Посещений:
МикроРНК

Контроль Сигнальной Трансдукции

MicroRNA control of signal transduction
Masafumi Inui, Graziano Martello & Stefano Piccolo
Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, 252-263 (April 2010) | doi:10.1038/nrm2868

MicroRNAs (miRNAs) are integral elements in the post-transcriptional control of gene expression. After the identification of hundreds of miRNAs, the challenge is now to understand their specific biological function. Signalling pathways are ideal candidates for miRNA-mediated regulation owing to the sharp dose-sensitive nature of their effects. Indeed, emerging evidence suggests that miRNAs affect the responsiveness of cells to signalling molecules such as transforming growth factor-β, WNT, Notch and epidermal growth factor. As such, miRNAs serve as nodes of signalling networks that ensure homeostasis and regulate cancer, metastasis, fibrosis and stem cell biology.


Рис.1.  |  MicroRNAs in context-dependent transcriptional activation and default repression.


Рис.2.  |  MicroRNAs and signalling gradients.


Рис.3.  |  MicroRNAs in signalling crosstalk and coordination.


Рис.4.  |  MicroRNAs in networks and loops.


Рис.5.  |  MicroRNAs in signalling networks.


Box.1. RNA biogenesis and mechanisms of action

Табл.1 microRNAs targeting signalling pathway components

DATABASES

  • miRNA database

  • bantam
  • let-7
  • miR-7
  • miR-8
  • miR-21
  • miR-26a
  • miR-126
  • miR-145
  • miR-192
  • miR-203
  • miR-217
  • miR-278
  • miR-290
  • miR-430
    • FURTHER INFORMATION
    Первым проблеском на новый мир малых РНК стали плодотворные работы Ambros, Ruvkun и коллег1, 2, 3: они сообщили, что lin-4 и let-7, первые идентифицированные гены microRNA (miRNA), контролируют время развития нематод, модулируя экспрессию др. генов на пост-транскрипционном уровне. С тех пор область miRNA выроста чрезвычайно и стала интегральным компонентом регулируемой генной экспрессии. Теперь мы знаем, что miRNAs являются универсальными и распространенными повсюду признаками геномов животных и растений; современные подсчеты предсказывают, что геном человека содержит , по крайней мере, сотни самостоятельных miRNAs, которые потенциально регулируют большую фракцию транскриптома4, 5.
    miRNAs являются классом в 20-25 nucleotide-длиной некодирующих РНК, которые модулируют генную экспрессию посредством канонического спаривания оснований между порождающей последовательностью miRNA (нуклеотиды 2-8 на её 5' конце) и комплементарной ей seed соответствующей последовательностью (которая присутствует на 3' UTR мРНК мишеней)4. miRNAs характеризуются специфическим биогенезом (Box 1): они сначала транскрибируются как часть более длинных предшественников (primary transcript; pri-miRNA), которые складываются сами с собой, образуя шпилечную структуру. pri-miRNAs затем преобразуются в ядре с помощью комплекса Drosha и транспортируются в цитоплазму с помощью exportin 5, где они подвергаются финальному процессингу с помощью Dicer ribonuclease6. Зрелые miRNAs проникают в RNA-induced silencing complex (RISC) путем ассоциации с белками Argonaute. Внутри RISC, однонитчатая miRNA раскручивается с помощью геликазной активности Dicer и производит целевой выбор, ингибируя трансляцию, стабильность и локализацию мРНК мишени6-8 (Box 1).
    Несмотря на существенные успехи мир miRNA остается в основном не исследованным в отношении физиологической функции этих молекул внутри клеток и организмов. Во-первых, miRNAs часто присутствуют в виде семейств перекрывающихся генов, это осложняет их генетическое вычленение. Во-вторых, каждая miRNA обладает многочисленными предполагаемыми мишенями, что делает несопоставимыми их функции, это не позволяет решить a priori, какая из них наиболее значительна и достойна экспериментальной проверки. В-третьих, степень подавления мишени, осуществляемая с помощью miRNAs, часто обнаруживает тенденцию становиться количественно скромной: измеренная на уровне белка, даже избыточно экспрессируемая miRNA обычно подавляет большинство своих эндогенных мишеней менее, чем на 50% (Ref. 9). Следовательно, большинство белков д. оставаться эффективными по сравнению с этой степенью ингибирования, этот аргумент подкрепляется малым количеством фенотипов haploinsufficient, которые подробно описаны. Напротив, немногие гены, которые, как известно, дают фенотипы, будучи удвоенными, вообще воспроизводят ситуацию, когда miRNA-обеспечиваемая регуляция мишени теряется10. Эти соображения указывают на то, что даже несмотря на то, что большинство генов, как предполагается, являются мишенями miRNA, лишь часть этих взаимодействий может быть удостоверена инструментально своими биологическими реакциями и фенотипами4, 10-16. Удивительно, однако, что ингибирование биогенеза miRNA (напр., путем устранения Dicer) четко указывает, что miRNAs существенны для широкого круга биологических процессов, включая контроль пролиферативного гомеостаза, дифференцировку или эмбриональную стволовость17-19.
    Разрешение этой головоломки скорее, чем анализ пар miRNA-мишень может предсказать биологические функции miRNA, обратный вопрос - выяснение, какие биологические процессы могут быть первыми кандидатами на регуляцию, обеспечиваемую с помощью miRNA - может быть более продуктивным. В обзоре мы представим примеры, показывающие, что пути сигнальной трансдукции являются первыми кандидатами на роль miRNA-обеспечиваемой регуляции в клетках животных. Сигнальные комплексы в самом деле чрезвычайно динамичные, преходящие и не-стоихометричные молекулярные ансамбли, которые транслируются в хорошо установленные зависимые от дозы реакции. В качестве таковых они являются идеальными мишенями для степени количественных флюктуаций, накладываемых с помощью miRNAs. Это может обеспечить мульти-генную регуляторную способность miRNAs ремоделировать сигнальный ландшафт, облегчая или противодействуя передаче информации к нижестоящим эффекторам эффективным и своевременным способом20. Table 1 and Supplementary information S1 (table) представляют список miRNAs, нацеленных на позитивные или негативные модуляторы ключевых сигнальных путей. В первой части обзора мы суммируем некоторые примеры, которые связывают функцию индивидуальных miRNAs с регуляцией передачи сигналов клетками.
    miRNAs могут также помочь объяснить парадокс эволюции. Стержневые белковые двигатели онтогенетических сигнальных сетей являются высоко консервативными устройствами, которые могут быть прослежены в обратном направлении к общему предшественнику всех Bilateria21-23. Однако развитие всё возрастающей сложности планов тела безусловно нуждается в большей степени пластичности в использовании этих путей, необходимой для эволюции новых слоёв регуляции. Точно также сайты связывания транскрипционных факторов, 3' UTR последовательности не ограничиваются нуждами кодирования и могут потенциально быстро дивергировать, чтобы кооптировать благоприятные miRNA-мишень взаимодействия и противодействовать отбору против вредных пар24, 25. Несмотря на это, хотя мало возникло новых семейств транскрипционных факторов в эволюции животных, продолжают возникать новые семейства miRNA параллельно с увеличением сложности планов тела и органов24, 26, 27. Т.о., miRNAs могут представлять собой пластичные и быстро эволюционирующие инструменты, которые увеличивают сложность регуляторных пластов сигнальных путей. Мы обсудим логику этих путей во второй части обзора. Итак, перекрестное общение передачи сигналов ростовыми факторами и miRNAs может вносить существенный вклад в наше понимание биологии miRNA.

