Посещений:
МАЛЫЕ РНК

БИОГЕНЕЗ

Biogenesis of small RNAs in animals
V. Narry Kim, Jinju Han & Mikiko C. Siomi
Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, 126-139 (February 2009) | doi:10.1038/nrm2632

Small RNAs of 20–30 nucleotides can target both chromatin and transcripts, and thereby keep both the genome and the transcriptome under extensive surveillance. Recent progress in high-throughput sequencing has uncovered an astounding landscape of small RNAs in eukaryotic cells. Various small RNAs of distinctive characteristics have been found and can be classified into three classes based on their biogenesis mechanism and the type of Argonaute protein that they are associated with: microRNAs (miRNAs), endogenous small interfering RNAs (endo-siRNAs or esiRNAs) and Piwi-interacting RNAs (piRNAs). This Review summarizes our current knowledge of how these intriguing molecules are generated in animal cells.


Рис.1.  |  Genomic location and gene structure of miRNAs.


Рис.2.  |  miRNA biogenesis pathway


Рис.3.  |  piRNA biogenesis pathway


Рис.3.  |  Exo- and endo-siRNA biogenesis pathway.


Box 1  |  Argonaute proteins and their associated small RNAs


Box 2  |  RNase III proteins and their mechanism of action

Табл.1 Types of small RNA-associated Argonaute proteins, and the origin and mechanism of action of small RNAs



DATABASES



  • The miRNA registry


    • >

  • let-7
  • lin-4
  • miR-1
  • miR-7
  • miR-29b
  • miR-31
  • miR-34
  • miR-105
  • miR-128
  • miR-133
  • miR-138
  • miR-142
  • miR-143
  • miR-145
  • miR-151
  • miR-200
  • miR-203
  • pri-miR-18
    • Entrez-Gene

  • flamenco


    • UniProtKB

  • Drosha
  • DGCR8
  • XRN2
  • EXP5
  • Dicer 1
  • Dicer 2
  • LOQS
  • TRBP
  • PACT
  • AGO1
  • R2D2
  • AGO2
  • AGO3
  • AGO4
  • ALG-1
  • RDE-1
  • myogenin
  • MYOD1
  • p53
  • MYC
  • LIN28
  • ERI1
  • ZEB1
  • ZEB2
  • PIWI
  • AUB
  • MIWI
  • MILI
  • MIWI2
  • Ziwi
  • Zili


    • FURTHER INFORMATION

  • V. Narry Kim's homepage
  • Mikiko C. Siomi's homepage
  • miRNA database




    • Halic, M. & Moazed, D.
    Dicer-independent primal RNAs trigger RNAi and heterochromatin formation.
    Cell 140, 504–516 (2010)
    Article


    Пути RNA interference (RNAi) обеспечивают генное молчание за счет ингибирования трансляции или деградации РНК и также действуют на уровне ДНК, репрессируя активность транспозонов и способствуя сборке гетерохроматина. Однако биогенез small interfering RNAs (siRNAs), который управляет образование гетерохроматина, сам по себе зависит от факторов, ассоциированных с гетерохроматином. Так что же первично? Halic and Moazed показали, что самостоятельный класс малых РНК, названный primal small RNAs (priRNAs), инициирует амплификацию siRNAs в отсутствие гетерохроматина, это в свою очередь индуцирует образование гетерохроматина.
    Авт. использовали Schizosaccharomyces pombe в качестве модели для исследования RNAi взаимодействий гетерохроматина в перицентромерных регионах, которые содержат dg и dh повторяющиеся элементы. Стержневые компоненты аппарата RNAi это Argonaute 1 (Ago1), RNA-dependent RNA polymerase 1 (Rdp1) и Dicer 1 (Dcr1). Dcr1 превращает двунитчатую double-stranded RNA (dsRNA) в siRNAs, которые загружаются на Ago1 наводят RNA-induced transcriptional silencing (RITS) комплекс на последовательности мишени посредством взаимодействия siRNAs в Ago1 с синтезируемыми РНК. Комплекс RITS ассоциирует с хроматином путем связывания метилированных по гистону H3 Lys9 (H3K9) нуклеосом и рекрутирования H3K9 methyltransferase Clr4 и heterochromatin protein 1 гомолога Swi6. Сигнал к молчанию амплифицируется за счет действия Rdp1 на транскрипты, связанные с гетерохроматином, и процессинга возникающих dsRNA в siRNAs.
    Halic and Moazed установили, что в Clr4-дефицитных мутантных линиях, которые лишены гетерохроматина, уровни siRNA сильно редуцированы, но Ago1 тем не мене не способен связывать малые РНК. Сходным образом, низкие уровни связанных с Ago1 малых РНК присутствуют у истощенных по Dcr1 и Rdp1 клеток. Эксперименты по высокопроизводительному секвенированию показали, что многие из этих малых РНК происходят из dg и dh повторов, тем самым показав, что гетерохроматин, Dcr1 и Rdp1 не нужны для инициального накопления малых РНК - которые были названы priRNAs - на этих сайтах мишенях с повторами.
    Гетерохроматиновые мутанты с функциональными Dcr1 и Rdp1 накапливали высокие уровни с dg повторами siRNAs. Эта амплификация нуждается РНК расщепляющей активности Ago1, указывая тем самым, что Ago-зависимый путь ведет к амплификации siRNA без необходимости в пред-существующем гетерохроматине и что priRNAs могут функционировать как инициальный триггер для амплификации siRNA.
    Авт. также установили, что Ago1 способствует низким уровням метилирования H3K9 в центромерной ДНК в отсутствие амплификации siRNA. Эта функция зависит от способности Ago1 связывать priRNAs, указывая тем самым, что priRNAs также запускают сборку гетерохроматина.
    Тот факт, что priRNAs обогащены на 3' концах аннотированных транскриптов и зависят от частично функциональных экзосом указывает на то, что priRNAs могут возникать в результате событий процессинга РНК, ассоциированных с окончанием транскрипции и что они являются продуктами деградации однонитчатых транскриптов, которые связывают Ago1.
    Это исследование выявило новый класс Dicer-независимых малых РНК, которые функционируют Ago-зависимым способом, чтобы запустить амплификацию siRNA и образование гетерохроматина. Авт. полагают, что priRNAs могут ассоциировать случайно с Ago1 и функционировать как механизм надзора за изобилующими транскриптами. Однако детальные механизмы биогенеза priRNA и регулируется ли этот процесс, ещё предстоит определить.
    Первая малая РНК, lin-4, была открыта в 1993 при генетическом скрининге у нематоды1, 2. Количество известных малых РНК с тех пор выросло значительно3-5. Недавняя разработка технологии глубокого секвенирования (deep-sequencing) 6, 7 и метод компьютерного предсказания8-11 ускорили открытие менее многочисленных малых РНК. Функции малых РНК колеблются от формирования heterochromatinдо дестабилизации мРНК и трансляционного контроля12, 13. Малые РНК участвуют почти в каждом биологическом процессе, включая определение времени развития, клеточную дифференцировку, клеточную пролиферацию, клеточную гибель, метаболический контроль , молчание транспозонов и антивирусную защиту.
    'Small RNA' довольно произвольный термин, т.к. он был первоначально использован для др. не кодирующих РНК, таких как small nuclear RNAs (snRNAs) и transfer RNAs (tRNAs). Бактериальные короткие регуляторные РНК также обозначались как малые РНК, но они не родственны малым РНК эукариот. Что отличает и определяет малые РНК эукариот - это их ограниченные размеры (~20-30 nucleotides (nt)) и их ассоциация с белками семейства Argonaute (Ago) (Box 1; Table 1). Семейство Ago может быть сгруппирована в два clades: подсемейство Ago и подсемейство Piwi. По крайней мере, три класса малых РНК кодируется нашим геномом, исходя из механизма их биогенеза и типа белка Ago, который ассоциируется с: microRNAs (miRNAs), endogenous small interfering RNAs (endo-siRNAs или esiRNAs) и Piwi-interacting RNAs (piRNAs). Необходимо отметить однако, что недавние открытия многочисленных не-канонических малых РНК размывает границы между классами.
    Наиболее изученными среди трех классов являются miRNAs, возникающие из локальных шпилечных структур под действием двух RNase III-типа белков, Drosha и Dicer (Box 2). Зрелые miRNAs ~22 nt затем связываются белками подсемейства Ago. miRNAs находят мРНК и поэтому функционируют как пост-транскрипционые регуляторы. Самый длинный из трех классов, piRNAs (24-31 nt в длину) ассоциирует с белками подсемейства Piwi. Интересно. что биогенез piRNAs не зависит от Dicer14. piRNAs очень многочисленны в зародышевых клетках и, по крайней мере, некоторые из них участвуют в замалчивании транспозонов посредством формирования гетерохроматина или дестабилизации РНК. endo-siRNAs были изучены в основном у Drosophila melanogaster, хотя они обнаружены в ооцитах мышей и embryonic stem (ES) клетках15-17. Несмотря на их сходство с miRNAs в терминах их ассоциации с белками подсемейства Ago, endo-siRNAs отличаются от miRNAs тем что они возникают из длинных двунитчатых РНК (dsRNAs) и зависят только от Dicer, но не от Drosha18-20. Они также слегка короче (~21 nt), чем miRNAs. По крайней мере. некоторые из endo-siRNAs, как было установлено, действуют как пост-транскрипционные регуляторы, которые нацелены на РНК.

