Пространственная организация мышц поддерживается за счет прикрепления контрактильного аппарата ко внеклеточному матриксу (ECM) на двух ассоциированных с сарколемой структурах: костамерах, которые находятся в одном регистре с саркомерными Z-дисками и мышечно-сухожильных соединениях, которое связывает концы миофибрилл со скелетом (Pardo et al.,[1983]; Schwander et al.,[2003]) (Fig. 1). Благодаря этому свойству закрепления сарколемные адгезивные образования (адгезии) представляют собой фокальный сайты для двунаправленной передачи внутренне генерируемых клетками и наружно прилагаемых сил. Напр., сокращения кардиомиоцитов взрослых крыс, помещенных на покрытый laminin силиконовый субстрат продуцируют складко-подобные морщинки на субстрате, который непосредственно находится под costameres (Danowski et al.,[1992]). Напротив растягивание за концы кардиомиоцитов вызывает немедленное и гомогенное увеличение длины саркомеров, указывая тем самым, что прикладываемое внешнее растяжение передается непосредственно подлежащему сократительному аппарату (Mansour et al.,[2004]).
Помимо своей роли в качестве передатчиков сил сарколемные адгезии инициируют сборку саркомеров. Образование саркомеров, видимое на эмбриональных кардиомиоцитах, демонстрирует, что предшественники саркомеров возникают вблизи клеточной мембраны в местах сарколемных адгезий (Rhee et al.,[1994]; Dabiri et al.,[1997]; Du et al.,[2008]). Более того, разрушение сарколемных адгезий приводит к потере организации поперечной исчерченности мышц, снижению сократимости или к клеточной гибели. Всё же регуляторные механизмы, с помощью которых сарколемные адгезии ведут к образованию саркомеров неясны.
FORCE AND SARCOLEMMAL ADHESION SITE ASSEMBLY
Давно известно, что сарколемные адгезии и саркомерные Z-диски являются фокальными точками передачи сил, но механизмы, с помощью которых силы передаются, не были известны до конца. Некоторые доказательства, однако, демонстрировали, что образование, рост и поддержание сарколемных адгезий зависит от механически сил, к ним прикладываемых (Sharp et al.,[1997]). В миоцитах крыс, напр., ингибирование сократительной активности блокатором кальциевых каналов nifedipine ведет к потере costameres, тогда как восстановление контрактильности инициирует вторичную сборку костамеров. Воздействие внешних сил также стимулирует сборку сарколемных адгезий и этот эффект не нуждается в котрактильной активности клеток: приложение однонаправленного статического напряжения во время интервала ареста сократимости оказывается достаточным, чтобы предупредить потерю костамеров из мембраны не сокращающихся культивируемых миоцитов (Sharp et al.,[1997]).
Способность сарколемных адгезий перестраиваться в ответ на локально прикладываемые силы и тем самым увеличивать силу взаимодействий между клетками и матриксом, может быть адаптивным поведением, обеспечиваемым с помощью механочувствительности (mechanosensing). Сарколемные адгезии обладают большим репертуаром мультимодулярных белков с сайтами адгезии интегринов в тканевой культуре, наз. фокальными адгезиями. Значительное количество integrin-ассоциированных компонентов может ощущать механические усилия, т.е. они реагируют на воздействие силы путем изменения своей ферментативной активности или расправлением части своей конфигурации, чтобы открыть скрытые сайты связывания, которые поддерживают самосборку фокальных адгезий (Bershadsky et al.,[2006]). Это строго указывает на то, что сходные механизмы приложимы и к сарколемным адгезиям.