    miRNA and signalling: common principles


    Во время эмбрионального развития действует горстка сигнальных путей - transforming growth factor-β (TGFβ), WNT, Hedgehog, Notch, Hippo и пути, управляемые с помощью receptor tyrosine kinases (RTKs), таких как рецепторы epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) и platelet derived growth factor (PDGF) - точно координируя тканевую индукцию, формирование паттерна, рост и морфогенез. Те же самые пути поддерживают тканевой гомеостаз у взрослых и их пертурбации объясняют диспропорциональность болезней человека22, 28-32. Эффективность этих сигнаьных путей связана с их способностью тонко контролировать экспрессию генов мишеней dj времени и пространстве. Принимаются два общих принципа, чтобы достичь этого: контекст-зависимая транскрипционная активация и default репрессия33 (Fig. 1a,b).
    miRNAs in default repression. Репрессия по умолчанию гарантирует, что экспрессия генов мишеней будет включена только в присутствии передачи сигналов, но активно репрессируется в их отсутствие. Это, прежде всего, достигается на транскрипционном уровне: обычно, один и тот же чувствительный элемент в промоторе гена мишени переключается с обеспечения репрессии по умолчанию на сигнал-зависимую активацию33 (Fig. 1b). Но транскрипционный контроль достаточен ли, чтобы объяснить тонкую регуляцию передачи сигналов? Кажется неразумным предположить, что in vivo клетки могут находиться только в однозначно включенной или выключенной ситуации. Гораздо чаще клетки будут отличать между, тем , что является реальным сигналом -достойным активации нижестоящих мишеней - от сигналов, которые слишком слабы или слишком преходящи. В этой сумрачной зоне, miRNAs д. быть критическими для интерпретации сигналов: путем ослабления позитивных медиаторов сигнальных каскадов, miRNAs д. создавать порог для пути активации, ограничивая её только соотв. зоной компетентности (Fig. 1c).
    WNT, Notch и Hedgehog являются сигнальными путями, которые находятся под строгой репрессией по умолчанию. Роль транскрипционного фактора TCF в передаче сигналов WNT служит в качестве примера такого типа регуляции. В отсутствие WNT лигандов цитозольный пул β-catenin, который действует в сочетании с TCF, чтобы активировать специфические гены, фосфорилируется и направляется на деградацию28. Вследствие передачи сигналов WNT инициируется каскад, который ведет к стабилизации и транслокации β-catenin в ядро, где он формирует активирующий транскрипцию комплекс с TCF, который оттесняет на второй план корепрессоры, располагающиеся на генах мишенях28. miR-8, Drosophila melanogaster ортолог семейства miR-200 у позвоночных, была идентифицирована при скрининге на избыточность функции для негативных регуляторов передачи сигналов Wingless (WNT signalling у позвоночных)34. В клетках D. melanogaster и мышей miR-8 и miR-200c, соотв., вносят вклад в default репрессию, путем нацеливания TCF и вышестоящих позитивных модуляторов пути, включая Wntless (также известного как evi), это необходимо для секреции WNT лигандов34.
    Сходный пример связан с передачей сигналов Hedgehog29. У млекопитающих этот путь контролирует пролиферацию cerebellar granule progenitor cells, а аберрантная активность пути вызывает medulloblastoma29. Используя miRNA высокопроизводительное профилирование медуллобластом человека, была идентифицирована miR-324-5p в качестве супрессора передачи сигналов Hedgehog. miR-324-5p находит транскрипционный фактор GLI1, медиатор передачи сигналов Hedgehog, а её потеря усиливает чувствительность пути, приводя к образованию опухоли35.
    Репрессия по умолчанию с помощью miRNAs не обязательно нацелена на стержневые компоненты пути; она может быть столь же эффективной, когда она выключает их транскрипционные мишени (Fig. 1c). Классический пример default репрессии на уровне нижестоящих мишеней это miRNA-обеспечиваемая регуляция кластера генов enhancer of split (E(spl)) и Bearded (Brd), которые являются нижестоящими эффекторами передачи сигналов Notch у D. melanogaster. эта система с большими резервами. в которой семейства родственных miRNAs (miR-2, miR-4, miR-7, miR-11 and miR-79 ) беспорядочно находят семейства родственных мРНК, предотвращая аберрантное развертывание Notch-обеспечиваемых программ развития36, 37. Отметим, что Notch мишени в E(spl) и Brd находятся среди наименее изученных примеров, для которых специфические мутации сайтов связывания miRNA в геномном трансгене достаточны, чтобы вызвать мутантные фенотипы, указывая тем самым, что регуляция с помощью miRNA важна для нормальной передачи сигналов Notch38, 39.
    miRNAs сами по себе могут быть медиаторами default репрессии. Напр., dj время повреждения ДНК каскад киназ активирует опухолевый супрессор p53, приводя к аресту клеточного цикла или апоптозу. p53 обычно латентный транскрипционный фактор, который ингибируется с помощью ubiquitin-обеспечиваемой деградации40. МикроРНК miR-125b важна для завершения репрессии p53 путем нахождения его, а потеря miR-125b вызывает p53-зависимый апоптоз41 (Fig. 1d). Известно, что miR-125b сама по себе является частью сети ДНК повреждений, т.к. она подавляется после генотоксической обработки41. Т.о., благодаря созданию порога активации p53, miR-125b гарантирует надежную и мощную реакцию на повреждения ДНК.
    miRNAs in default activation. Хотя miRNAs репрессируют экспрессию генов, их функция не совсем репрессивная. В самом деле, их эффект на конечный выход сигнального каскада сильно зависит от топологии пути. Напр., путь опухолевого супрессора Hippo, который контролирует тканевой рост у D. melanogaster и млекопитающих путем регуляции клеточной пролиферации и апоптоза, активируя передачу сигналов в действительности ведет к инактивации двух нижестоящих транскрипционных факторов пути, Yes-associated protein (YAP) и Taffazin (TAZ) протоонкогенов. В частности, передача сигналов вызывает фосфорилирование YAP и TAZ, это ингибирует их ядерные активности путем локализации их в цитоплазму22. Фосфорилирование YAP и TAZ обеспечивается с помощью large tumour suppressor (LATS) киназы и её вышестоящего регулятора, Expanded. Компоненты этого пути Hippo pathway контролируются с помощью двух miRNAs: miR-372 и miR-373 у млекопитающих (LATS) и miR-278 у D. melanogaster (Expanded)42-44. Это приводит к отсутствию фосфорилирования YAP и TAZ, задержке в ядре и к последующей транскрипционной активации генов мишеней YAP иTAZ. Т.о., в случае Hippo, супрессия сигнальных медиаторов ведет к транскрипции генов мишеней YAP и TAZ, это объясняет онкогенный потенциал этих miRNAs (Fig. 1e). Известно, что ключевой транскрипционной мишенью пути Hippo у D. melanogaster является miRNA bantam, которая служит в качестве важного медиатора роста и формирования паттерна организма45, 46.