    microRNA biogenesis


    miRNAs являются однонитчатыми РНК (ssRNAs) ~22 nt в длину, которые генерируются из эндогенных в форме шпильки транскриптов25. miRNAs действуют в качестве ведущих молекул в пост-траскрипционной регуляции генов путем спаривания оснований с мРНК мишенью, обычно в 3' untranslated region (UTR). Соединение miRNA с мРНК мишенью обычно ведет к репрессии транскрипции и экзонуклеолитическому распаду мРНК, хотя высоко комплементарные мишени могут расщепляться эндонуклеолитически. Др. типы регуляции, такие как активация трансляции13 и образование гетерохроматина26, также были описаны. Свыше трети генов человека, как полагают, являются непосредственными мишенями miRNAs. Следовательно, уникальная комбинация miRNAs в каждом типе клеток предетерминирует использование тысяч мРНК.
    miRNA genes and their transcription. В настоящее время miRNA database содержит 154 miRNAs Caenorhabditis elegans, 152 D. melanogaster, 337 Danio rerio (рыбки данио), 475 Gallus gallus (куры), 695 человека и 187 Arabidopsis thaliana. miRNAs присутствуют даже у простейших одноклеточных организмов, таких как poriferans (губки) и cnidarians (starlet sea anemone)27. Многие из miRNAs у bilaterian животных филогенетически законсервированы; ~55% C. elegans miRNAs имеют гомологов у человека, это указывает на то, что miRNAs выполняют важную роль в ходе эволюции животных28. miRNAs животных, по-видимому, участвуют отдельно от таковых у растений, т.к. их последовательности, структура предшественников и механизмы биогенеза отличаются от таковых у растений29, 30.
    Большинство генов miRNA у млекопитающих имеет множественные изоформы (paralogues) которые, по-видимому, являются результатом генных дупликаций. Напр., геном человека содержит 12 локусов для let-7-семейства miRNAs. Паралоги часто обладают идентичными последовательностями в положении нуклеотидов 2-7 относительно 5' конца miRNA. Т.к. эти 6 нуклеотидов (наз. seed) являются критическим и для спаривания оснований с мРНК мишенью, паралоги, как полагают, действуют перекрывая др. др. Однако , т.к. 3' последовательности miRNAs также вносят вклад в соединение с мишенью и так как паттерны экспрессии этих сестринских miRNAs часто различны, то члены одного и того же seed семейства могут выполнять разные роли in vivo31.
    Приблизительно 50% miRNA локусов у млекопитающих обнаруживается в тесной близи с др. miRNAs. Эти собранные в кластеры miRNAs транскрибируются с одиночной polycistronic transcription unit (TU)32, ъотя могут быть исключительные случаи, при которых индивидуальные miRNAs происходят с отдельных генных промоторов. Некоторые miRNAs генерируются с не кодирующих TUs, тогда как др. кодируются с белок кодирующих TUs (Fig. 1). Приблизительно 40% локусов miRNA расположено в интронных регионах не кодирующих транскриптов, в то время как приблизительно 10% находятся в экзонных областях не кодирующих TUs. miRNAs в белок-кодирующих TUs обычно обнаруживаются в интронных регионах, это соответствует приблизительно 40% всех miRNA локусов. Некоторые 'смешанные' miRNA гены могут содержать или интронные или экзонные miRNA группы в зависимости от паттерна альтернативного сплайсинга.
    Транскрипция большинства miRNA генов обеспечивается с помощью RNA polymerase II (Pol II)33, 34, хотя минорная группа miRNAs, которая ассоциирует с Alu повторами, может быть траскрибирована с помощью Pol III35. Ряд Pol II-ассоциированных транскрипционных факторов контролирует транскрипцию генов miRNA36. Т.о., Pol II- зависимая транскрипция позволяет miRNA генам продуманно регулироваться в специфических условиях и типах клеток.
    Nuclear processing by Drosha. Первичные транскрипты (pri-miRNAs), которые генерируются с помощью Pol II, обычно длиной в несколько kilobases и содержат локальные stem-loop structures (Fig. 2a). Первым шагом созревания miRNA является отщепление изначальной (stem) шпилечной структуры, в результате высвобождается небольшая шпилька. которая наз. pre-miRNA32. Эта реакция происходит в ядре с помощью ядерного RNase III-типа белка Drosha37. Drosha нуждается в кофакторе, the DiGeorge syndrome critical region gene 8 (DGCR8) белке у людей (Pasha у D. melanogasterи C. elegans)38-41. Вместе с DGCR8 (или Pasha), Drosha формирует большой комплекс, известный как Microprocessor комплекс. который приблизительно в 500 kDa у D. melanogaster39 и приблизительно в 650 kDa у человека38, 40. Мышиные ES клетки, которые дефицитны по гену Dgcr8, неспособны продуцировать miRNAs и это проявляется дефектами пролиферации и дифференцировки, тем самым подтверждается важная роль DGCR8 в пути miRNA и важность miRNAs в функции ES клеток42. Drosha и DGCR8 законсервированы только у животных43-45.
    Как Microprocessor распознает свои субстраты? Типичная pri-miRNA метазоа состоит из ствола приблизительно в 33 base pairs (bp), терминальной петли и фланкирующих ssRNA сегментов. DGCR8 взаимодействует с pri-miRNAs посредством ssRNA сегментов и ствола приблизительно в 33 bp, и ассистирует Drosha в отщеплении субстрата приблизительно на расстоянии 11 bp от ssRNA-dsRNA соединения46, 47.
    Недавние исследования показали,что процессинг pri-miRNA может сопровождать процесс транскрипции48-50. Инициальная модель базируется на находке, что Drosha процессинг интронной miRNA предшествует сплайсингу интрона хозяина48 (Fig. 2b). Интересно, что расщепление интрона с помощью Drosha не нарушает сплайсинга48. Это согласуется с предыдущей 'exon-tethering' моделью51, которая указывает на то, что экзоны Pol II транскриптов ко-транскрипционно собираются на spliceosome. Т.о., Drosha процессинг может происходить после того, как транскрипт соединяется с с предназначенным для сплайсинга комплексом ( известным также как ранний spliceosome комплекс), но до эксцизии интрона. Т.о., разрезание и сплайсинг могут быть высоко скоординированы с ко-ттранскрипционным процессом. Подтверждает это то, что pri-miRNA и Drosha локализуются в сайте траскрипции50 и pri-miRNAs концентрируются в ассоциированной с хроматином ядерной фракции49, 50. Иммунопреципитация хроматина и ядерный run-on assays предоставили дальнейшие доказательства, что процессинг pri-miRNA является ко-транскрипционным процессом49, 50. Ядерные экзосомы (которые представлены 3' →5' exonucleases) и XRN2 ( 5'→ 3' exonuclease) также ассоциируют с интронной miRNA шпилечной областью и способствуют деградации фрагментов49, 50.
    Когда miRNA шпилька располагается в экзонной области, то Drosha процессинг может дестабилизировать транскрипт и снижать белковый синтез с него52. Недавно было показано, что Drosha может расщеплять не только pri-miRNAs, но и также мРНК, которая содержит длинные шпильки52. Drosha негативно регулирует свой собственный кофактор, DGCR8, путем расщепления шпилек во втором экзоне DGCR8 мРНК52. Было интересно установить, насколько распространен такого типа контроль стабильности мРНК.