Интимные взаимоотношения между силой и сборкой сарколемных адгезий, по-видимому, преимущественно используют интегриновые адгезивные комплексы. Интегрины являются пронизывающими один раз гетеродимерными трансмембранными рецепторами, состоящими из субъединиц, которые соединяют цитоскелет с внеклеточным матриксом. Поэтому интегрины хорошо подходят для передачи как внешне прилагаемых, так и клетками генерируемых сил поперек плазматической мембраны. Эта двунаправленная передача сил является критическим аспектом функции интегринов. Структурные исследования предоставили доказательства того, что интегрины реагируют на прикладываемую силу изменением своего конформационного состояния от неактивного к активному (Jin et al.,[2004]; Katsumi et al.,[2005]; Alon and Dustin,[2007]; Zhu et al.,[2008]). В своем спокойном состоянии перед контактом с внеклеточным матриксом интегриновые гетеромеры находятся в основном в неактивной конформации, при этом их внеклеточные регионы согнуты, а их очень короткие цитоплазматические домены удерживаются вместе за счет не ковалентных ионных связей. Ассоциация actin-связывающего белка talin с хвостом интегрина, которая запускает клеткой генерируемые латеральные тянущие (pulling) силы, прикладываемые к концу, это приводит к разрушению соединения и последующему отделению трансмембранных сегментов (Burridge et al.,[1997]; Zhu et al.,[2008]) (Fig. 2). Этого разъединения может оказаться достаточно, чтобы экспозировать модули, которые способствуют гомотипической олигомеризации активированных интегриновых субъединиц (Li et al.,[2003]). В соответствии с этим мнением интегрины вскоре после этого создания цитоскелетного натяжения в культивируемых миоцитах образуют кластеры (Sharp et al.,[1997]).
Рис.2. | Cartoon of integrin adhesion site assembly. Integrins exist in a range of conformations. A: The fully inactive bent conformation. B: The fully active extended conformation that can bind ECM ligands with high affinity. C: The clustered conformation arising from heterotypic or homotypic interactions. Signaling resulting in talin binding to the integrin tail, as well as lateral pulling forces from the actomyosin cytoskeleton induces the separation of transmembrane regions (B). The transmembrane perturbations unmask modules that promote the interaction of each integrin subunit with itself leading to integrin clustering or the interaction of the tail with cytoplasmic binding partners, ranging from adaptors that interact with actin-bound or integrin-bound components (vinculin, Wech) to signaling molecules (FAK, PKC, ILK) (C). Such molecular clustering contributes to the strengthening of cell-matrix connections.
Трансмембранные пертурбации также распространяются во внеклеточную область, продуцируя конформационные изменения от согнутого к более вытянутому положению, пригодному для связывания лиганда с высоким сродством (Liddington and Ginsberg,[2002]; Luo et al.,[2007]) (Fig. 2). Эта реакция может быть синергичной с образованием интегриновых кластеров, тем самым увеличивается общая сила связывания интегринов в окружающим матриксом. Кроме того, связи α5β1 интегрина с его ECM лигандом fibronectin подвергаются усилению натяжения после активации интегрина: контрактильность actomyosin или внешне прикладываемые силы понуждают эти интегрины задействовать вторичный сайт связывания в фибронектине (Friedland et al.,[2009]). Приложение силы не только приводит к более высокому сродству соединения α5β1 integrin с фибронектином, но и также к усилению внутриклеточной передачи сигналов (Friedland et al.,[2009]). Изменения в адгезивности интегринов коррелируют также с серией конформационных изменений в их лигандах. В культивируемых фибробластах внутриклеточные силы, передаваемые с помощью интегинов к внеклеточному матриксу, расправляют модули внутри фибронектина, это способствует его соединению с интегрином и самосборке в фибриллы (Baneyx et al.,[2002]). Поразительно, что сборка матрикса происходит в виде паттерна, соответствующего распределению собираемых в кластеры интегринов (Imanaka-Yoshida et al.,[1999]).
