Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus
Ning Wang, Jessica D. Tytell & Donald E. Ingber Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, 75-82 (January 2009) | doi:10.1038/nrm2594
Research in cellular mechanotransduction often focuses on how extracellular physical forces are converted into chemical signals at the cell surface. However, mechanical forces that are exerted on surface-adhesion receptors, such as integrins and cadherins, are also channelled along cytoskeletal filaments and concentrated at distant sites in the cytoplasm and nucleus. Here, we explore the molecular mechanisms by which forces might act at a distance to induce mechanochemical conversion in the nucleus and alter gene activities.
Рис.1. | Structural connectivity and long-distance force propagation.
Мало известно о механизмах, с помощью которых индивидуальные клетки воспринимают механические сигналы и передают их в виде изменений во внутриклеточной биохимии и генной экспрессии - процесс, известный как mechanotransduction. Хорошо известно, что когда физическая сила прикладывается к клеточной поверхности, то она искривляет мембранный кортекс и затем быстро рассеивается в цитоплазме1. Следовательно, механохимические превращения могут появляться в или вблизи этих сайтов клеточной поверхности. Как и ожидалось рецепторы поверхности мембраны - такие как интегрины и кадхерины, которые обеспечивают клеточную адгезию с каркасом внеклеточного матрикса (ECM) и соседними клетками соотв. - играют центральную роль в механотрансдукции2.
Воздействие механических стимулов, таких как жидкостные сдирающие стрессы (fluid shear stress), к клеточной поверхности активирует механочувствительные ионные каналы, гетеротримерные G белки, протеин киназы и др. ассоциированные с мембранами молекулами сигнальной трансдукции; они запускают стоящие ниже сигнальные каскады, это ведет к зависимым от усилий изменениям генной экспрессии3 (see the Review by Hahn and Schwartz103 in this issue). Но такие реакции обычно обеспечиваются с помощью искривления специфических рецепторов адгезии, которые связаны с цитоскелетом скорее, чем за счет только деформации липидного бислоя. Напр., эндотелиальные клетки ощущают fluid shear посредством межклеточных соединительных комплексов, которые содержат vascular endothelial (VE)-cadherin и platelet/endothelial cell-adhesion molecule 1 (), в дополнение к активации integrin4. Механические силы, которые прикладываются непосредственно к интегринам при использовании микроманипуляций или магнитной техники, также изменяют ток ионов через активируемые стрессом ионные каналы5, 6 (see the Review by Chalfie104 in this issue), передачу сигналов зависимого от G-белка cyclic AMP7, кинетику связывания структурных молекул8 (напр., zyxin), образование protein-translation-комплексов9 и активности протеин киназ, таких как p130CAS (также известной как ) и Src3, 10. Т.о., поверхностные адгезивные рецепторы и белки фокальных адгезий играют ключевую роль в передаче механических сигналов в разных типах клеток, поэтому область механотрансдукции в основном касается клеточной поверхности1.
Механические воздействия д. быстро диссипировать после прохождения через плазматическую мембрану. Следовательно, имеет смысл сфокусироваться на передаче сигналов на поверхности, рассматривая клетку как эластическую мембрану, которая окружает вязкую или вязко-эластическую цитоплазму, которая заполнена цитоскелетными филаментами, которые постоянно деполимеризуются и реполимеризуются11-13 (Box 1). Однако альтернативная модель клеточной структуры указывает на то, что динамически ремоделируемый цитоскелет является также 'hard-wired' (жестко-связанной) tensegrity сетью, которая может способствовать скоординированным изменениям в клетке, цитоскелета и ядерной структуры в ответ на механические деформации14 (Fig. 1a). (Здесь термин hard-wired означает цитоскелетные структуры, которые являются достаточно стабильными cytoskeletal, т.к.взаимосвязанные единицы противостоят механическим стрессам и тем самым поддерживают стабильность формы, даже если подвергаются постоянному динамическому ремоделированию на молекулярном уровне.) Эта модель учитывает наблюдения, что индивидуальные филаменты цитоскелета могут выдерживать значительные растягивающие и сжимающие нагрузки в живых клетках, благодаря тому, что их структурная интеграция сохраняется более продолжительно, чем время оборота индивидуальных белковых мономеров15-17.
