Assembly of multiprotein complexes that control genome function
 J.Cell Biol. Vol. 185, No 1, P. 21-26, 2009 | | |
|
Live-cell imaging studies aided by mathematical modeling have provided unprecedented insight into assembly mechanisms of multiprotein complexes that control genome function. Such studies have unveiled emerging properties of chromatin-associated systems involved in DNA repair and transcription.
 Рис.1. | Model for binding of a site-specific protein to a target site, and subsequent assembly of a multiprotein complex on that site. |
Важные функции генома, такие как транскрипция, репликация и репарация ДНК, контролируются разнообразными молекулярными механизмами, каждый из которых использует динамическое взаимодействие между множественными белковыми факторами и специфическими местами генома структурно упорядоченным и время-зависимым образом. Недавние успехи в imaging живых клеток и прогресс в количественной флюоресцентной микроскопии пролили новый свет на динамическое взаимодействие мультибелковых комплексов с хроматином. Исследования in vivo показали, что многие белки, которые контролируют функции генома, быстро диффундируют в ядро млекопитающих в отсутствие молекулярных взаимодействий, с очевидными скоростями диффузии в пределах между~0.1 b 15 µm2/s, в зависимости от формы и размера молекулы. Соединение со статичными структурами, такими как хроматин обычно снижает существенно мобильность белков (Нoutsmuller et al.. 1999: Phair and Misteli, 2000). Многие ядерные белки быстро обмениваются между свободно перемещающимися и связанным с хроматином неподвижным состоянием на временной шкале от секунд до минут (Houtsmuller and Vermeulen, 2001; Gorski at al 2006). Хотя кинетика связывания большинства индивидуальных белков была измерена, но мало известно о том, как белки собираются в функциональные мультибелковые комплексы, которые участвуют в функции генома.
Здесь мы сфокусируемся на общих механизмах и кинетике сборки in vivo ассоциированных с хроматином мультибелковых комплексов. How do site-specific proteins find target sites on the DNA? Важно, что все процессы, которые контролируют геномную функцию, обеспечиваются комплексами, содержащими множественные белки, которые собираются на специфических сайтах ДНК. Образование таких мультибелковых комплексов часто инициируется с белками распознавания со сродством к специфическим последовательностям или структурами ДНК, таким как промоторы или повреждения ДНК. Сродство таких белков к ДНК предопределяется соотношением их силы связывания с (on-rate. kon) и скоростью их диссоциации от этих сайтов (off-rate, koff). Белки часто соединяются со специфическими и неспецифическими сайтами со сходными on-rates, тогда как сродство к специфическим сайтам в основном предопределяется низкой скоростью диссоциации, приводя к более длительному времени удержания на специфическом сайте (Hopfield, 1974: Qian, 2008). Как же сайт-специфические белки находят свои корректные сайты мишени при высоком избытке сайтов неспецифического связывания? Некоторые исследования подтверждают модель, согласно которой белок, который соединяется со специфической последовательностью ДНК, свободно диффундирует по ядру и временно взаимодействует с хроматином. Поскольку неспецифические (т.e.. низкого сродства) сайты обычно присутствуют в большом избытке по отношению к специфическим сайтам, то большинство событий связывания будет касаться неспецифических сайтов (Misteli, 2008). Обычно, если белок взаимодействует с неспецифическими, низкого сродства сайтами на хроматине, то он д. быстро диссоциировать и повторно соединяться пока не натолкнется на сайт высокого сродства (т.e., специфический), от которого он диссоциирует значительно медленнее (Gorski et al., 2006).
Интересно, что некоторые белки ассоциируют со своими сайтами мишенями in vitro на несколько порядков величин быстрее (скорости свыше 1010 M-1s-1), чем ожидалось исходя из ограниченного диффузией связывания (~108 M-1s-1; Berg et al., 1981: Gorman and Greene, 2008). Некоторые модели объясняют эту быструю скорость ассоциации перемещениями белков от инициального неспецифического сайта на свой сайт мишень за счет 1D диффузии вдоль ДНК за счет механизма скольжения, который использует электростатические взаимодействия ДНК-белок (Berg et al., 1981; Halford and Marko. 2004; Elf et al., 2007). Некоторые ДНК-связывающие белки способны перемещаться вдоль ДНК без отделения от неё, включая рестрикционные энзимы, транскрипционные факторы и белки репарации ДНК (Elf et al., 2007; Gorman and Greene. 2008). Структурные исследования подтверждают модель, согласно которой целенаправленное связывание купировано с конформационным изменением в белка и/или субстрате. Такой сценарий может примирить быструю 1D диффузию со строгим специфическим взаимодействием белков с сайтами мишенями (Erie et al.. 1994; Kalodimos et al., 2004; Gorman and Greene, 2008). Поскольку скольжение в основном обеспечивается электростатическими взаимодействиями, то свойство скольжения предопределяется с помощью распределения (в основном позитивно) заряженных остатков на поверхности белка, которые взаимодействуют с ДНК. Белок, который обладает 1D диффузией, как полагают, следует по большой борозде ДНК, и поэтому по спирали огибает спираль, когда диффундирует вдоль ДНК (Gorman and Greene, 2008). Др. возможность заключается в том, что белки свободно диффундируют по поверхности ДНК (т.наз 2D диффузия). Эксперименты выявили, что такой механизм используется некоторыми ДНК-связывающими белками и он может позволять белку обходить препятствия, такие как нуклеосомы (Kampmann, 2004). Следовательно, 2D диффузия белков может быть пригодной в контексте хроматина. При физиологической ионной силе белки диффундируют вдоль ДНК только на расстояния ~50 bp, т.к. ионная сила снижает электростатические взаимодействия ДНК-белок и тем самым 1D диффузию (Gowers et al., 2005; Gorman and Greene, 2008). Это указщывает на то, что 1D и 2D диффузия не являются основным способом транслокации ДНК-связывающих белков.