Разъединение интегриновых цитоплазматических хвостов может также демаскировать сайты связывания внутри цитоплазматических хвостов. Белки, рекрутируемые на эти сайты связывания, действуют как непосредственные линкеры между интегрином и актином или как энзимы, которые модифицируют адгезивные комплексы (Delon and Brown,[2007]) (Fig. 2). Интересно, что некоторые из этих адгезивных белков может расправлять сами себя в ответ на воздействие силы. Следовательно, эти молекулы действуют как механосенсоры, генерируя новые микроусловия связывания, которые в дальнейшем изменяют состав сайтов адгезии интегринов, рекрутируя больше белков (Bershadsky et al.,[2006]). Вычислительные исследования продемонстрировали, что силы индуцируют спиральные замены (helix swapping) палочковидного талина и тем самым экспозируют модули связывания для vinculin, др. адапторного белка, который соединяет talin с актиновым цитоскелетом (Hytonen and Vogel,[2008]) (Fig. 2). Экспозиция скрытых сайтов связывания vinculin в talin была непосредственно продемонстрирована с помощью механического растягивания одиночных talin палочек с помощью магнитных щипчиков. Это увеличивало количество доступных мест связывания vinculin с одного до трех по сравнению с нерастянутой палочкой talin (del Rio et al.,[2009]). Связывание vinculin с демаскированными сайтами талина раскрывает, свою очередь, упакованную и аутоингибированную конфигурацию vinculin (Johnson and Craig,[1994]). Сходным образом, применение силы к focal adhesion kinase (FAK), раннему сигнальному компоненту интегриновых адгезий, ремоделирует её focal adhesion-targeting домен, это является критическим для соединения с LIM доменовым белком paxillin (Kaazempur-Mofrad et al.,[2004]) (Fig. 2). FAK вместе с paxillin затем формирует остов для рекрутирования дальнейших белков адгезивного комплекса (Legate et al.,[2009]).
Помимо изменения связывающего сродства с их мишенями, силы могут модифицировать также ферментативную активность. Двенадцатый type I модуль фибронектина обладает изомеразной активностью, будучи расправленным (Langenbach and Sottile,[1999]). Индуцируемая силой активация киназ или фосфатаз может , в свою очередь, включать или выключать сложную сеть фосфорилирования и дефосфорилирования и тем самым запускать каскад сигналов (Bershadsky et al.,[2006]). Напр., в кардиомиоцитах крыс механические натяжения индуцируют фосфорилирование FAK (Kovacic-Milivojevic et al.,[2001]). Этот процесс делает возможным рекрутирование из Src семейства протеин тирозин киназы и последующую активацию обеих киназ (Schaller et al.,[1994]).
В попытке увязать имеющиеся данные в общую модель, стало ясно, что силы, инициируемые интегринами или субнабором integrin-ассоциированных механосенсоров распространяются по сарколемным адгезиям в форме новых молекулярных взаимодействий. Образование таких молекулярных кластеров приводит к экспансии адгезивных сайтов и тем самым к образованию передающих усилия соединений между клетками и матриксом. Поскольку эти события тесно связаны, то можно предположить, что сайты адгезии высоко чувствительны к пертурбациям. Функциональный анализ сарколемных адгезий в модельных организмах демонстрирует, что их разрушение вызывает неправильную сборку или корректно собранные, но ослабленные структуры, которые не могут противостоять обычной контрактильной активности. У Drosophila, прикрепление эмбриональных мышц к матриксу сухожилия сопровождается сильной комплементарной экспрессией двух интегринов, αPS1βPS and αPS2βPS, с αPS1 локализованным на концах эпидермальных клеток сухожилий и с αPS2, ограниченным мышечными концами (Bogaert et al.,[1987]; Leptin et al.,[1989]). Истощение или βPS or αPS2 integrin вызывает отсоединение актинового цитоскелета от матрикса сухожилия (Brown,[1994]). Более того, у мышей, истощенных по β1 integrin, рекрутирование vinculin и talin в сарколемные комплексы нарушено (Schwander et al.,[2003]).
Потеря talin, который является важным компонентом сарколемных адгезий, вызывает отсоединение саркомерного цитоскелета от мышычно-сухожильных соединений (Belkin et al.,[1986]; Imanaka-Yoshida et al.,[1999]; Brown et al.,[2002]). Сходные эффекты наблюдались также у мышей со специфическим для мышц отсутствием talin1 (Conti et al.,[2008]). В культуре ткани связывание домена головки talin с цитоплазматическим хвостом integrin необходимо для структурного переключения интегрина в более высокое состояние сродства для связывания лиганда (Wegener et al.,[2007]; Bouaouina et al.,[2008]) (Fig. 2). Этот эффект, по-видимому, законсервирован, т.к. у мух, несущих мутацию, при которой домен головки talin нарушает взаимодействие с integrin, интегрины отсоединяются частично от ECM с началом контрактильности (Tanentzapf and Brown,[2006]). Разрушение talin-integrin взаимодействия может также освобождать сарколемные адгезии от обычной реакции на силу. В самом деле, анализ изолированных мышц от talin1-дефицитных мышей демонстрирует, что они не могут должным образом генерировать и противостоять силами во время сокращений (Conti et al.,[2008]).