    Помимо канонических интронных miRNAs, небольшие группы miRNA-подобных РНК были открыты в интронах мух и млекопитающих53-55. Эти малые РНК вставлены в короткие интроны и их биогенез не нуждается в Drosha процессинге (Fig. 2c). После завершения сплайсинга высвобождается точка ветвления лассо-подобного интрона и debranched интрон формирует шпилечную структуру, которая напоминает pre-miRNA. Некоторые предшественники (mirtrons) содержат увеличенные хвосты на своем 5' или 3' конце, которые, по-видимому, нуждаются в экзонуклеолитической обрезке, чтобы стать субстратом для экспорта в ядро (Fig. 2c). Малые РНК, которые происходит из др. не кодирующих РНК, таких как tRNA17 или small nucleolar RNA (snoRNA)56, также были описаны. Становится ясно, что множественные неканонические пути могут направлять pre-miRNAs на путь miRNA посредством Drosha-независимых процессов.
    Nuclear export by exportin 5. После ядерного процессинга, pre-miRNAs экспортируются в цитоплазму57. Экспорт pre-miRNAs обеспечивается exportin 5 (EXP5), который является членом семейства рецепторов ядерного транспорта 58-60. Хотя EXP5 был первоначально известен как минорный экспортный фактор для tRNAs61, 62, основным грузом для EXP5 являются pre-miRNAs58-60. Как и в случае др. рецепторов ядерного транспорта, EXP5 соединяется кооперативно со своим грузом и с GTP-связанной формой кофактора Ran в ядре, и освобождается от груза вследствие гидролиза GTP в цитоплазме. EXP5 распознает более 14-bp dsRNA ствола вместе с коротким 3' довеском (1-8 nt)58, 63-65.
    Cytoplasmic processing by Dicer. После экспорта из ядра pre-miRNAs расщепляется рядом с терминальной петлей с помощью Dicer, высвобождая приблизительно 22-nt miRNA legktrc66-70 (Fig. 2a). Т.о., Drosha предопределяет зрелые miRNA последовательности путем генерации одного из концов зрелой miRNA, тогда как др. конец создается с помощью Dicer, который отмеряет приблизительно 22 nt от предсуществующего конца pre-miRNA (Box 2). Dicer высоко консервативный белок, который обнаруживается почти во всех эукариотических организмах, включая Schizosaccharomyces pombe, растения и животных. Некоторые организмы содержат множественные Dicer гомологи, при этом разные изотипы Dicer выполняют разные роли71, 72. Напр., D. melanogaster Dicer 1 необходим для биогенеза miRNA тогда как Dicer 2 участвует в продукции siRNA71.
    Dicer associates with dsRNA-binding proteins. D. melanogaster Dicer 1 нуждается в Loquacious (LOQS; также известном как R3D1), который содержит три dsRNA-связывающих домена (dsRBDs) для процессинга pre-miRNA73-75. Dicer человека взаимодействует с двумя близко родственными белками, TRBP (TAR RNA-binding protein; также известным как TARBP2)76, 77 и PACT (также известным как PRKRA)78. Хотя ни TRBP, ни PACT не нужны для processing активности себя, они, по-видимому, вносят вклад в формирование to contribute to formation of the RNA-induced silencing complex (RISC; see below)76-78. Детальные биохимические роли этих белков ещё предстоит определить. Более ранние исследования сообщали, что TRBP действует как негативный регулятор dsRNA-dependent protein kinase (PKR; также известной как EIF2AK2), тогда как PACT стимулирует PKR79. Сегодня остается неясным, имеется ли какая-нибудь функциональная взаимосвязь между путем miRNA и передачей сигналов PKR.
    Argonaute loading. После Dicer расщепления возникающий в результате 22-nt РНК дуплекс загружается на белок Ago, тем самым создается эффекторный комплекс, RISC. Одна нить приблизительно в 22-nt РНК дуплекса остается в Ago как зрелая miRNA (ведущая нить или miRNA), тогда как др. нить (пассажирская нить или miRNA*) деградирует. Исследования дуплексов siRNA показали, что относительная термодинамическая стабильность двух концов дуплекса предопределяет, какая нить будет отобрана80-82. Нить с относительно нестабильными парами оснований на 5' конце обычно выживает (напр., GU пара по сравнению с GC парой)81, 82. Изучение профилей термодинамической стабильности у предшественников miRNA precursors подтвердило, что одно и то же правило может быть приложено к большинству, хотя не ко всем, miRNAs46, 82. Т.к. выбор нити часто не является строгим процессом, то некоторые шпильки продуцируют miRNAs с обеих нитей со сравнимыми частотами.
    Dicer, TRBP (and/or PACT) и Ago белки внсят вклад в сборку RISC путем образования RISC loading complex (RLC) у людей (в то время как у мух RLC представлен Dicer 1, LOQS и AGO1)76, 83-86. Хотя пока неизвестно, как RLC соединяется с РНК и облегчает загрузку Ago, доказательства указывают на то, что дуплекс miRNA освобождается от Dicer после отщепления и что стабильный конец РНК дуплекса соединяется с TRBP в RLC, в то время как др. конец взаимодействует с белком Ago86, 87 Детали механики выбора нити и сборки RISC наиболее очевидны на синтеничных дуплексах РНК в экстрактах D. melanogaster86, 88. R2D2, белок с двумя dsRBDs, ощущает термодинамическую разнородность. R2D2 формирует стабильный гетеродимерный комплекс с Dicer 2, связывая наиболее стабильный конец дуплекса РНК, и ориентирует AGO2, на РНК дуплексе, было показано, что эндонуклеолитическая ферментативная активность (активность разрезания) белка Ago ответственна за удаление нити пассажира дуплекса siRNA и некоторых дуплексов miRNA89-92. Однако большинство дуплексов miRNA (а отличие от дуплексов siRNA) содержит несовпадение в середине и некоторые Ago белки (напр., AGO1, AGO3 и AGO4 у людей; также известные как EIF2C1, EIF2C3 и EIF2C4, соотв.) лишены режущей активности, это предупреждает отщепление пассажирской нити. Активность RNA helicase, как полагают, обеспечивает раскручивание и удаление неотобранной нити дуплекса miRNA.
    Т.к имеется несколько разных Ago белков в клетке, то малые РНК имеют множественный выбор Ago белков во время сборки RISC. У D. melanogaster, основной фактор, который детерминирует сортировку мылыми РНК , это структура предшественника93, 94. miRNA дуплексы с центральным несовпадением преимущественно отсортировываются на AGO1, тогда как в точности совпадающие дуплексы siRNA инкорпорируются в AGO2. Сходный механизм сортировки действует у C. elegans, у которых Ago-подобные белки ALG-1 и RDE-1 ассоциируют с малыми РНК из предшественников с несовпадениями и с точно совпадающими dsRNA предшественниками, соотв.95. Комплекс Dicer 2-R2D2 , по-видимому, функционируют как шлюз (gatekeeper) у D. melanogaster в пользу точно совпадающих siRNA дуплексов и отфильтровывает miRNA дуплексы с несовпадениями, хотя молекулярный механизм этого до конца непонят. У людей все 4 Ago белка, AGO1-4, соединяются с miRNAs лишь с маргинальными отличиями в репертуаре miRNA96-98, это указывает на то, что AGO1-4 человека могут е обладать достоверно дифференцированными функциями. в
    Концы miRNAs часто гетерогенны благодаря добавлениям или делециям 1-2 nt98, 99. Изменчивость последовательностей обнаруживается и на 5' и на 3' концах. хотя 3' обнаруживают тенденцию к большей изменчивости, чем 5' концы. Механизмы изменчивости 5' концов неизвестны, но она может быть объяснена неточным или альтернативным процессингом RNase III. Изменения на 5' конце приводят к сдвигу seed последовательности (2-7 nt от 5' конца), это может изменить специфичность к мишени у miRNA. 3' часто содержит нематричные (untemplated) нуклеотиды (в основном uracil и adenine), которые д. добавляться после процессинга с помощью неизвестных терминальных uridyl/adenyl transferases. Делеции нуклеотидов на 5'- и 3'-конце также часто наблюдаются, это, по-видимому, обусловлено экзонуклеолитическими активностями.