    miRNAs and context-dependent signalling


    Поступление внеклеточного сигнала обычно не высвобождает специфические инструкции. Вместо этого, клетки, которые интерпретируют сигнал в соответствии с его историей и действительным окружением, отбирают репертуар генов мишеней, которые наилучшим образом подходит к их нуждам. Уникальное окружение miRNA каждого типа клетки идеально подходит к выполнению задачи при такой зависимой от контекста экспрессии генов (Fig. 1a). Это д. создавать огромную пластичность биологических результатов и объясняет постоянный рециклинг этих сигнальных каскадов в разных типах клеток и стадиях развития и в эволюции.
    Важно объяснить, как нативные клетки приобретают самостоятельные судьбы в ответ на ограниченное количество сигнальных импульсов. Элегантное решение этой загадки связано со способностью клеток воспринимать внеклеточные сигналы количественно т.е. их интенсивность и продолжительность) и со способностью увязать такие 'считывания' с активацией программ экспрессии определенных генов47. Такая дозовая зависимость, по-видимому, особенно важна для регуляции miRNA. В этом разделе мы предоставим примеры, связанные с miRNAs как генераторами градированных реакций или как умножителей сигналов.
    miRNAs sharpen morphogen gradients in TGFβ signalling. Эффекты передачи сигналов лигандов сверхсемейства TGFβ , таких как TGFβ и bone morphogenetic protein (BMP), широко распространены dj время морфогенеза и гомеостаза взрослых тканей. Это подчеркивается рангами hypomorphic и гаплонедостаточных фенотипов у мутантов по компонентам пути TGFβ , наблюдаемых в модельных системах мух, червей и позвоночных32. Это также указывает на то, что эти компоненты д.быть как-то лимитированы in vivo и поэтому д. быть идеальными мишенями для регуляции с помощью miRNA.
    Nodal является лигандом сверхсемейства TGFβ, который служит в качестве мощного морфогена во время индукции зародышевых слоёв и спецификации оси тела. Важно, что у ранних эмбрионов позвоночных активность Nodal асимметрична: у Xenopus laevis, наивысшая активность Nodal необходима для формирования Spemann's organizer, который предопределяет наиболее дорсальные и передние структуры23 (Fig. 2a). Недавняя работа подчеркивает роль двух miRNAs, miR-15 и miR-16, в этой асимметрии. miR-15 и miR-16 концентрируются на вентральной стороне эмбриона, где они ослабляют передачу сигналов Nodal путем разрушения (targeting) Nodal рецептора activin receptor type 2A (ACVR2A)48 (Fig. 2b,c). miR-15 и miR-16 также представляют первый пример интеграции между разными сигнальными путями. У X. laevis, развитие оси тела может быть отслежено в обратном направлении до первозданной асимметрии; т.е. до оплодотворения. В самом деле, вскоре после проникновения спермия, передача сигналов WNT-β-catenin оказывается активированной на будущей дорсальной стороне эмбриона21. Асимметрия WNT-β-catenin транслируется в пик активности Nodal поскольку, по крайней мере, частично, передача сигналов WNT ингибирует биогенез miR-15 и miR-16 тем самым усиливается Nodal-ACVR2A ответная реакция на будущей дорсальной стороне48 (Fig. 2c). Известно, что разные виды формируют разные, базирующиеся на miRNA стратегии, чтобы контролировать передачу сигналов Nodal: напр., miR-15 и miR-16-ACVR2A ось не законсервирована у рыбок данио, которые используют разные miRNA, miR-430, чтобы контролировать доступность Nodal лигандов во внеклеточном пространстве48, 49 (see below).
    Smad белки являются транскрипционными факторами, которые трансдуцируют TGFβ сигналы вниз к их рецепторам и они могут , следовательно, контролироваться с помощью miRNAs. В самом деле, в развивающейся печени кластер miR-23b, как было показано, находит три Smads (SMAD3, SMAD4 и SMAD5), и тем самым ингибирует анти-пролиферативную реакцию, обеспечиваемую с помощью TGFβ , и способствует пролиферации гепатоцитов50. Тот факт, что одиночный кластер miRNA нацелен на несколько Smads , кроме того, предлагает интересный пример того, как, не смотря на имеющийся слабый их собственный эффект, одновременная атака miRNAs на общий набор регуляторных белков может умножить их эффект.