События разворачивания механосенсоров также обеспечивают взаимодействия с и ре-локализацию белков на сайты адгезии, которые лишены механосенсорных свойств. Имеется достаточно доказательств, что разрушение белков без механосенсорных способностей также глубоко влияет на целостность адегезивных структур. Напр., истощение LIM domain-содержащего белка PINCH, важного компонента мышечно-сухожильных соединений в эмбриональных мышцах Drosophila ведет к отсоединению актиновых филамент от сарколеммы (Clark et al.,[2003]). В клетках млекопитающих PINCH рекрутируется на фокальные адгезии как часть предварительно собранного белкового комплекса, состоящего из цитоскелетного адаптора Integrin-Linked Kinase (ILK) и actin-связывающего белка parvin (Zhang et al.,[2002]). Так, integrin-связывающий белок ILK служит для соединения этого цитоскелетного комплекса с сайтами адгезии интегрина (Hannigan et al.,[1996]). Это мнение было подтверждено на ILK-истощенных мышиных эмбрионах, у которых адгезивные белки и актиновый цитоскелет собираются в ансамбль неправильно на мышечно-суходильных соединениях (Gheyara et al.,[2007]). У эмбрионов рыбок данио мутация одиночного нуклеотида в ILK киназном домене достаточна, чтобы спровоцировать отсоединение сарколеммы от ECM (Postel et al.,[2008]). Вполне возможно, что ILK у рыбок данио обеспечивает усиление связи между клетками и матриксом с помощью фосфорилирования партнеров по связыванию. В самом деле, мутация. затрагивающая киназную активность ILK устраняет ILK-обеспечиваемое фосфорилирование parvin и коррелирует со снижением контрактильности сердечной мышцы у рыбок данио и человека (Yamaji et al.,[2004]; Bendig et al.,[2006]; Kno"ll et al.,[2007]).
В противоположность ILK у позвоночных, Drosophila ILK не соединяется непосредственно с integrin и не нуждается в активном киназном домене, т.к. kinase-dead версия ILK может полностью устранять мутантный фенотип (Zervas et al.,[2001]). Транслокация ILK на мышечно-сухожильное соединение также не нуждается в PINCH (Clark et al.,[2003]), это говорит о том. что д. действовать др. механизмы. Один из таких механизмов предоставляется мультидоменовым белком Wech, который взаимодействует с talin и ILK в мышечно-сухожильных соединениях эмбрионов Drosophila и в Z-дисках и костамерах мышц взрослых мышей (Lo"er et al.,[2008]). Интересно, что локализация Wech зависит от integrin и talin, но не ILK, это помещает его ниже talin и выше ILK. В самом деле, мухи, дефицитные по wech обнаруживают мышечные отсоединения, сходные по тяжести с talin нулевыми эмбрионами, но более тяжелые, чем у ilk мутантов. Следовательно, Wech представляет собой отсутствующую связь между talin и ILK/PINCH комплексом.
Благодаря этим находкам становится ясно, что целостность адгезивных структур не только нуждается в механосенсорах, но и также в специфическом созвездии ассоциированных белков. Следовательно, эти молекулы не могут больше рассматриваться как белки упаковки, которые представляют прочность структуре, но они скорее всего также играют роль в передаче механосенсорных сигналов удаленным сайтам адгезивного комплекса в форме новых взаимодействий.
THE Z-DISK AS A FOCAL POINT FOR FORCE PROPAGATION
Разрушение сарколемных адгезий не просто затрагивает адгезивную структуру, но и также затрудняет дифференцировку цитоархитектуры саркомер. К кардиомиоцитах новорожденных крыс блокирование активности интегринов путем добавления антител, направленных против их внеклеточных доменов, вызывает неправильное относительное расположение и разборку саркомер (Hilenski et al.,[1992]). У Drosophila, истощение βPS или αPS2 integrin предупреждает дальнейшее развитие саркомер в зрелую поперечную исчерченность (Bloor and Brown,[1998]). Сходным образом мышиные мышечные волокна, лишенные β1 integrin, лишены исчерченности или обладают рудиментарным паттерном исчерченности, указывая на то, что сборка цитоскелета инициируется, но не завершается или не поддерживается (Schwander et al.,[2003]).