    Regulation of miRNA biogenesis


    Исследования профилей экспрессии показали, что большинство miRNAs находится под контролем передачи онтогенетических и/или тканеспециффических сигналов100. Точный контроль уровней miRNA является критическим для поддержания нормальных клеточных функций и дерегуляция miRNA часто ассоциирует с болезнями человека. такими как рак101.
    Transcriptional control. Транскрипция является основной точкой регуляции биогенеза miRNA. Многочисленные ассоциированные с Pol II транскрипционные факторы участвуют в траскрипционном контроле генов miRNA. Напр., миогенные транскрипционные факторы, такие как myogenin и myoblast determination 1 (MYOD1), соединяются выше miR-1 и miR-133 локусов и индуцируют траскрипцию этих miRNAs во время миогенеза102-104. Некоторые miRNAs находятся под контролем супрессирующих опухоли или онкогенных транскрипционных факторов. Опухолевой супрессор p53 активирует семейство miR-34 miRNAs (for a review, see Ref. 105), тогда как онкогенный белок MYC трансактивирует или репрессирует ряд miRNAs, которые участвуют в клеточном цикле и апоптозе106, 107. Эпигенетический контроль также вносит вклад в регуляцию miRNA генов; локус miR-203 часто испытывает метилирование ДНК в Т-клеточной лимфоме, но не в нормальных Т лимфоцитах.
    Post-transcriptional regulation. Drosha процессинг обеспечивает др. важный момент регуляции. miR-21 индуцируется в ответ на передачу сигналов bone morphogenetic protein (BMP)/transforming growth factor-beta (TGFβ) без активации транскрипции109. Предполагается, что SMAD белки, активируемые с помощью BMP/TGFbeta взаимодействуют с Drosha и DDX5 (также известным как p68), чтобы стимулировать Drosha процессинг, хотя детальный механизм остается неясным. Drosha процессинг pri-miR-18 зависит от гетерогенной рибонуклеопротеиновой частицы A1 (Refs 110, 111). Как большинство таких регуляторных факторов существует неясно, но возможно, что ядерные РНК-связывающие белки влияют на процессинг miRNA посредством специфических взаимодействий с субнабором pri-miRNAs.
    Интересные паттерны экспрессии обнаруживают let-7 miRNAs112. Первичный транскрипт let-7 (pri-let-7) экспрессируется как в недифференцированных, так и дифференцированных ES клетках, тогда как зрелый let-7 обнаруживается только в дифференцированных клетках. указывая тем самым, что let-7a может контролироваться пост-транскрипционно113-115. Сходное пост-транскрипционное подавление let-7 также имеет место в опухолевых клетках114. Недавние исследования показали, что РНК-связывающий белок, LIN28, ответственен за супрессию биогенеза let-7116-119. Предложено несколько отличающихся механизмов действия LIN28: блокада Drosha процессинга116, 117, интерференция с Dicer процессингом118, 119 и терминальное uridylation pre-let-7 (Ref. 119). Учитывая цитоплазматическую локализацию LIN28 (Ref. 120) и его строгое взаимодействие с pre-let-7 (но не с pri-let-7)119, LIN28 скорее всего действует в основном в цитоплазме благодаря вмешательству в процессинг pre-let-7 и/или благодаря индукции терминального uridylation pre-let-7. U хвост (~14 nt), который добавляется к 3' концу pre-let-7, блокирует Dicer процессинг и облегчает распад pre-let-7 (Ref. 119). Неясно, насколько распространена этого типа регуляция и какой фермент ответственен за pre-miRNA uridylation.
    Turnover of miRNA is a largely unexplored area. Энзимы распада РНК могут находить не только зрелые miRNAs, но и также предшественники (pri-miRNAs и pre-miRNAs). Связавшись с белком Ago, зрелые miRNAs, по-видимому, становятся более стабильными, чем в среднем мРНК; период полу-жизни большинства miRNAs большие 14 ч121. Однако некоторые miRNAs (напр., miR-29b) могут быть деградированы быстрее, чем др. miRNAs121, это указывает на специфическое распознавание последовательностей miRNA нуклеазами. 3'→5' exonuclease ERI1 (также известная как THEX1) как было установлено ранее является ответственной за деградацию siRNAsу C. elegans122. Группа exoribonucleases, наз. small RNA degrading nuclease (SDN) была недавно описана как влияющая на стабильность miRNAs у растений123. Однако остается неясным, какие нуклеазы ответственны за деградацию miRNA у животных.
    Редактирование РНК это др. возможный путь регуляции биогенеза miRNA. Изменения adenines в inosines, процесс, который обеспечивается с помощью adenine deaminases (ADARs), наблюдается у miR-142 (Ref. 124) и miR-151 (Ref. 125). Т.к. модифицированные pri-miRNAs или pre-miRNAs становятся плохими субстратами для RNase III, то редактирование предшественников может взаимодействовать с процессингом miRNA. Редактирование может также изменять специфичность мишеней miRNA, если оно происходит в последовательностях miRNA126.
    Увеличение количества miRNAs контролируется на пост-транскрипционном уровне, хотя механизмы регуляции плохо изучены для большинства miRNAs. miR-138 специфически экспрессируется в нервных клетках, тогда как её экспрессия супрессируется на Dicer-обеспечиваемой ступени процессинга в не-нейрональных клетках127. Человеческие miR-31, miR-128 и miR-105, однако могут контролироваться на ступени экспорта из ядра, т.к. предшественники остаются в ядре и не дают зрелых miRNA в определенных типах клеток128. Зрелые miR-7, miR-143 и miR-145 обнаруживают пониженную экспрессию в раковых клетках по сравнению с нормальными тканями, хотя уровни предшественников сходны в опухолевых и нормальных тканях, это указывает на то, что происходит неправильная пост-транскрипционная регуляция в раковых клетках129, 130.
    Feedback circuits in miRNA networks. Биогенез miRNA контролируется на многих уровнях с помощью петель обратной связи, которые используют факторы биогенеза, сами miRNAs и их мишени131. Два типа дуг обратной связи обнаруживаются: одиночная негативная обратная связь и двойная негативная обратная связь. Первая обычно приводит к стабильной или осциллирующей экспрессии обоих компонентов, тогда как вторая служит как бистабильное переключение, которая приводит к взаимно исключающей экспрессии.
    Уровни Drosha и Dicer, контролируемые с помощью одиночной негативной обратной связи, поддерживают гомеостаз продукции miRNA52, 132, 133. Drosha составляет регуляторную петлю вместе с DGCR8; Drosha подавляет DGCR8 путем расщепления DGCR8 мРНК, тогда как DGCR8 позитивно регулирует Drosha посредством стабилизации белка 52, 191. Эта петля, по-видимому, высоко эффективна, т.к. когда количество копий гена DGCR8 снижается наполовину у Dgcr8 гетерозиготных клеток, то продуцируется почти нормальный уровень белка DGCR8 и уровни miRNA также остаются незатронутыми. Человеческий Dicer контролируется с помощью своего собственного продукта, let-7, который соединяется с 3' UTR и кодирующей областью Dicer мРНК132, 133. Это может объяснить, почему нокдаун Dicer часто довольно непродожителен и слабы, чем нокдаун др. генов. Более того, описаны многочисленные примеры одиночных петель негативной связи у червей, мух и млекопитающих, у которых транскрипционный фактор, который трансактивирует miRNA, сам репрессируется с помощью той же самой miRNA131.
    Контроль с помощью двойной негативной обратной связи также часто используется для эффективного генетического переключения специфических miRNAs во время дифференцировки. Интересным примером является консервативная петля, которая использует let-7 и LIN28 (Refs 116, 117, 119, 134). let-7 супрессирует синтез белка LIN28Ю тогда как LIN28 блокирует созревание let-7 . Семейство miR-200 и репрессоры транскрипции ZEB1 и ZEB2 также составляют двойную негативную петлю обратной связи, которая действует при эпителиально-мезенхимных переходах135.