    Ослабление передачи сигналов RAS с помощью let-7. Помимо пространственной регуляции miRNAs могут модифицировать со временем тканевые ответные реакции. let-7 была первой miRNA у нематод, для которой были идентифицированы чёткие гомологи в разных ветвях метазоа51. У нематод, let-7 функционирует как регулятор перехода от недифференцированных и пролиферирующих стволовых клеток у поздних личинок к молчащим, дифференцированным клеткам у взрослых3. Это сильно напоминает функцию let-7 млекопитающих, которая экспрессируется на низких уровнях клетками предшественниками, но на высоких уровнях их дифференцированным потомством52. В раковых клетках потеря let-7, по-видимому, ассоциирует с реверсией программы эмбриогенеза; т.е. с реактивацией генов, которые позитивно регулируют пролиферацию и самообновление стволовых клеток у молодых, но активность которых обычно снижается с возрастом53. Одной из эволюционно законсервированных мишеней let-7 является RAS, и эта регуляция контролирует самообновление клеток рака груди, скорее всего, в ответ на химиотерапию (Fig. 2d). Очевидно, что это объясняет только часть сложности биологии let-7: в примере рака груди, происходит дедифференцировка эпителия посредством let-7-обусловленного подавления разных мишеней, high mobility group box A2 (HMGA2; также известного как HMGIC)54, 55. С помощью усмирения передачи сигналов протоонкогенов, let-7 может противостоять раку, но она может также вносить вклад в снижение нормальной функции стволовых клеток, а самообновление ткани ассоциирует со старением56. Недавние успехи относительно механизмов биогенеза let-7 с помощью lIN-28, белка, который способствует плюрипотентности (see below), подтвердили интересную возможность целенаправленных манипуляций с экспрессией let-7 в разных контекстах.
    miRNAs as signalling amplifiers. Как только miRNA находит ингибитор сигнального каскада, она служит как позитивный регулятор или за счет амплификации силы или продолжительности сигнала или облегчает ответную реакцию клеток на др. субпороговые стимулы. Каскады RAS-RAF-mitogen-activated protein kinase (MAPK) и phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K)-AKT являются двумя прейотропными путями, которые являются ветвями от активированных RTKs31. Характерным свойством этих путей является мощная амплификация сигнала; это достигается с помощью многочисленных киназ, действующих последовательно и активирующих одна др., а также с помощью вторичных мессенджеров, таких как phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3)31, 57. Прирожденным риском такого устройства является создание потенциала цепной реакции, которая ведет к инициации старения или рака. Негативные регуляторы как раз к месту, чтобы предупредить такой риск; сюда входят phosphatase and tensin homologue (PTEN; который обращает PI3K-обусловленное фосфорилирование PtdIns(3,4,5)P3 (Ref. 58)), PI3-kinase regulatory subunit-β (PIK3R2; известна также как p85β) (которая ингибирует PI3K с помощью многих механизмов 59) и Sprouty-related, EVH1 domain-containing protein 1 (SPRED1) или Sprouty (два родственных антагониста RAS-обеспечиваемой активации RAF60). Некоторые miRNAs, как было показано находят и позитивные и негативные регуляторы этих каскадов (Table 1; Supplementary information S1 (table)). Здесь мы подчеркнем две miRNAs, miR-21 и miR-126, в качестве примеров miRNAs, которые амплифицируют сигналы посредством скоординированной и последовательно регуляции множественных мишеней61-64.
    miR-126 является наиболее многочисленной miRNA в эндотелиальных клетках, где она поддерживает передачу сигналов VEGF путем контроля SPRED1 и PIK3R2 мРНК (Fig. 2e). Путем ингибирования продукции естественных репрессоров передачи сигналов VEGF, miR-126 способствует ангиогенезу и целостности сосудов61, 62, подтверждая тем самым, что она может служить как эффективная мишень для анти-ангиогенной терапии .
    miR-21 находит и PTEN и Sprouty63, 64. Т.о., miR-21 служит в качестве генерального энхансера передачи сигналов RTK, что вообще-от объясняет её частую активацию в различных опухолях человека65. Известно, что повышенные уровни miR-21не только характеризуют раковые клетки, но и также представлены в др. случаях патологического роста. При кардиальном фиброзе miR-21 экспрессируется на высоком уровне в пролиферирующих кардиальных фибробластах. Фиброз традиционно рассматривается как вторичное следствие отсутствия кардиомиоцитов. Поразительно, однако, что ослабление передачи сигналов RTK при кардиальном фиброзе сопровождается молчанием miR-21, что приводит к достоверному ослаблению болезни сердца, указывая тем самым. что фибробласты могут играть более прямую и причинную роль в кардиальной гипертрофии и дисфункции, чем это предполагалось64 (Fig. 2e).
    В приведенных выше примерах miRNA одновременно воздействует на разные ветви передачи сигналов RTK, действуя таким образом как общий амплификатор реакции на сигналы. В др. случаях miRNAs могут придавать специфичность течения сигналов путем канализации (channelling) его в направлении специфической ветви. miR-26a, напр., воздействует только на PTEN, тем самым специфически амплифицирует AKT-управляемый gliomagenesis вследствие стимуляции PDGF66 (Fig. 2e).