Поэтому возникает вопрос, как сарколенмные адгезии управляют образованием саркомер. Исследования клеточных структур установили, что сборка саркомер является ступенчато-образной программой, которая инициируется на базальной поверхности сарколеммы, на которой предшественники саркомер закреплены до их перехода в зрелые поперечно исчерченные миофибриллы (Rhee et al.,[1994]; Dabiri et al.,[1997]; Carroll et al.,[2004]). Т.о., сарколемные адгезии, по-видимому, вносят вклад в образование саркомер, предоставляя основу для их сборки. С сарколемой ассоциированные предшественники саркомер являются α-actinin-богатыми элетрон-плотными телами, также известными как Z-телами, которые сначала соединены с или полимеризуют актиновые филаменты, а затем инкорпорируют немышечный myosin II. По ходу развития саркомер, Z тела сливаются вместе, формируя Z-диск, а мышечный миозин II замещает немышечный myosin II. Titin преимущественно выстраивает в ряды массивы актиновых и миозиновых филамент в продольной плоскости тем самым собираются саркомеры в свою зрелую длину (Du et al.,[2008]; Sparrow and Scho"ck,[2009]). Следовательно, образование саркомеров обнаруживает высоко динамичную серию перестроек, которые затрагивают связывание и диссоциацию многочисленных белков.
Рост количества компонентов Z-дисков, как было показано, ассоциирует или взаимодействует с сарколемной сетью (Fig. 1). α-Actinin, наиболее выдающийся компонент Z-дисков, первоначально появляется в виде небольших агрегатов на сарколемме во время сборки саркомеров (Lu et al.,[1992]; Dabiri et al.,[1997]). α-Actinin l/ быть рекрутирован на эти агрегаты за счет непосредственного взаимодействия с integrin и vinculin, или косвенно посредством Zasp (Otey et al.,[1990]; Bois et al.,[2005]; Kelly and Taylor,[2005]; Jani and Scho"ck,[2007]). Поскольку α-actinin соединяется и поперечно связывает актиновые филаменты in vitro (Otey and Carpen,[2004]), то такое взаимодействие может способствовать связи саркомерного цитоскелета с адгезивной решеткой. Однако некоторые доказательства указывают на то, что в Z-дисках поперечное связывание с помощью α-actinin актина нуждается в дополнительных факторах. Генетические исследования на Drosophila демонстрируют, что актиновые филаменты отсоединяются от Z-дисков в мышцах α-actinin нулевых мышц, но обладают нормальным расположением саркомеров (Fyrberg et al.,[1990],[1998]). Более того, обработка мышечных полосок очищенным calpain, который преимущественно деградирует материал Z-дисков, удаляет α-actinin из миофибрилл. Напротив, если calpain добавляется в α-actinin-actin cvtcm in vitro, то α-actinin не высвобождается и не происходит деградации ни actin, ни α-actinin (Goll et al.,[1991]).
Дополнительные белки, участвующие в α-actinin-actin взаимодействии в Z-дисках, могут или усиливать в общем-то слабое α-actinin-actin взаимодействие или помогать ограничивать такое взаимодействие Z-диском. Среди нескольких кандидатов, PDZ-LIM доменовые белки, представленые ALP и Enigma субсемействами, которые содержат один или три LIM доменов, соотв., были идентифицированы в качестве α-actinin связывающих партнеров (Xia et al.,[1997]; Pomies et al.,[1999]; Zhou et al.,[1999]; Pashmforoush et al.,[2001]; Klaavuniemi et al.,[2004]). Большинство членов этой группы ко-локлизуется с α-actinin в Z-дисках поперечно исчерченных и сердечных мышц и в интеркаляционных дисках кардиальных мышц. Взаимодействия PDZ-LIM доменовых белков с α-actinin обеспечивают прочную на разрыв целостность Z-диска, так мыши, лишенные Cypher, белка из семейства Enigma, обладают мышечными дефектами с разорванными Z-дисками и ранней постнатальной гибелью из-за дыхательной неспособности (Zhou et al.,[2001]). Привлекательная модель показывает, что их соединение с α-actinin может тонко управлять свойством поперчного связывания actin с помощью α-actinin и эта гипотеза подтверждается исследованиями, показавшими, что добавление ALP к α-actinin-actin смеси существенно улучшает их ко-седиментацию in vitro (Pashmforoush et al.,[2001]). Titin, чей N-конец соединяет Z-диск, также связывает α-actinin (Sorimachi et al.,[1997]; Gregorio et al.,[1998]). Это взаимодействие может объяснить варьирующую толщину Z-дисков за счет регуляции количества поперечных связей, обеспечиваемых α-actinin (Young et al.,[1998]). Учитывая их роль в усилении α-actinin поперечных связей актиновых филамент, а значит в усилении целостности Z-диска, эти белки в комбинации с α-actinin могут служить в качестве основы для интеграции саркомерного цитоскелета с сарколемной решеткой (Clark et al.,[2002]) (Fig. 1).