    Piwi-interacting RNAs


    piRNAs первоначально были обнаружены во время исследований профилей малых РНК в развитии D. melanogaster136, 137. Эти исследования открыли субнабор эндогенных, специфичных для зародышевых клеток малых РНК (24-29 nt) , которые четко отличались своими размерами от miRNAs. Большинство этих более длинных видов соответствовало межгенным повторяющимся элементам, включая retrotransposons. Поэтому они были названы repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs)137. Более ранние исследования на D. melanogaster подтвердили. что малые РНК, которые соответствуют ретротранспозонам, могут участвовать в замалчивании мобильных элементов136. Кроме того, PIWI белок, как было показано, является важным для само-обновления стволовых клеток зародышевой линии138-140 и для контроля подвижности транспозонов141, 142. Aubergine (AUB), жр. белок Piwi-подсемейства, необходим для образования полярных клеток143 и для репрессии ретротранспозонов144. Позднее Vagin et al. показали. что piwi и aub мутации приводят к потере накопления rasiRNA в яичниках14, усилению соединений между rasiRNAs и Piwi белками. Физическое взаимодействие rasiRNAs с Piwi белками было выявлено с помощью иммуноочистки Piwi комплексов, в основном с помощью использования специфических антител против каждого из Piwi белков, включая третьего члена подсемейства, AGO3 (Refs 14, 145-148) (Box 1; Table 1).
    Белки Piwi-подсемейства у мышей (MIWI, MILI и MIWI2; также известные как PIWIL1, PIWIL2 and PIWIL4, соотв.)149-152, также как и те, что у рыбок данио (Ziwi и Zili; также известные как Piwil1 и Piwil2, соотв.)153, также обнаруживают ассоциацию с малыми РНК, которые напоминают rasiRNAs. Эти малые РНК (24-31 nt) были названы piRNAs. Мутации в Mili и Miwi2 дерепрессируют мобильные элементы, подтверждая функцию мышиных piRNAs в контроле транспозонов154-156. На базе их общих свойств D. melanogaster rasiRNAs теперь обозначаются как piRNAs155, 157.
    piRNA biogenesis in flies. piRNAs продуцируются из межгенных повторяющихся элементов хромосом. Большинство piRNAs может быть картировано в определенных локусах, которые называются кластерами piRNA. Интересно, что Piwi-ассоциированные с piRNAs включают те, что происходят из определенных локусов кластера piRNA, flamenco, на X хромосоме146. Эта регуляторная система, которая ведет в выбору такого локуса, остается неизвестной. Более того, piRNAs, которые ассоциированы с каждым из D. melanogaster Piwis, отличаются по размеру др. от др. 146, 147. Различия в субклеточной локализации, паттерны экспрессии и ассоциируемые белки могут влиять на селективную ассоциацию piRNA (Box 1; Table 1).
    AUB- и PIWI-ассоциированные piRNAs в основном происходят из антисмысловых транскриптов ретротранспозонов, тогда как AGO3-ассоциированные piRNAs возникают в основном из смысловых транскриптов14, 145-148. Наблюдается также пристрастие к нуклеотидам: AUB- и PIWI-ассоциированные piRNAs обнаруживают строгие предпочтения к uracil на своих 5' концах, тогда как AGO3-ассоциированные piRNAs в основном имеют аденин на месте нуклеотида 10, но не обнаруживают склонности на 5' концах146, 147. AUB-ассоциированные piRNAs часто обнаруживают комплементарность к AGO3-ассоциированным piRNAs в своих первых 10 nt146, 147. Исходя из того факта, что piRNAs накапливаются в Dicer мутантных яичниках14, продукция piRNA в яичниках мух не зависит от Dicer. Потребность в Drosha не была тестирована. Как же piRNAs продуцируются без Dicer? Одна из гипотез предполагает, что Piwi белки сами по себе могут участвовать в биогенезе piRNA, принимая во внимание то, что они обладают режущей nuclease активностью; Piwi разрезает мишень РНК между позицией 10 и 11 относительно 5' конца ассоциированных малых РНК145. Базируясь на этой и др. характеристиках piRNAs, описанных выше, была предложена модель биогенеза piRNA146, 147. AUB или PIWI, которые ассоциируют с антисмысловыми piRNA расщепляют смысловые ретротранспозоновые транскрипты и такое расщепление создает 5' концы смысловых piRNA, которые в свою очередь, ассоциируют с AGO3. Вновь полученные AGO3, которые ассоциируют со смысловыми piRNA постепенно расщепляют антисмысловые ретротранспозоновые транскрипты и тем самым дают 5' конец антисмысловых piRNAs, которые затем соединяются с AUB или PIWI. Факторы, которые необходимы для формирования 3' конца piRNAs, ещё не идентифицированы. Эти реципрокные реакции, известные как ping-pong цикл, д. происходить постоянно in vivo, амплифицируя тем самым популяцию piRNA146, 147. Одновременно может поддерживаться молчание ретротранспозонов.