Ключом к модели клеточной tensegrity является идея, что в целом стабильность клеточной формы и перенос дально-действующих сил управляются уровнем изометрического натяжения или 'prestress' в цитоскелете, которое генерируется благодаря установлению баланса сил между противоположными структурными элементами (т.е., микротрубочками, сократительными микрофиламентами и внеклеточными адгезиями) (Fig. 1a). Это происходит потому, что клетки могут натягиваться и тем самым делаются тугими, оказывая весовую нагрузку на филаменты по сравнению с окружающими регионами цитоплазмы14, 18, 19. При таком типе prestressed негомогенном прочном каркасе механические сигналы распространяются по цитоплазме значительно быстрее, чем базирующиеся на диффузии химические сигналы (Box 1) (see the Review by Jaalouk and Lammerding105 in this issue). Однако вязко-эластичные свойства цитозоля, которые пропитывают эту предварительно напряженную сеть, могут также влиять на распространение стрессового воздействия к удаленным цитоплазматическим сайтам на более медленной временной шкале, а нековалентные межбелковые взаимодействия в цитоплазме могут управлять зависимым от времени повышением жесткости и неэластичной диссипацией энергии в клетке20.
Поскольку integrins и cadherins физически связаны с филаментной сетью цитоскелета, которая в свою очередь связана с каркасом ядра, ядрышками, хроматином и ДНК внутри ядра, то механические силы, которые воздействуют на поверхность, делают больше, чем активируя события передави сигналов через мембрану - они способствуют также структурным перестройкам в глубине цитоплазмы и ядре21, 22. Возникает интригующая возможность, что механические силы, прикладываемые к клеточной поверхности, могут действовать на расстоянии способствуя механохимическим превращениям в цитоплазме. Такой жестко закрепленный механизм для прямой ядерной механотрансдукции особенно интересен, т.к. распространение сигнала, базирующегося на механике, намного быстрее, чем распространение сигналов с помощью химической диффузии или с помощью транслокации.
The hard-wired cell
Экспериментальные исследования, которые предприняты, чтобы протестировать предсказания модели клеточной tensegrity, подтвердили, что если поверхностные интегрины подвергаются непосредственному стрессу от воздействия значительных сил с помощью лигандом покрытой микропипетки или магнитных частиц или с помощью физической деформации клеток, которые прикреплены к флексибельному субстрату, покрытому ECM, то можно наблюдать непосредственные зависимые от силы изменения внутренних структур, таких как митохондрии и ядрышки, глубоко внутри цитоскелета и в ядре, соотв.22, 24-26. Натяжение интегринов в культивируемых клетках индуцирует молекулярные реконструкции индивидуальных актиновых стрессовых волокон и ядрышек, которые меняют свою позицию и реориентируются вдоль вновь возникших линий поля натяжения22 (Fig. 1b,c). Силы, которые воздействуют на интегрины индуцируют также смещения митохондрий и ядрышек на расстоянии до 20 µm от места приложения силы, тогда как генерализованные деформации поверхностного бислоя - за счет натягивания трансмембранных метаболических рецепторов, которые не строго соединены с актиновыми пучками цитоскелета - продуцируют лишь локальные эффекты на клеточной поверхности24. Механическая связь между интегринами и ядрами теряется, когда промежуточные филаменты разрушены22,, а fluid shear стрессы, которые тащат эндотелиальные клетки, несмотря на их фиксированные локальные адгезии, также смещают промежуточные филаменты глубоко в цитоплазму27. Т.к. сходная механическая связь может быть продемонстрирована в клетках с нарушенной проницаемостью мембраны в присутствии АТФ, которые поддерживают генерацию натяжения за счет актомиозина и сохранение prestress цитоскелета, то сходные скоординированные изменения в структурных элементах по всей клетке, в цитоплазме и ядре обусловливаются непосредственным переносом механических сил и не ассоциируют с событиями передачи химических сигналов28. Эти находки имеют также физиологическое значение, т.к. они ммогут объяснить, как митохондрии, которые расположены далеко от поверхности мембраны на цитоплазматических микротрубочках могут воспринимать и отвечать на механические воздействия, высвобождая реактивные виды кислорода и активируя сигнальные молекулы (такие как nuclear factor-kappaB (NF-κB) и vascular cell-adhesion molecule 1 ()), которые вносят вклад в воспаление и атеросклероз29.