Интересно, что взаимодействие α-actinin-integrin на мембране также является критическим для передачи сил от сократительного аппарата к внеклеточному матриксу в гладкомышечных клетках (Zhang and Gunst,[2006]). Следовательно, возможно предположить, что Z-диск служит не только как пассивный физический соединитель, но и также предоставляет средство для передачи генерируемых клеткой и внешне прикладываемых сил к и от сарколемных адгезий. Это предположение в дальнейшем было подтверждено наблюдением, что Z-диск отвечает на экзогенные силы с помощью происходящих структурных деформаций (Dyachenko et al.,[2008]). Способность к передаче сил может быть объяснена большим количеством мультимодулярных белков с механосенсорными свойствами, базирующимся в Z-диске. Titin рассматривается как первый кандидат в механочувствительности саркомеров. Ранние модели предполагали, что индивидуальные titin immunoglobulin (Ig)-подобные домены вместе с др. доменами титина, которые располагаются между Z-disk и миозиновыми филаментами разворачиваются обратимо in vivo, чтобы обеспечить необходимое расширение во время растяжения саркомеров (Erickson,[1994]). Это наблюдение было подтверждено модельными исследованиями на изолированным миофибриллах, в которых пришли к выводу, что некоторые Ig домены титина могут разворачиваться в ответ на быстрое растяжение (Minajeva et al.,[2001]). Однако при физиологических условиях индивидуальные Ig домены остаются относительно стационарными у Z-диску, указывая на отсутствие разворачивания Ig домена (Trombitas et al.,[2003]; Linke,[2008]). Разворачивание индивидуальных Ig доменов может происходить как последнее прибежище после того как др. уникальные домены титина, такие как PEVK домен развернуты, чтобы предупредить необратимые повреждения мышечных клеток во время повышенного растягивания. У человека titin, при приложении механической силы к мышцам также освобождается от аутоингибирования титинового C-терминального киназного модуля, внедренного в саркомерный M-диск (Fig. 1). Это событие расправления ведет к связыванию титиновой киназы с АТФ и делает возможной последующее ауто-фосфорилирование и оброт субстрата (Puchner et al.,[2008]). Силы, воспринимаемые посредством киназного домена титина, по-видимому, вносят вклад в адаптацию мышц в ответ на изменения сил.