    miRNAs in signalling crosstalk


    Регуляторные способности miRNAs могут быть использованы для соединения различных сигнальных путей (Fig. 3). Мы уже упоминали пример miR-15 и miR-16, связывающих передачи сигналов WNT иTGFβ 48. Более того, недавние доказательства подтверждают, что имеется несколько miRNAs, которые могут действовать как медиаторы взаимного общения между сигнальными путями. Специфический пример, как передаются TGFβ сигналы посредством AKT во время почечного фиброза67 (Fig. 3a); эта связь гарантируется каскадом miRNAs. В частности, TGFβ включает транскрипциюmiR-192, которая ингибирует экспрессию zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2). Поскольку ZEB2 является транскрипционным репрессором miR-216a и miR-217, его ингибирование делает возможной дерепрессию miR-216a и miR-217, приводя к ингибированию PTEN67 (Fig. 3a). Последующая активация AKT вызывает выживание и гипертрофию glomerular mesangial cell у мышей, моделирующих диабет. Т.о., противодействие или miR-192 или miR-216a и miR-217 д. предлагать новый терапевтический потенциал для диабетической нефропатии.
    Как при эмбриогенезе регенерация взрослых тканей и заживление ран также нуждаются в точном, скоординированном и динамичном контроле различных сигнальных путей (Fig. 3b). Не удивительно, что miRNAs проявляются как ключевые микроменеджеры некоторых из этих процессов. Напр., кожа постоянно омолаживается dj время гомеостаза за счет способности к самообновлению самого внутреннего basal layer. Когда клетки перемещаются suprabasally, они запускают программу терминальной дифференцировки68. Интегрирующим для такого переключения является подавление p53-родственного фактора p63, который существенен для поддержания эпителиальных стволовых клеток69. miR-203 заостряет границы между базальными предшественниками и их дифференцирующимся потомством, поскольку она нарушает остаточную экспрессию p63 в супрабазальных слоях19. Кожные придатки, такие как волосяные фолликулы и плавники, могут также регенерировать посредством стимуляции WNT68. Удивительно, др. законсервированной мишенью miR-203 является lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF1), партер по связыванию с ДНК β-catenin. Др. роль miR-203 в регенерации волосяных фолликулов не была исследована, miR-203 ингибирует Lef1-обусловленную регенерацию плавников у рыбок данио70 (Fig. 3b). Время обсудить, как ингибирование miR-203 может поддерживать регенеративную способность всего эпидермиса.

    miRNAs confer signalling robustness


    Ошибкоустойчивость является способностью биологических систем генерировать инвариантный фенотип, даже перед лицом генетических и средовых пертурбаций и предполагается, что miRNAs вносят вклад в ошибкоустойчивость за счёт нескольких механизмов.
    miRNAs as signalling balancers and buffers. В простейшем сценарии miRNAs могут находить как активатор, так и ингибитор одного и того же пути. Примером этого является регуляция пути Nodal с помощью miR-430 у рыбок данио, которая воздействует как на Nodal гомолог Squint , так и его ингибитор, Lefty49. В этом сценарии после снижения уровней miR-430, любое усиление Nodal балансируется с помощью соответствующего увеличения его антагониста, в результате не возникает заметных последствий. Но какова же функция miR-430 в Nodal пути? Чтобы ответить на этот вопрос необходимо разрушить специфические miRNA-мишень пары, используя защиту мишеней - т.е., антисмысловые morpholino олигонуклеотиды, спаривающиеся с сайтами связывания miR-430 на 3' UTR или Nodal или Lefty, это предупреждает эндогенные miR-430 от связывания и регулирует их трансляцию. В этих условиях отсутствие miR-430 сенсибилизирует эмбрионы к минорным флюктуациям Nodal лиганда. T.о., некоторые miRNAs воздействуют на agonist-antagonist пары, чтобы понизить их абсолютные уровни (dampening effect), чтобы регулировать их относительные уровни для достижения оптимальной эффективности передачи сигналов (balancing effect) и чтобы ограничить нежелательные флюктуации в передаче сигналов (buffering effect)49.


    miRNAs in signalling networks.