Недавно развитые технологии позволяют картировать стресс в цитоплазме живых клеток29, 30, они подтверждают, что даже незначительные механические деформации поверхностных интегринов могут вызывать распространение силы на дальние расстояния, а стрессовые концентрации могут наблюдаться на расстоянии многих микрометров от места воздействия силы (Fig. 2a), включая места вблизи ядра и на противоположном полюсе клетки30, 31. Важно, что эти механические сигналы индуцируют быстрое (менее 300 ms) механохимические превращения, как это определяется по фокальной активации Src kinase в регионах цитоплазмы, которые удалены от места приложения сил (более 50 µm), также как и в локальных местах (Fig. 2b). Поразительно, что такие механические реакции в 40 раз быстрее, чем те, что индуцируются растворимым эпидермальным фактором роста32, как это предсказывается физическими моделями (Box 1; Fig. 2c). Более того, как перенос силы на длительное расстояние, так и удаленные механохимические превращения посредством Src могут быть ингибированы с помощью или разрушения актинового цитоскелета или с помощью рассеивания цитоскелетного предварительного натяжения29-32 (Fig. 2a). Удивительно, но механическая связь обнаруживается даже между разными хромосомами (Fig. 1c; ) и между митотическим веретеном, актиновыми микрофиламентами и поверхностными интегринами в делящихся клетках33; такая связь может вносить вклад в контроль ориентации клеточных делений, также как и в точность выравнивания хромосом.
Physical coupling in the cytoplasm
Исследования, рассмотренные выше, однозначно подтверждают существование распространения сил на длительное расстояние в живых клетках. Однако эти исследования в основном феноменологические, а молекулы. которые связывают клеточные адгезивные рецепторы с цитоскелетом и ядром, были идентифицированы лишь недавно. Трансмембранные интегрины связывают ECM с цитоскелетом за счет образования кластеров специализированных субмембранных закрепляющих комплексов (focal adhesions), в которых они формируют молекулярные мостики за счет связывания с актин-ассоциированными белками, такими как talin, vinculin, zyxin и paxillin34 (see the Review by Geiger, Spatz and Bershasky106 in this issue). Определенные субтипы интегринов (такие как α6β4 integrin) также соединяются непосредственно с промежуточными филаментами35. Cadherins соединяются с цитоскелетом путем формирования соединительных комплексов. которые содержат β-catenin и γ-catenin, которые соединяются с актиновыми филаментами и промежуточными филаментами, соотв. 36. Хотя и очень динамичные эти молекулярные связи (see below) достаточно стабильны, чтобы функционировать как натянутые жесткие провода, распространяющие механические стрессы от ECM к ядру.
The LINC complex. Ранние исследования показали, что промежуточные филаменты vimentin соединяются непосредственно с белком ядерной ламины lamin B и соединяют его с местами прикрепления на плазматической мембране ретикулоцитов37, 38. Недавно были идентифицированы специализированные закрепляющие ядро структуры на цитоскелетных филаментах, известные как LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton) комплекс, который содержит nesprins, sun и lamin белки39-41 (Fig. 3). в
Крупнейшие изоформы nesprins млекопитающих ( и ; известных также как SYNE1 и SYNE2) и родственный у Caenorhabditis elegans и у Drosophila melanogaster являются палочковидными белками ядерной мембраны, которые содержат на N-конце консервативный calponin-подобный actin-связывающий домен, огромный центральный spectrin-подобный домен, и С-терминальный (klarsicht, ANC-1, SYNE1 homology) домен, который обеспечивает связывания белка sun42. Nesprin 1 и nesprin 2 на наружной ядерной мембране соединяют актиновые микрофиламенты с SUN1 (также известным как ) и SUN2 (известным также как ) на внутренней ядерной мембране; SUN1, в свою очередь соединяется с lamin A на ядерном каркасе39-41, 43, 44. Более короткие изоформы nesprins располагаются на внутренней и наружной ядерных мембранах. Эти изоформы лишены актин-связывающего домена, но всё ещё могут взаимодействовать с компонентами цитоскелета посредством spectrin повторов. SUN1 также связывает эти закрепляющие структуры с nuclear pore complexes (NPCs) и, следовательно, может обеспечивать механическую связь, которая обнаруживается между натянутым цитоскелетом и ядерными порами45. Однако неизвестно связывается ли SUN1 с nesprin 1 и 2 и NPC одновременно46. Nesprin 3, самый маленький, но родственный член семейства, который лишен N-терминального актин-связывающего домена, соединяется с цитоплазматическими промежуточными филаментами путем связывания plectin 1 и взаимодействует с SUN1 и SUN2 (Refs 47, 48). ANC-1 сходным образом связывает ядра с актинровым цитоскелетом благодаря взаимодействиям с членоми семейства sun, UNC-84, а мутанты ANC-1 обнаруживают дефекты в расположении ядер и в закреплении ядер49. ZYG-12 и UNC-83, два др. белка, которые обладают общим с nesprins KASH доменом, соотв. обеспечивают связь центросом (а, следовательно, и микротубулярного цитоскелета) с ядрами и вносят вклад в позиционирование ядра у C. elegans за счет связывания UNC-84 (Refs 50, 51, 52). Т.о., hard-wire функция этих LINC белков, по-видимому, законсервирована в ходе эволюции.