Хотя сама по себе 3D диффузия недостаточна, чтобы объяснить высокие скорости (более 108 M-1s-1), с которой некоторые белки, по-видимому, ассоциируют со специфическими сайтами мишенями генома, многие др. белки, по-видимому, имеют более низкие константы скорости ассоциации (Gabdoulline and Wade. 2002), это согласуется с нахождением мишеней при 3D диффузии. Необходимо отметить, что физиологическое значение 1D или 2D диффузии in vivo на сегодня неясно. Большинство исследований одиночных молекул, которые были посвящены этому вопросу, анализировали связывание белка с голой ДНК in vitro (for review see Gorman and Greene. 2008). Напротив, недавнее исследование на живых бактериях подтвердило 1D диффузию с помощью лактозного рецептора in vivo (Elf et al.. 2007). Более того, a.p53 мутант, дефицитный по 1D диффузии in vitro оказался неспособен соединятся с промоторами in vivo (McKinney et al.. 2004), это указывает на то, что 1D диффузия может иметь значение в клетках млекопитающих. Итак, вклад 3D, 2D и 1D диффузии для нахождения сайта мишени in vivo д. зависеть от биофизических свойств белка, количества и природы сайтов связывания и концентрации связывающихся белков. Assembly of multi-protein complexes that control genome function Нахождение сайта мишени за счет сайт-специфического распознавания белком лишь стартовая точка. После распознавания повреждения ДНК или промотора собирается мультипротеиновый комплекс , который, напр., выполняет транскрипцию или репарацию ДНК. Удивительно мало известно о том. как эти мультипротеиновые комплексы формируются и как они функционируют в клетке. Недавние пионерские исследования использовали междисциплинарные системные биологические подходы, чтобы открыть кинетические свойства таких сложных систем in vivo. Assembly of DNA repair complexes Чтобы защитить целостность генома используются множественные механизмы репарации ДНК для устранения специфических повреждений ДНК (Hoeijmakers, 2001: Essers et al., 2006). Напр., nucleotide excision repair (NER) удаляет спираль искажающие (helix-distorting) повреждения, которые затрагивают одну из нитей ДНК, тогда как homologous recombination (HR) и nonhomologous end joining репарирует double strand breaks (DSBs). NER участвует в сборке репаративных комплексов, содержащих до 10 белковых факторов, которые кооперируют в пространстве и во времени. В отсутствие повреждений стержневые NER белки: xeroderma pigmentosum group A белок (XPA), replication protein A, XPG, и ERCC1/XPF, обнаруживают быстрые скорости диффузии, которые в основном доминируют за счет свободной диффузии индивидуальных компонентов репарации (Houtsmuller et al., 1999; Essers et al.. 2006; Hoogstraten et al.. 2008). Хотя временные взаимодействия между NER факторами могут происходить в отсутствие повреждений, их разные подвижности исключают стабильные взаимодействия между NER белками. Соответственно, эти белки не обладают высоким сродством к повреждениям ДНК или др. к др.; скорее они соединяются только, чтобы репарировать промежуточные продукты (Volker et al., 2001). В противоположность др. NER факторам, белок, распознающий повреждения, XPC движется значительно медленнее в ядро, т.к. он постоянно соединяется неспецифически с хроматином со временем пребывания ~0.3 s (Hoogstraten et al.; 2008). В любой момент примерно половина из XPC молекул свободно движется и половина связана. Если присутствует место повреждения ДНК, то XPC случайно сталкивается со спираль нарушающим повреждением, с которым соединяется более стабильно (t1/2 = 25 s; Hoogstraten et al.. 2008). Соединение XPC с повреждением ДНК запускает сборку NER комплекса из свободно диффундирующих белков. NER proteins XPG, transcription factor II H (TFIIH) и ERCC1/XPF быстро соединяются с и диссоциируют от комплексов репарации (t1/2 = 1 min), тогда как XPA обменивается значительно медленнее (t1/2 ~ 2 min; Houtsmuller et al.. 1999; Essers et al.. 2006: Luijsterburg et al., 2007).