    Сигнальные пути сильно взаимосвязаны и поток информации, который они переносят, контролируется многими петлями обратной связи. Это делает их проявление и функциональную способность более сходной в сетью скорее, чем с линейным каскадом.
    Теоретические модели предсказывают, что miRNAs являются критическими элементами этих петель20, 36, 71-73. Во-первых, miRNAs могут действовать как усиливающие агенты и дублеры тканеспецифических программ транскрипции20, 36. Это определяет последовательные петли обратной связи, в которых miRNA и её мишень противоположно регулируются с помощью одного и того же сигнала (Fig. 4a). Это указывает на то, что miRNA участвуют в сигнальных сетях, чтобы стабилизировать тонко настроенный тканевой паттерн путем репрессии своих мРНК мишеней в клетках, где они не должны экспрессироваться (т.е., 'leaky' мРНК). Пионерская работа на эмбрионах D. melanogaster представляет некоторые яркие примеры такой регуляции, при этом miRNA и её мишень обнаруживаются во взаимно исключающих доменах эмбриона74. Однако концепция взаимосвязанной регуляции может быть столь же приложима к менее экстремальным ситуациям; т.е. к тем, в которых miRNA и её мишень также коэкспрессируются75. Т.о., независимо от относительного соотношения между miRNA и её мишенью, при coherent регуляции miRNA действует сочетанно с патерн-формирующими сигналами для лучшего контроля генной экспрессии.
    Хотя логика сцепленных (coherent) петель является интуитивной, она сильно истощает регуляторный потенциал miRNAs. Не только эволюционно законсервированные miRNA-мишень пары, по-видимому, коэкспрессируются72, но и компьютерный анализ всего генома и транскриптомный анализ показывают, что экспрессия miRNAs скорее позитивно, чем негативно коррелирует с экспрессией их мишеней. Это расширяет функциональное значение miRNAs в негомогенной (incoherent) сетевой топологии, в которой miRNAs и их мишени ко-активируются (или ко-репрессируются) с помощью одних и тех же сигнальных импульсов36 (Fig. 4b). Имеются два основных преимущества такой организации. Во-первых, она предупреждает активацию нежелательных путей в результате стохастических сигнальных шумов, т.к. только настоящие bona fide стимулы смогут преодолевать ингибирование с помощью коэкспрессируемой miRNA. Во-вторых, она может также действовать гомеостатически, чтобы поддерживать уровни мишеней белков в устойчивом состоянии в случае нежелательных сигнальных флюктуаций, т.к miRNA д. будет настраивать трансляцию своей мишени в направлении противоположном тому, что предполагает сигнал. Понятно, что это гарантирует униформную ответную реакцию в эквивалентных группах клеток в пределах распространения сигнала. Напр., плюрипотентные embryonic stem (ES) д. тонко контролировать активность Nodal, поскольку этот путь предопределяет противопоставление судеб самообновления и дифференцировки в узком наборе концентраций и закрывает временную succession76 (M.I. and S.P., unpublished observations). Точный контроль доступности Nodal обеспечивается с помощью incoherent регуляторного circuit, при котором факторы плюрипотентности, такие как OCT4, включают Nodal антагонист Lefty, который остается под постоянным контролем с помощью сопутствующей OCT4-обусловленной активации miR-290-miR-295 кластера77 (Fig. 4b). Важно отметить, что динамические кинетические свойства miRNAs идеально подходят для работы в петлях, что обеспечивает ошибкоустойчивость, поскольку процессинг miRNA происходит быстрее, чем трансляция, это позволяет miRNAs воздействовать на экспрессию генов с более короткой задержкой, чем транскрипционные репрессоры20. Т.о., miRNAs могут обеспечить клетки утонченной временной и количественно точной передачей клеточных сигналов.
    Это также имеет значение для рака, при котором многочисленные онкогенные мутации поражают некоторые элементы сигнальной трансдукции. Если miRNAs будут глушить флюктуации элементов сигнальной трансдукции, то потеря miRNAs д. усиливать аберрантную активность сигнальных молекул. Поразительно, эксперименты по профилированию экспрессии обнаруживают глобальное подавление miRNAs в выборках опухолей по сравнению с нормальными тканями78, 79. Сходным образом генетическое ингибирование биогенеза miRNA существенно ускоряет RAS-индуцированный туморогенез80, 81. Так как рак был фактически рассматриваемым как Дарвинистская система, которая базируется на конкуренции между разными клеточными вариантами82, то возникает интересная возможность, что избегание контроля с помощью miRNA делает возможной эксплуатацию более агрессивных сигнальных вариантов, при этом ускоряется прогрессирование рака.