    Мутации в некоторых генах, таких как те, что кодируют предполагаемые нуклеазы Squash и Zucchini158, и др., такие как Spindle-E14, Krimper159 and Maelstrom160, вызывают деплецию piRNAs в яичниках мух, указывая тем самым. что они участвуют в биогенезе piRNA. Однако точная роль этих белков не выяснена. piRNAs, происходящие с flamenco (flam-piRNAs), по-видимому, не зависят от ping-pong пути, т.к. они обнаруживаются только в PIWI. Это отдельный путь для flam-piRNAs сегодня обозначается как путь первичного процессинга (primary processing pathway)161.
    Как такие циклы биогенеза piRNA инициируются во время развития? У D. melanogaster, по крайней мере AUB и возможно PIWI откладываются для следующего поколения для передачи через зародышевую линию146, 148. Полученные от матерей Piwi белки в эмбрионах также обнаружены у рыб153. Недавние исследования показали, что piRNAs, которые наследуются от матерей эмбрионами играют эпигенетическую регуляторную роль с замалчивании транспозонов162. Это исследование объясняет, как феномен, т. наз. гибридного дисгенеза связан с потерей наследования piRNA. Передаваемые piRNAs, преимущественно в форме, которая ассоциирована с Piwi белками, скорее всего действуют как первичные 'seeds', которые инициируют цикл амплификации биогенеза piRNA у эмбрионов и т.о., цикл д. оперировать и между поколениями.
    piRNA biogenesis in mice. У млекопитающих идентифицированы два класса Piwi-взаимодействующих РНК (piRNAs)149-152, 163. Один класс мышиных piRNAs (pre-pachytene piRNAs) экспрессируется до мейотической пахитены и происходит из кластеров, богатых повторами и транспозонами149. В этой связи pre-pachytene piRNAs съодны с D. melanogaster piRNAs. Pre-pachytene piRNAs взаимодействуют с двумя членами мышиных Piwi белков, MILI и MIWI2 (Refs 155, 156, 164). Др. класс piRNAs становится обильным во время стадии пахитены и ассоциирует с MILI и MIWI150, 155, 164. Эти пахитенные piRNAs остаются загадкой, т.к. их последовательности не дают указаний на их возможные мишени. Пахитенные piRNAs чрезвычайно обильны в сперматоцитах: более 80,000 самостоятельных видов происходят из крупного геномного кластера свыше 200 kilobases. Эти кластеры piRNA обладают заметной асимметрией нитей, так как будто piRNAs возникли в результате процессинга одного или нескольких гигантских транскриптов. Интересно, что последовательности piRNA не законсервированы среди млекопитающих. Однако они продуцируются с синтеничных регионов мышиного, крысиного и человеческого геномов.
    Данные исследований мышиных piRNAs подтверждают идею, что ping-pong механизм, первоначально предложенный для D. melanogaster может быть применен к мышиным pre-pachytene piRNAs164 (Fig. 3). Однако разные составы эмбриональных, неонатальных и взрослых piRNAs указывают на то, что цикл биогенеза не продолжается в течение всего развития зародышевых клеток самцов. Кроме того, pachytene piRNAs не обнаруживают явных признаков, которые наблюдаются для piRNAs, продуцируемых с помощью ping-pong пути. Т.о., путь первичного процессинга скорее всего работает как в случае D. melanogaster164, хотя сегодня неясно, сходны или нет механистически пути первичного процессинга у мух и мышей (Fig. 3).
    Как и у vs[ некоторые мышиные piRNAs соответствуют последовательностям транспозонов, указывая тем самым. что они также участвуют в замалчивании эгоистичных ДНК элементов. Однако даже если полагать об одинаковом эффекте, то используют ли они ту же самую стратегию для замалчивания. В семенниках мышей промоторные регионы определенных ретротранспозонов метилированы. Мутации в Mili и Miwi2 устарняют метилирование ДНК long interspersed nuclear element 1 (LINE1) и intracisternal A particle (IAP) и это приводит к бесплодию самцов154, 155. MILI и MIWI2 выполняют важные роли в установлении de novo метилирования ДНК транспозонов в зародышевых клетках плодов самцов156, 164. Эти результаты указывают на то, что мышиные piRNAs участвуют в транскрипционном молчании генов мишеней посредством метилирования ДНК. в
    В отличные от животных miRNAs, но сходные с растительными miRNAs, piRNAs обладают 2'-O-methyl модификацией своих 3' концов14, 165-168. Эту модификацию несут гомологи A. thaliana HEN1 methyltransferase169 (известна как HEN1 или PIMET у мух)165, 166. Также было показано, что HEN1 ассоциирует с Piwi белками в яичниках. Однако биологическое значение, 2'-O-methyl модификации остается неизвестным, т.к. D. melanogaster мутанты HEN1 не обнаруживают очевидных нарушений функций165.