Lamins. Ламины A, B и C являются промежуточными филамент-подобными белками, которые формируют молекулярную сеть или ядерную ламину на нуклеоплазматической стороне внутренней ядерной мембраны и обнаруживаются также во внутреннем ядерном каркасе. Ламины выполняют центральную роль в контроле ядерной организации и функции генов53. Эти ламины могут быть подразделены на две подгруппы: A-type ламины (lamin A и lamin C) и B-type ламины (lamin B). A- и B-типа ламины имеют разные скорости оборота в нуклеоплазме и благодаря этому выполняют разные структурные и функциональные роли53. Клетки, дефицитные по A-type ламинам обнаруживают пониженную жизнеспособность, пониженную экспрессию механочувствительных генов и измененную ядерную механику в ответ на механические деформации, тогда как дефекты в lamin B1 не вызывают подобных эффектов, это указывает на то, что A-type ламины могут выполнять более центральную роль в механотрансдукции54, 55.
Ламины могут соединяться с генетическим аппаратом и с ДНК как непосредственно, так и путем связывания др. ядерных белков, включая и lamin B receptor ()53, 56-58. Emerin, который соединяется с LINC комплексом посредством nesprins и lamins59, 60, ассоциирует также со многими др. регуляторными белками, и с BAF белком (также известным как ), который соединяется непосредственно с двунитчатой ДНК56, 61-63. LBR также соединяется со множественными внутриядерными мишенями. включая ДНК, гистоны и различные ассоциированные с хроматином белки64.
Other crucial connectors. Молекулярные соединения между nesprin, sun и lamin белками являются критическими для механической стабильности ядра и всей клетки, т.к. клетки с нарушенными nesprin 1, nesprin 2 или nesprin 3 функционально обнаруживают пониженную механическую жесткость65. Более того, растягивание клеток кардиальных мышц крыс приводило к изменениям в пространственной организации промежутоных филамент (desmin)-lamin сети и к изменениям хроматина на ядерной облочке66. и опять же это может иметь клиническое значение, т.к. мутации промежуточных филамент (такие как desmin и vimentin), которые механически связывают поверхностный адгезивные рецепторы с ядерными структурами посредством LINC комплекса, существенно меняют клеточные механические свойства, так же как и функцию клеток, тканей и органов67. Напротив, мутации lamins или emerin, обнаруживаются у пациентов с или с болезнью преждевременного старения прогерией, приводя к потере стабильности ядерной формы, аномалиям клеточных структур и в конечном итоге к гибели68. Эти результаты указывают на то, что физические соединения между филаментами цитоскелета и LINC комплексом делают возможной функцию всей клетки, цитоскелета и ядра, как единой механически объединенной системы (Fig. 3).