    miRNA and targets: reciprocal regulation


    Др. интересный позитивный модуль обратной связи определяется с помощью miRNA, когда она негативно регулируется своей собственной мишенью. Эта двойная негативная конфигурация подобна электрическим схемам с двумя устойчивыми состояниями - или коленчатыми выключателями - и может быть использована, чтобы превратить быстротечный сигнал в долго-длящийся клеточный ответ: как только устанавливается одно из двух альтернативных состояний, сигнальный импульс, который индуцирует переход, более не нужен и состояние поддерживается само собой. Недавние исследования сообщили несколько примеров miRNAs в коленчатых выключателях (Fig. 4c).
    miR-200 and EMT: cell memory and epithelial plasticity. Epithelial to mesenchymal transition (EMT) является сложной программой генной экспрессии, которая характеризуется потерей клеточной адгезии благодаря репрессии E-cadherin и активации генов, ассоциированных с подвижностью, инвазией и стволовостью. В этом качестве EMT активируется во время эмбрионального развития и ремоделирования взрослой ткани. Однако в происходящих из эпителия опухолях, EMT узурпируется для поощрения метастазов и в пользу фенотипов раковых стволовых клеток83. miR-200 из семейства miRNAs играет основную роль в спецификации эпителиального фенотипа путем предотвращения экспрессии транскрипционных репрессоров E-cadherin, ZEB1 и ZEB2 (Ref. 84). В свою очередь, первичный транскрипт miR-200 репрессируется с помощью ZEB1 и ZEB2 (Ref. 85), устанавливается двойная негативная петля обратной связи между ZEB1 и ZEB2 и семейством miR-200. Передача сигналов TGFβ, мощный индуктор EMT, активирует ZEB1 и ZEB2 (Ref. 85), которые затем репрессируют экспрессию miR-200. Как только уровни miR-200 падают ниже порога, то репрограммирование от эпителиального к мезенхимному фенотипу локально блокируется (Fig. 4c). Внедрённая стабильность этой дважды-негативной петли обратной связи представляет новую форму эпигенетической памяти. Например, это, возможно, объясняет, почему, по меньшей мере in vitro, стволовые клеточные характеристики, наделённые временным стимулированием EMT, продолжают проявляться у удаленных производных клеток длительно после того, как EMT-индуцирующие стимулы были удалены86.
    miR-145, pluripotency and differentiation in ES cells. miR-145 играет критическую роль при переходе между стволовостью и дифференцировкой посредством взаимную негативной петли обратной связи, которая включает факторы плюрипотентности. miR-145 экспрессируна низких уровнях в плюрипотентных ES клетках человека, поскольку её промотор непосредственно репрессируется с помощью OCT4; в свою очередь, miR-145 находит 3' UTR из OCT4 и её же в др. ассоциированных с плюрипотентностью генах, таких как SOX2 и Krueppel-like factor 4 (KLF4). передача сигналов BMP способствует дифференцировке ES клеток человека путем ингибирования OCT4 путем поддержки экспрессии miR-145, тем самым гарантируя прочное ингибирование генов плюрипотентности76, 87.
    miR-7 in signalling networks. Прирожденный риск двойных негативных петель обратной связи заключается в том, что стохастические флюктуации могут вызвать акселерацию петли, быстро переключаясь между альтернативными клеточными решениями. Однако, ошибкоустойчивость может быть обеспечена в системе за счет регулирования miRNA триггерного переключателя, стоящего ниже coherent упреждающей связь (feed-forward) петли. Такого типа сеть была охарактеризована в развитии глаз у D. melanogaster13. В этой модели, miR-7располагается ниже EGF рецепторной передачи сигналов, пути который важен для дифференцировки клеток предшественников в фоторецепторы. Как показано на Fig. 5, miR-7 и её мишень Yan (также известна как pokkuri) расположены в реципрокной негативной петле обратной связи, которая удерживает Yan, экспрессируемую в клетках предшественников, а miR-7 активируется , когда клетки начинают дифференцироваться в фоторецепторы. Передача сигналов EGF нарушает тканевой гомеостаз путём индукции coherent feed-forward петли: она активирует miR-7 и способствует временной деградации Yan, освобождая miR-7 от репрессии. Эта двухярусная сеть воплощает большинство из утонченных функций miRNAs при передаче сигналов: стабильные клеточные реакции посредством реципрокной ингибирующей петли и эффектов глушения шумов, т.к передача сигналов д. накапливать miR-7 выше порога, чтобы индуцировать стабильное изменение в генной экспрессии. Интересно, что ошибкоусточивость в генной экспрессии, достигаемая посредством coherent петли, стоящей ниже EGF, д. визуализоваться только после побуждения miR-7-дефицитных мух средовыми пертурбациями, такими как хишок13.

    Signalling regulation of miRNA processing


    Основной пробел в нашем знании miRNAs связан с механизмами их экспрессии. Ясно. что идентификация генетических и эпигенетических элементов, ответственных за это событие важна для выяснения роли miRNAs в сигнаьных сетях. Большинство генов miRNA располагается в межгенных регионах, указывая тем самым, что происходят из независимых транскрипционных единиц, которые регулируются с помощью RNA polymerase II или, в меньшей степени, RNA polymerase III. Др. miRNAs (~ 25-30%) внедрены в интроны известных кодирующих генов и могут быть регулируемы с помощью промотора своего гена хозяина. Интересно, что исследования по иммунопреципитации хроматина показали, что тела зрелых регионов, кодирующих геномные miRNA, необычно заняты с помощью nucleosomes88. Функциональное значение этой репрессивной эпигенетической метки неясно, но она может служить как код для сборки факторов, участвующих в процессинге предшественников miRNA, это подтверждается тем фактом, что расщепление первичных miRNAs происходит во время транскрипции89. В самом деле, созревание miRNA скорее, чем экспрессия, может быть ключевой регуляторной ступенью при генерации miRNA: во время эмбриогенеза мыши многие предшественники miRNA присутствуют на высоких уровнях, но не подвергаются процессингу90, однако всё ещё неизвестно, как процессинг с помощью Drosha и Dicer в действительности регулируется. Сходный сценарий наблюдается пи раке, при котором большинство miRNAs эффективно подавляются независимо от их геномной организации78.
    Некоторые из взаимосвязей между сетями передачи сигналов и биогенезом miRNA начинают выявляться на молекулярном уровне. Наиболее изученным примером регуляции биогенеза miRNA является let-7 miRNA. Уровни зрелых let-7 увеличиваются во время дифференцировки, но это не обусловлено увеличением скорости их транскрипции91. Вместо этого, LIN-28 негативно регулирует процессинг let-7 с помощью распознавания терминальной петли в let-7 pri-miRNA и pre-miRNA и блокирует её расщепление с помощью Drosha и Dicer, соотв. После соединения с pre-let-7, lIN-28 индуцирует 3' терминальное uridylation и последующую деградацию let-7 за счет рекрутирования терминальной ribonucleotransferase или poly(U) polymerase, такой как терминальная uridylyltransferase 4 (Ref. 92). Неизвестно. могут ли др. РНК-связывающие белки использовать механизм, который сходен с тем, что используется lIN-28, чтобы регулировать процессинг специфических miRNAs. Несмотря на это эволюционная консервация терминальной петли во многих miRNAs, по крайней мере, подтверждает распространенность регуляторной роли этой последовательности.
    Во время повреждений ДНК p53 соединяется с комплексом Drosha и способствует пост-транскрипционному созреванию многих miRNAs в pre-miRNA93. Среди miRNAs, которые зависят от p53, находятся несколько предположительно опухолевых супрессоров, так что это может быть новым механизмом, с помощью которого повреждения ДНК индуцируют арест клеточного цикла. Мутации в p53 часты при раке; это делает невозможным распознавание ДНК, но ведет к приобретению метастатических свойств в ответ на сигнальные импульсы, такие, как те, что передаются с помощью TGFβ94. Интересно, что мутантный p53 мешает также формированию комплекса процессинга Drosha, ослабляя биогенез miRNA и тем самым возможно вносит вклад в прогрессирование опухолей93.
    Др. пример пост=транскрипционной регуляции miRNA связан с передачей сигналов TGFβ и BMP и Smad-зависимым процессингом pri-miR-21 (Ref. 95). Smads способствует быстрому увеличению экспрессии зрелой miR-21 благодаря ассоциации с комплексом Drosha. Как следствие, miR-21 обеспечиваетTGFβ-индуцированную дифференцировку сосудистых гладкомышечных клеток в контрактильные клетки95. Поскольку и p53 и Smads взаимодействуют с p68 DEAD box RNA helicase (DDX5) из комплекса Drosha, фактором домашнего хозяйства, который необходим для процессинга многочисленных miRNAs, то неясно, как транскрипционные факторы (такие как Smads и p53) могут контролировать биогенез ограниченного, но всё ещё разнообразного набора miRNAs. Возможно, что специфичность возникает в результате распознавания специфических Drosha-pri-miRNA комплексов; напр., было бы важно установить, распознают ли p53 или Smads непосредственно консенсусные сайты в дуплексе РНК, которые сходны с их одного происхождения чувствительными элементами ДНК.