    Endogenous siRNAs


    Глубокое секвенирование малых РНК в соматических тканях D. melanogaster, культивируемых клетках и яичниках выявило новый класс ~21-nt РНК17-20, 170-172. Эти РНК происходят из транскриптов транспозонов, смысловых-антисмысловых пар транскриптов и длинных ствол-петля структур17-20, 170-172. Специфические ассоциации этих endo-siRNAs с AGO2 продемонстрированы биохимически на мухах19, 20. Активное изучение профилей малых РНК на мышах показало. что многочисленные типы endo-siRNAs присутствуют в ооцитах15, 16 и в меньшей степени в ES клетках17. Мышиные endo-siRNAs также зависят от белка семейства Ago (мышиный AGO2; также известен как EIF2C2)15.
    Помимо пути endo-siRNA у D. melanogaster AGO2 участвует в пути RNA interference путем ассоциации с экзогенными siRNAs (exo-siRNAs; которые ~21 nt в длину) , которые возникают из эктопически внесенных длинных dsRNAs или siRNA дуплексов96. Напр., мухи используют механизм RNA interference, чтобы защитить от вирусов, которые продуцируют dsRNAs во время инфекции173, 174.
    Многочисленные эндогенные siRNAs описаны у др. видов, таких как растения и C. elegans29. Endo-siRNA пути у растений и червей наиболее сложны, чем у vs[ и млекопитающих и они обладают RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs)29 для генерации endo-siRNAs. Т.к. мухи и млекопитающие лишены RdRP, то их endo-siRNAs д. быть отнесены в категорию как новая группа endo-siRNAs, которая продуцируется RdRP-независимым способом.
    Endo-siRNA processing by Dicer 2 in flies. Величина распределения endo-siRNAs является узкой и сжатой (~21 nt) по сравнению , напр., с 21-23-nt длиной miRNAs. Система биогенеза, по-видимому, обладает ключом к этому различию. Подобно exo-siRNAs, но отлично от miRNAs, процессинг endo-siRNAs зависим от Dicer 2 скорее, чем от Dicer 1 (Refs 18-20, 170-172). Интересно, что в отличие от exo-siRNAs, которые нуждаются в R2D2 (Ref. 88), endo-siRNAs, особенно те, которые происходят из длинных stem-loops, связаны с LOQS, которые действуют на пути miRNA18-20, 73, 75, 170-172. Dicer 2 , по-видимому, способен ассоциировать с LOQS в клетках D. melanogaster146. Как и почему LOQS выбирают Dicer 2 , а не Dicer 1 в качестве партнера при процессинге endo-siRNA, неизвестно. Mskj бы также интересно понять, как Dicer 2-LOQS комплекс распознает свои субстраты и определяет место разреза.
    Предшественники endo-siRNA в основном продуцируются из смысловых-антисмысловых пар, происходящих из транспозонов. Они могут также возникать из конвергентной транскрипции белок-кодирующих генов и из неаннотированных регионов генома19, 20, 170, 171. Эти транскрипты не обязательно транскрибируются с тех же самых локусов; т.о., предшественники dsRNA стремятся иметь естественные несовпадения и вздутия. Вторым типом endo-siRNA предшественников является однонитчатый, но само-гибридизирующийся транскрипт, которые формирует структуру ствол-петля19, 20, 170, 171. Они отличаются от miRNA предшественников по большей длине стволов. Интересно, что значительное количество endo-siRNAs (~20% из AGO2-ассоциированых endo-siRNAsв S2 клетках) обнаруживают замены последовательностей19. Т.к. большинство обнаруженных мутаций были A-G заменами, то возможно, что это обусловлено редактированием РНК с помощью ADAR175. Активность редактирования ADAR ограничивается ядром и затрагивает только dsRNAs в качестве субстрата. Следовательно, dsRNA предшественники д. быть сформированы в ядре, в котором они служат в качестве субстрата для ADAR. Эти пост-транскрипционные модификации нуклеотидов вызывают дальнейшие крошечные выпячивания в предшественниках. Эти два структурных признака предшественников endo-siRNA (длинные dsRNA структуры и выпячивания) могут избирательно распознаваться с помощью факторов процессинга Dicer 2 и LOQS. Dicer 2 может быть необходим для процессинга длинных dsRNA и для взаимодействия с AGO2. LOQS может вносить вклад в связывание Dicer 2 с несовпадающими dsRNAs и в их сборку в RISC.
    Некоторые piRNA-генерирующие локусы может быть источником endo-siRNAs19, хотя Czech et al.20 описали противоположное наблюдение, что только небольшие piRNA локусы продуцируют endo-siRNAs. Подобно piRNAs, endo-siRNAs имеют 2'-O-methyl группы на своих 3' концах у мух, которые могут быть добавлены с помощью methyltransferase HEN1 (Ref. 19). Однако , piRNAs и endo-siRNAs безусловно различны в отношении их размеров (24-29-nt по сравнению с 21-nt), белковых партнеров (Piwi белки по сравнению с AGO2) и в отношении клеток, в которых они экспрессируются (в основном зародышевые клетки по сравнению с повсеместной экспрессией). Их статус редактирования также неодинаков; endo-siRNAs могут редактироваться ADAR, но это не возможно в случае piRNAs, это указывает на то, что endo-siRNAs генерируются из dsRNAs, тогда как piRNAs возникают из ssRNAs. Ретротранспозоны могут быть траскрибированы в обоих направлениях. Однако количества последовательностей в смысловых и антисмысловых продуктах неодинаковы. Это д. приводить к смеси dsRNAs и ssRNAs. Независимо от редактирования dsRNAs транспортируются в цитоплазму за счет неизвестного механизма и служат там субстратами для Dicer 2, чтобы генерировать endo-siRNAs. Однонитчатые транскрипты также транспортируются в цитоплазму возможно посредством пути экспорта мРНК и становятся субстратами для аппарата. продуцирующего piRNA.
    Endo-siRNA biogenesis in mouse oocytes. Подобно D. melanogaster endo-siRNAs, мышиные endo-siRNAs длиной ~21 nt и происходят из ряда источников, включая мобильные элементы15, 16. Общие свойства могут быть также обнаружены в их биогенезе. Dicer необходим для продукции мышиных endo-siRNA, как необходим Dicer 2 у D. melanogaster (Fig. 4). Предшественники мышиных endo-siRNAs являются транскриптами, которые содержат длинные шпилечные структуры или dsRNAs, которые происходят из смысловых-антисмысловых пар. Некоторые из этих пар (cis-endo-siRNA предшественники) транскрибируются с в результате конвергентной транскрипции с одного и того же локуса, тогда как др. (trans-endo-siRNA предшественники) происходят из двух сходных, но раздельных локусов. Было показано. что транскрипты псевдогенов могут генерировать siRNAs путем отжига (annealing) своих родственных функциональных транскриптов и что эти функциональные гены позитивно регулируются у Dicer и Ago2 мутантов15, 16. Т.о., псевдогены могут играть регуляторную роль путем супрессии своих функциональных экземпляров посредством механизма замалчивания РНК.
    Интересно, что мышиные ооциты продуцируют endo-siRNAs и piRNAs, тогда как семенники мышей экспрессируют только piRNAs15, 16. Т.о., в яичниках замалчивание транспозонов гарантируется двумя способами: piRNA и endo-siRNA путями. Во время эволюции транспозоны в зародышевых линиях самцов и самок мышей могли регулироваться разными способами. Хотя некоторые из них всё ещё остаются активными у самок ( у которых они могут наделять некоторыми преимуществами развитие ооцитов), путь endo-siRNA возможно утерян у самцов.

