, TGFβ также ингибирует транскрипцию гена MyoD, снижая тем самым как его уровень, так и активность. Поскольку уровни экспрессии членов семейства myoD, за исключением MRF4, высокие между Е11 и Е15 и поскольку мышечные клетки языка активно дифференцируются между Е12 и Е15, то TGFβ сигнал может использоваться для контроля хода дифференцировки мышечных клеток языка в физиологических рамках и для предупреждения избыточной дифференцировки за счёт репрессии транскрипционной активности высоких уровней экспрессии myf5, myoD и myogenin.

Фосфорилирование TGFβRI в гетеромерных рецепторных комплексах активирует smad2/3 за счет C-терминального фосфорилирования smad2/3. Из рецепторного комплекса высвобождается p-smad2/3, транслоцируется в ядро и регулирует трансляцию генов мишеней (Derynck and Zhang, 2003). В данном исследовании p-smad2/ 3 был локализован в ядрах дифференцирующихся мышечных клеток в мышцах языка на ст. E12, тогда как smad2/3 был локализован в цитоплазме дифференцирующихся мышечных клеток. Поскольку дифференцировка мышечных клеток языка начинается приблизительно на ст. E12 (Yamane, 2005; Yamane et al., 2000a), расположение p-smad2/3 в ядре может участвовать в начале фи мышечных клеток языка.

В данном исследовании при дифференцировке мышечных клеток языка выявляется только белок TGFβ3 с помощью Western blotting анализа и анализа RT-PCR, которые продемонстрировали более высокие уровни экспрессии TGFβ3 мРНК по сравнению с таковыми TGFβ1 и 2. Эти результаты Western blotting и RT-PCR анализа согласуются с тем, что TGFβ3, а не TGFβ1 и 2, участвует в дифференцировке мышечных клеток языка. Результаты Western blotting анализа показали, что уровни экспрессии TGFβRI и p-smad2/3 постепенно снижаются между E11 и E15. Иммуногистохимический анализ продемонстрировал, что дифференцировка мышечных клеток языка активно прогрессирует между E11 и E15 и практически завершается на ст. ~E15, это согласуется с предыдущими сообщениями (Yamane, 2005; Yamane etal., 2000b). Эти результаты показывают, что TGFβ3 сигнал участвует на ранних стадиях (особенно вначале) дифференцировки мышечных клеток языка ~ на ст.E12.

TGFβ3 is expressed in differentiating muscle of the embryonic mouse tongue AKIRA YAMANE , TADAYOSHI FUKUI, TAKEO SUGA, RYOHEI IIDA and MITSUHIKO MORITOInt. J. Dev. Biol. 54: 221-226 (2010)

TGFβ3 is expressed in differentiating muscle of the embryonic mouse tongue
AKIRA YAMANE , TADAYOSHI FUKUI, TAKEO SUGA, RYOHEI IIDA and MITSUHIKO MORITO
Int. J. Dev. Biol. 54: 221-226 (2010)