    Conclusions and future challenges


    With the identification of a vast number of miRNAs, each one carrying a long list of putative targets, the challenge is now to understand their biological function. This challenge is further complicated by the apparent subtlety of the effects of the miRNA–target interaction on gene activity. However, in reviewing the emerging role of miRNAs in signal transduction, it becomes apparent how the highly dose-sensitive nature of developmental signalling pathways renders them prime candidates for miRNA regulation.
    A future challenge will be to identify systematically all the miRNAs affecting, and regulated by, cell signalling. Although we are far from this goal, the experimental tools are definitively in place, including the capacity to screen for miRNAs that contribute to discrete signalling events using unambiguous and pathway-specific readouts in cultured cells or other model systems48, 96. Importantly, we can expect that the use of new loss-of-function reagents, such as antagomirs and locked nucleic acids (LNA), will greatly accelerate the discovery of endogenous miRNA functions97, 98.
    As developmental signalling pathways are disproportionally relevant in human diseases in general, and in cancer in particular, relevant hints to decipher miRNA function will emerge from the identification of miRNAs that are consistently dysregulated in various types of tumour. This should pinpoint the miRNAs that are selected for their oncogenic function or the miRNAs that are downstream effectors of aberrantly dysregulated pathways of human cancers99. In any case, merging activity-based or expression-based screens with new RNA-based therapeutics may offer opportunities for a signalling therapy for cancer. Instead of focusing on protein-coded oncogenes, which are difficult to target therapeutically, one could focus on their target miRNAs. If these are causal for the malignant phenotype, then anti-miRNA therapeutics could represent readily available smart drugs that can potentially inhibit tumour growth or the metastatic burden of a given tumour.
    Another clear indication from current studies is that miRNAs participate in signalling networks, both as backups of transcriptional control and as feed-forward or feedback devices that confer robustness to the output of cell signalling. Thus, the effect of a miRNA can be the result of the net effect of opposing regulations or of the activities against mutually inhibiting factors. Therefore, new miRNA functions may be revealed as we refine our understanding of the networks in which they operate. As outlined in this Review, miRNAs and their targets can be wired with upstream signalling cues in such a way that perturbations in network components can be buffered or tolerated by the system. This fascinating link with biological robustness also carries with it numerous questions. If the main function of miRNAs is to serve robustness, then one might expect that the network, reciprocally, may absorb miRNA perturbations without overt or immediate consequences. In so doing, however, the network may lose its robustness and become more sensitive to genetic or environmental fluctuations. Now the challenge will be to experimentally identify these robustness loops. For example, simple inactivation of a miRNA may not suffice, but dual inhibition together with another transducer may cause the collapse of the entire signalling network, with dramatic phenotypic effects. Alternatively, miRNA functions may not be revealed under uniform laboratory conditions but may need more sophisticated experimental assays that take into account the cell's own complexity and the cell's interactions within tissues or organisms4, 13, 100.
    Little is known about the subcellular localization, turnover and dynamics of many of the macromolecular complexes carrying out miRNA functions; so, an emerging issue is how miRNA processing and activity crosstalk with signalling at the cell biology level. For example, a link has been established recently between RNA silencing and endosomal trafficking, with RISC assembly and turnover occurring at multivesicular bodies. This is intriguing because signalling and endocytic pathways are intimately intertwined: by regulating endosomal trafficking, signalling cues may tune RISC function101, 102. Conversely, miRNAs might be secreted by exosomes for non-cell autonomous regulatory purposes103.
    Finally, facing the potential complexity of the miRNA–signalling network relationship, it is difficult to escape the prediction that any reductionist approach will greatly benefit from the guidance of quantitative mathematical modelling. The involvement of miRNAs in feed-forward and feedback motifs makes miRNAs ideal reagents in the hands of systems biologists to offer insights into the physical properties of signalling pathways, something that could not be reached by intuition alone. Curiously, aspects of miRNA function can already be perceived in virtue of their analogy with human engineering devices, as in the case of electronic switches. In turn, it may not be long before we might wish to look at the cellular miRNA and signalling framework to borrow new operational principles for the management of complex systems. This understanding may have applications in so far enigmatic, and necessarily holistic, aspects of tissue biology, such as regeneration, self-assembly and homeostasis and, perhaps, even on computing and engineering in general.
    Сайт создан в системе uCoz