    Conclusions


    Tens of thousands of small RNAs have been discovered, and more small RNAs are expected to be discovered owing to rapidly expanding sequencing power. This is an exciting era in RNA biology, but at the same time we are facing multiple challenges. Most of all, it is difficult to distinguish between functional small RNAs and non-functional 'noises'. In fact, there are numerous misannotated small RNA entries in databases, which are apparently degradation products from other longer RNA species. Evolutionary conservation confers compelling evidence for the functionality of the cloned RNAs, but the small RNAs will eventually need to be experimentally validated to prove their functionality. Confirmation of their expression and their dependence on the Ago proteins will first be needed to validate individual small RNAs. Dependence on other biogenesis factors, such as Drosha, DGCR8 and Dicer, will also be useful in validating small RNAs as well as in classifying them17.
    The miRNA biogenesis pathway is well studied in comparison to piRNA and endo-siRNA pathways, although many questions remain unanswered. A more detailed understanding of the mechanism awaits the structures of the complexes, including Microprocessor, EXP5 and Dicer–RISC in association with the substrate RNAs. Many factors are implicated in miRNA biogenesis, such as DDX5, DDX17 (also known as p72), NFAR (also known as ILF3)40, 176, 177, SNIP1 (Ref. 178), PACT78 and Mei-P26 (Ref. 179), the biochemical roles of which are unknown. Furthermore, additional protein factors in the pathway need to be identified. For instance, we do not know the identities of the factors that are involved in miRNA turnover in animals. We also need to understand the significance and enzymology of the modifications of small RNAs, such as uridylation and adenylation of miRNAs. Moreover, we have yet to learn about the auxiliary factors that regulate miRNA maturation. It would be interesting to understand how miRNA biogenesis is controlled by these factors in response to various cellular signals. Developmental and environmental cues should be interpreted accurately by these factors to correctly operate the miRNA network.
    The piRNA pathway is still largely elusive. piRNAs are highly diverse in sequence, and many of them are derived from non-repetitive sequences, especially in mice. Because the ping-pong model does not explain all characteristics of piRNAs, it is likely that an additional biogenesis pathway exists for certain piRNAs, particularly those that are associated with Piwi in D. melanogaster and pachytene piRNAs in mice. It would also be interesting to understand the mechanistic details of how piRNAs relate to heterochromatin formation. Identification and analyses of the proteins associated with the Piwi proteins might provide clues.
    There are numerous other small RNAs, like mirtrons, that are generated through non-canonical pathways. Many of these are difficult to classify and their biogenesis pathways remain poorly understood. Although most of these non-canonical small RNAs are less abundant and less conserved than major small RNAs, such as miRNAs, they might have species-specific functions that are not yet fully appreciated.
    Another interesting issue is how small RNA pathways are connected to other aspects of RNA metabolism, including transcription, pre-mRNA splicing and mRNA decay. Given that intronic miRNAs are processed co-transcriptionally, it is tempting to speculate that these processes (transcription, splicing and Drosha processing) are coupled by specific factors. It would be interesting to unveil the mechanistic link between these nuclear events. It is also of note that animal RNase III, Drosha and Dicer are involved not only in small RNA pathways but also mRNA stability control of hairpin-containing mRNAs52, 180. Further studies are needed to identify additional substrates of RNase III proteins.
    Small RNAs are integral components of immensely complicated gene networks. Although individual miRNAs suppress their targets only moderately, miRNAs can exert broad and strong effects. This is possible because they target multiple genes, and because they are often engaged in feedback loops along with other regulatory factors. Thus, miRNAs seem to serve as hubs of gene networks that are rich in information flow. In-depth knowledge of small RNAs will help us to better understand gene networks, and to acquire safer and more effective strategies for genetic manipulation.
    Сайт создан в системе uCoz