Некоторые белки, такие как lamins и , обнаруживаются во внутреннем ядерном каркасе или матриксе, который распространяется на глубину ядра и ориентирует большинство ядерных регуляторных аппаратов23, 69-71. Lamins также связывают ядерную изоформу 72, который может в принципе вносить вклад в ядернубю структуру, учитывая, что цитоплазматическая форма этого большого эластичного белка оказывает существенные эффекты на эластичность мышечных клеток73. Интересно, что actin иd myosin также, по-видимому, вносят вклад в ядерную структуру и ядерные функции, включая хромосомные движения и транскрипцию74-76. Emerin и BAF соединяют lamins с ядерным actin77, 78, а emerin преимущественно связывает полимеризованный актин и стимулирует его полимеризацию77, 78. Присутствие ядерного актина и миозина, и наблюдение, что интактная цитоскелетная и нуклеоскелетная сети, которые лишены мембран, физически контактируют in vitro после добавления АТФ28, это открывает возможность того, что актомиозиновые взаимодействия могут также вносить вклад в ядерный prestress и, следовательно, в регуляцию распространения и преобразования сил в ядре.
Геном сам по себе организован в петли (5-200 kb) и разбит на функциональные хромосомные территории благодаря связыванию ядерных matrix attachment regions (MARs), которые связывают ядерный каркас с разными регионами ДНК на базе их последовательностей и геометрии79. Транскрипционные и репликационные комплексы также могут помогать связи интерфазных хромосом с ядерным матриксом80, 81. Точный состав и структура ядерного матрикса неизвестны, хотя помимо lamins и matrin 3, он содержит РНК и гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины, которые связаны с процессингом мРНК79.
Геномная организация и состав ядерного матрикса изменяются в ответ на клеточную и тканевую дифференцировку и на многие средовые факторы82. Многие ядерные белки, которые первоначально были идентифицированы как ДНК регуляторные белки, могут также играть структурную роль в ядре. Напр., RUNX является белком как, модифицирующим структуру хроматина, так и критическим для дифференцировки остеобластов и ядерным каркасным белком. который связывает различные регионы хромосом, облегчая тем самым комбинаторный контроль транскрипции генов83-85. Т.о., силы, которые передаются посредством LINC комплексов и изборожденных ядерных каркасов могут фокусироваться непосредственно на критических ДНК регуляторных энзимах и факторах связывания (Fig. 3).
Nuclear mechanotransduction
Из-за индуцированных стрессами изменений в молекулярных форме, позиции или движениях (напр., вибрации) могут меняться термодинамические и кинетические свойства молекул под весовой нагрузкой19, силы, которые распространяются на ядро через дискретную цитоскелетную сеть, могут менять события молекулярной самосборки86 и модулировать биохимию ядра за счет многих возможных механизмов (Fig. 4). Напр., искривление ядерной мембраны, индуцируемое силами, которые распространяются от клеточной поверхности в распластанных клетках, стимулирует поступление кальция через ядерные ионные каналы и индуцирует транскрипцию ассоциированных генов87. А приток ионов через ядерные мембраны - как измерено с помощью patch clamp - может изменяться за счет модулирования актинового цитоскелета88. Хотя молекулярные качественные особенности механочувствительных ионных каналов ядерной мембраны неизвестны, но можно предсказать механизм, с помощью которого канал механически связан как с механочувствительным цитоскелетом, так и с ядерными каркасами, которые приблизительно в 9 раз жестче, чем цитоплазма живых клеток22. В этом сценарии тянущее действие на клетку может деформировать канал, создавая искажение канала по сравнению с каналами жестких ядерных прикреплений, где деформирован цитоскелет; такое изменение конформации каналов может способствовать притоку ионов.