Хотя сегодня нет доказательств для силой-обусловленного конформационного переключения в Z-дисковой части титина, обширные исселедования демонстрируют, что поддерживает механочувствительность Z-диска путем содействия в расположении структурных и регуляторных белков, которые запускают нижестоящие эффекторные пути после механического растяжения (Linke,[2008]). N-конец титина связан посредством telethonin (T-cap) с MLP, который, как полагают является центральным в базирующейся на Z-disk механочувствительности (Kno"ll et al.,[2002]) (Fig. 1). Drosophila MLP семейство кодируется двумя генами, mlp60A и mlp84B, и их белковые продукты обнаруживаются как на периферии Z-дисков, так и в мышечно-сухожильных соединениях (Stronach et al.,[1996]; Clark et al.,[2007]). Интересно, что несмотря на свою раннюю локализацию деплеция Mlp84B приводит к поздним мышечным дефектам, обнаруживаемым непосредственно пред окукливанием. Однако начало и тяжесть фенотипов усиливается, когда активность Drosophila D-titin снижается на фоне mlp84B, указывая тем самым, что Mlp84B поддерживает саркомерную структурную целостность совместно с D-titin (Clark et al.,[2007]). В сердце Drosophila Mlp84B действует как сенсор стрессов, который если разрушен, вызывает удлинение диастолического интервала, аномалии сердечного ритма и снижение продолжительности жизни, при этом не обнаруживается очевидного структурного фенотипа (Mery et al.,[2008]). Сходным образом кардиомиоциты у новорожденных MLP нулевых мышей обнаруживают дефекты восприятия растяжения (Kno"ll et al.,[2002]). Это может быть обусловлено избирательной потерей T-cap из Z-дисков, т.к. прямые взаимодействия T-cap с MLP необходимы для стабилизации T-cap в Z-диске. MLP может, поэтому действовать совместно с T-Cap, чтобы должным образом закрепить сенсор растяжения titin в Z-диске (Kno"ll et al.,[2002]). MLP у позвоночных также инициирует регулируемую растяжением нижестоящую реакцию, гипертрофическую программу, которая ведет к увеличению количества саркомеров, скорее всего благодаря его способности транслоцироваться с Z-диска в ядро, где он ассоциирует с мышце-специфическими активаторами транскрипции (Arber et al.,[1994]; Kno"ll et al.,[2002]). Напротив, Drosophila Mlp(s) обнаруживают некоторую временную ядерную локализацию, но с непроверенной ядерной функцией, т.к. Mlp84B трансген, несущий nuclear export signal может полностью устранять гибель мутантных mlp84B куколок (Stronach et al.,[1996]; Clark et al.,[2007]).
Механизмы, которые лежат в основе приспособляемости к силам, также обеспечиваются с помощью сигнальных молекул, которые, после активации ассоциируют с группой белков. прикрепленных к Z-дискам, облегчая тем самым их взаимодействие с ближайшими субстратами и ограничивая клеточный сигнал специфическими клеточными компартментами (Pyle and Solaro,[2004]). Семейство protein kinase C (PKC) из serine/threonine kinases является важной связью механической стимуляции и передачи сигналов. У крыс с хирургически индуцированной кардиальной гипертрофией, PKC оказывается активированной и перераспределенной по нескольким клеточным компартментам (Gu and Bishop,[1994]). Одним из закрепленных белков активированной PKC является подсемейство Enigma из PDZ-LIM доменовых белков. Это молекулярное взаимодействие обеспечиваемое с помощью третьего LIM домена белков семейства Enigma является временным, чтобы гарантировать фосфорилирование соотв. мишеней in vivo (Kuroda et al.,[1996]; Zhou et al.,[1999]) (Fig. 1). Мутация в третьем LIM домене в Cypher вызывает дилятационную кардиомиопатию и увеличивает сродство Cypher к PKC по сравнению с белком дикого типа, демонстрируя важность рекрутирования PKC in vivo (Arimura et al.,[2004]). Помимо белков из семейства Enigma, др. с Z-диском ассоциированные белки были идентифицированы как потенциальные якоря для PKC. Actin связывает PKC при определенных специфических физиологических условиях и преимущественно закрепляет определенные активированные изоформы PKC (Prekeris et al.,[1996],[1998]). Кроме того, PKC-связывающий белок, который ко-локализуется с функциями Z-дисков, в качестве рецептора для активированной PKC-kinase (RACK) (Robia et al.,[2001],[2005]).
Предположение, что PKC участвует в регулируемых силой реакциях подтверждается экспериментами по тестированию влияния натяжения по одной оси на структуру и ремоделирование саркомеров. PKC управляет ремоделированием саркомеров путем инициации синтеза белков de novo, которые необходимы для восстановления длины саркомеров. В самом деле, ингибирование PKC с помощью ингибиторов, таких как staurosporine и chelerythrine chloride предупреждает восстановление длины саркомеров (Mansour et al.,[2004]). PKC-обеспечиваемая передача сигналов использует фосфорилирование ряда нижестоящих мишеней, включая саркомерные компоненты и транскрипционные факторы. В кардиомиоцитах, FAK, первичный медиатор передачи сигналов integrin, активируется посредством PKC-обеспечиваемого фосфорилирования (Heidkamp et al.,[2003]). Повышенная концентрация активированного FAK наблюдается также в Z-дисках, костамерах и ядрах после избыточной экспрессии PKC. Интересно, что силы также индуцируют FAK-зависимое фосфорилирование сигнального белка JNK также как и FAK-зависимую активацию мышце-специфического транскрипционного фактора MEF2 (Nadruz et al.,[2005]). Т.к. FAK является эффектором integrin, а также мишенью для PKC, то вполне возможно, что PKC обеспечивает перенос механических сил с интегринов всеми способами в ядро (Fig. 1).