Т.к. lamin A и emerin связывают транскрипционные факторы89, 90, и т.к. emerin кроме того взаимодействует с факторами сплайсинга63, то силы, передаваемые через LINC комплексы к этим молекулам могу также непосредственно менять генную экспрессию за счет секвестрации или модификации транскрипционных или сплайс факторов (Fig. 4a). Т.к. вновь синтезированные транскрипты подвергаются процессингу с помощью pre-mRNA splicing 5' capping и 3' processing аппарата91, то силы, которые переносятся на эти молекулы посредством MARs, могут также регулировать сплайсинг или процессинг мРНК92 (Fig. 4b). Напр., силы, передаваемые к нагруженным белкам, в ядерном каркасе могут в принципе регулировать активность генов в результате физического расправления их пептидной основы, это в свою очередь может способствовать связыванию или самосборке др. ядерных регуляторных факторов. Такая передача сил может действовать аналогично способу, при котором индуцируемые стрессами искажения цитоскелетного titin влияют на транслокацию в ядро MURF2 (также известного как ), который является лигандом трансактивационного домена serum response transcription factor SRF93. Кроме того, воздействие или натяжение ядерного каркаса может изменять организацию хроматина высшего порядка, ограничивая или способствуя тем самым доступности транскрипционных факторов или др. регуляторных факторов (таких как ДНК и РНК полимеразы, topoisomerases и helicases) к специфическим генным последовательностям, которые д. сходным образом влиять на генную транскрипцию84. в
Когда клетки расширяются и округляются, то ядерные поры физически расширяются и сужаются и меняют скорости своего транспорта. Когда это происходит, то ядерные поры могут обеспечивать механохимическое превращение и контроль генной активности94. Ядерные поры участвуют в контроле генов, которые привязаны к этим структурам, также участвуют в регуляции убиквитилирования гистона H2 и транспорте мРНК95. Концентрация стрессов на NPCs посредством передачи через LINC комплексы может, следовательно, как физически искажать (напр., расширять) размер пор (вообще-то посредством искажения корзинчатой структуры) и изменять транспорт мРНК, транскрипционную регуляцию и статус хроматина за счет деформации формы молекулярных компонентов пор и изменения их химической активности (Fig. 4c). Интересно, что ядерные искривления являются предварительным условием для вступления в S фазу во время хода клеточного цикла и было предположено, что это может быть обусловлено усилением транспорта крупных ДНК-регуляторных комплексов через ядерные поры96.
Интересно, что возможно силы передаются через ядерный каркас к остову ДНК, чтобы непосредственно влиять на функцию генов23. Многие MARs располагаются в регионах дестабилизированных ДНК, в которых механические напряжения могут приводить к отжигу (melting) двойных спиралей79. Индуцированный стрессом отжиг ДНК может воздействовать на места для транскрипционных регуляторов точно таким способом, который увеличивает напряжение при скручивании в промоторе гена , индуцируя отжиг far upstream binding elements (FUSE) и тем самым стимулирует связывание FBP (известного также как FUBP1) и FIR (известного также как PUF60) транскрипционных факторов97, 98 (Fig. 4d). Интересно, что тканевая специфичность геномной организации и состав ядерного матрикса указывают на то, что разные типы клеток могут быть запалом ('primed'), чтобы реагировать по-разному на одни и те же стимулы посредством дифференциально закрепленных генов на ядерном каркасе под действием груза и, следовательно, ключевыми регионами стрессовых концентраций в ядре (напр., как показано с помощью MARs).
Conclusions
It is now clear that mechanical action at a distance occurs in living cells22, 29-33. This is made possible by the propagation of forces and vibrational energy through transmembrane integrins and cadherins, associated focal adhesions and junctional complexes, and cytoskeletal filaments that connect to the nucleus, its internal nuclear scaffolds and linked chromatin. Mechanical action at a distance only occurs if the input energy is concentrated or channelled across discrete load-bearing cytoskeletal filaments, and the spatial distribution and efficiency of force propagation depends on differences in stiffness between these support elements (Box 1). It is for this reason that the fidelity and speed of this intracellular mechanical signalling response can be modulated by altering cytoskeletal prestress, which controls the stiffness of tensed cytoskeletal filaments, such as stress fibres15, 99 and intermediate filaments100, that span long distances in the cytoplasm. Forces that act on the nucleus might promote changes in the shape, folding or kinetics of specific load-bearing molecules or might modify higher-order chromatin organization, and thereby alter nuclear protein self-assembly, gene transcription, DNA replication or RNA processing - all of which are crucial for cell behaviour. This unique form of mechanical signalling provides a more rapid and efficient way to convey information over long distances in living cells than diffusion-based chemical signalling. It also helps to explain how mechanical forces simultaneously alter the activities of multiple molecules at various sites in the cytoplasm and nucleus, a response that is crucial for control of cell physiology and tissue development19.
Future work is needed to fully understand the molecular and biophysical basis for this direct form of nuclear mechanotransduction and to understand how these processes are integrated with chemical diffusion-based signalling mechanisms. This will require entirely new methods for probing and analysing structure-function responses in living cells, and will probably require integration of molecular cell biology methods with novel approaches from engineering, physics and nanotechnology.