Существенные доказательства подтверждают концепцию, что PKCs действует изоформ-зависимым образом. Изоформы PKC позвоночных подразделены на три подгруппы: конвенционные PKCs α, βI, βII, и γ ; новые PKCs δ, ε, η и Θ, которые нуждаются в диаглицероле, но не в Са2+ для активации и атипические PKCs ζ и Τ и протеин киназа N, которые зависят от phosphatidylinositol trisphosphate, но не затрагиваются diacylglycerol и форболовыми эфирами (Steinberg,[2008]). Огромный репертуар PKC изоформ, следовательно, гарантирует разнообразие активации во времени, субклеточной локализации и амплитуды экспрессии PKCs, это д. приводить к эффективной активации множественных из разнообразных PKC мишеней. Исследование экстрактов из плодных, неонатальных и взрослых вентрикулярных миоцитов со специфическими антителами к PKC изоформам показало, что онтогенетическое снижение PKC-ζ предшествует падению PKC-α и PKC-δ , указывая тем самым, что экспрессия PKC изоформ тонко контролируется во время развития (Rybin and Steinberg,[1994]). В аортальных гладкомышечных клетках механические деформации вызывают быструю транслокацию PKC-α и PKC-ζ изоформ из цитозольной в мембран/цитоскелетную фракцию, где они скорее всего инициируют передачу сигналов, вызывая активацию транскрипции (Han et al.,[2001]). Наконец, кардиальная гипертрофия индуцируемая растяжением, активирует специфические PKC изоформы, которые регулируют Rho GTPases и MAP kinases (Pan et al.,[2005]). Индуцируемая растяжением активация PKC-α в кардиомиоцитах новорожденных крыс активирует RhoA и ведет к фосфорилированию Rho-guanine nucleotide dissociation ингибитора, тогда как PKC-δ активация индуцирует Rac1. Более того, вызываемая растяжением реорганизация миофибрилл блокируется за счет экспрессии доминантно негативной PKC-α и -δ, подтверждая, что обе изоформы необходимы для вызываемой натяжением гипертрофии (Pan et al.,[2005]). Кардиальная дифференцировка и гипертрофия использует организацию актиновых фибрилл в миофибриллы. В кардиомиоцитах, активация промотора скелетного α-actin нуждается в RhoA GTPase. Более того. образование кластеров из β1 integrin с anti-β1 integrin антителами усиливает синергичную RhoA активацию промотора α-actin в присутствии FAK (Wei et al.,[2000]). Итак, эти исследования подчеркивают роль Rho GTPase в регуляции организации кардиального цитоскелетного нижестоящего integrin и возможно в PKC связи этой серии событий. Т.к. многие из молекул, функционирующие выше или ниже разнообразных PKC изоформ всё ещё нуждаются в характеристике, PKCs безусловно занимают жизненно важную позицию в ощущении силовых воздействий и в сигнальной трансдукции от integrins до окончательного ремоделирования саркомер.
CONCLUSIONS
In this review, we have summarized some of the experimental evidence that supports a model of muscle development in response to mechanical stimulation. The mechanisms underlying force-dependent remodeling and growth of sarcolemmal adhesions involve a series of conformational switches within a subset of mechanosensors including integrin that lead to generation of new binding microenvironments, and thereby formation of new interactions. Such events appear to not only increase the size of the adhesion site but also to transmit mechanical signals to distant locations such as the nucleus. We believe that the information flow from sarcolemmal adhesions to the Z-disk through mechanosensors results in remodeling of sarcomeres (Fig. 1). While there is now ample and sometimes excellent evidence for mechanosensing in muscle development and maintenance as in the case of titin kinase, future research will have to outline the precise targets and downstream consequences of mechanically activated proteins.
Сайт создан в системе
uCoz
Frieder Scho"ck