Быстрая кинетика ассоциации-диссоциации и обусловливает образование мультипротеинового ДНК репаративного комплекса, который содержит правильный набор белков, чтобы выполнять специфический ассоциированный с хроматином процесс маловероятного события. Как результат большая фракция белковых комплексов будет содержать неполный набор репаративных факторов. Соотв. лишь небольшая фракция комплексов будет ферментативно активной, содержать необходимые компоненты, чтобы запускать специфическое ассоциированное с хроматином событие, такое как разматывание или вырезание ДНК. По этому сценарию прогрессия NER процесса д. достигаться за счет последовательного образования разных промежуточных образований репарации, каждый из которых служит в качестве субстрата для сборки последующих репаративных факторов, необходимых для выполнения следующего ассоциированного с хроматином события. Это означает, что NER процесс разбит на несколько подпроцессов ( распознание, раскручивание, вырезание и ресинтез), которые осуществляются последовательно. Моделирование кинетики системы NER указывает на то, что большая часть времени репарации отводится образованию функциональных комплексов, это является прирожденным свойством крупных мультибелковых комплексов (unpublished data). Следовательно, модулирование эффективности сборки комплекса может обеспечить логический механизм для регуляции скорости ассоциированных с хроматином процессов (Gorski et al., 2008). Кроме того, д. произойти несколько циклов строительства и демонтажа белковых комплексов прежде, чем действительно катализированное ассоциированное с хроматином событие сможет обеспечить форму контроля качества за счет механизма, известного как kinetic proofreading (see "Kinetic proofreading": Qian, 2008).
Репарация DSBs с помощью HR использует сборку белкового комплекса, которая инициируется за счет связывания Mre11-Rad50-Nbs1 комплекса с местом повреждения и последующим образованием Rad51 нуклеопротеиновых филамент, имеющего целью связывание дополнительных репаративных белков, таких как Rad54, Rad52 и replication protein A (San Filippo et al., 2008). Наблюдение за живыми клетками выявляет, что Rad51 филаменты очень стабильны и что время пребывания Rad51 белков составляет порядка нескольких часов. Время пребывания Rad52 (~1 min) и Rad54 (~10 s) на хроматине значительно короче (Essers et al.. 2002). То., Rad51, по-видимому, является сильно связанным компонентом во время HR, он возможно служит в качестве связующей платформы для нескольких др. белков, которые быстро обмениваются. DSBs могут также репарироваться за счет негомологичного соединения концов в отсутствие сестринских хроматид (напр.. в G1), которое использует кольцеобразный Ku70/80 димер и каталитическую субъединицу DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs). Ku комплекс рекрутирует LiglV посредством XRCC4 на разорванные концы ДНК, который в свою очередь соединяет разорванные концы (Mari et al., 2006). Соединение Ku комплекса с концами разорванной ДНК является обратимым и обмен между связанным и растворимым пулами происходит в течение сек.(~40 s; Mari et al., 2006). Сходным образом, DNA-PKcs обмениваются между растворимым и ДНК связанным пулом в течение 1 min. Когда DNA-PKcs не могут быть фосфорилированы или осуществляют свою киназную активность, то значительно большая фракция пула DNA-PKcs оказывается связанной в течение более длительного времени (Mari et al., 2006: Uematsu et al.. 2007). Эти исследования подчеркивают важность посттрансляционной модификации репаративных белков и показывают, что в случае DNA-PKcs фосфорилирование снижает время пребывания этого репаративного белка в месте репарации.
Итак, эти исследования на живых клетках согласуются с моделью, согласно которой большинство репаративных факторов собирается на месте повреждения ДНК из свободно диффундирующих компонентов и формируют коротко-живущие комплексы на поврежденном хроматине (Houtsmuller et al.. 1999; Hoogstraten et al.. 2002: Essers et al., 2006: Mari et al., 2006). Различия в сродстве между специфическими и неспецифическими сайтами (как в межбелковых, так и в белок-ДНК взаимодействиях) часто относительно малы, поскольку специфические и неспецифические сайты часто структурно сходны. Следовательно, возможно, что если сродство белка к своему субстрату будет увеличиваться, то это приведет также к более высокому сродству для структурных аналогов, которые не являются настоящим субстратом и часто присутствуют в большом избытке.
В этом свете возможно, что сродство репаративных белков настроено так, что временного связывания будет достаточно для сборки комплексов на специфических (в данном случае на поврежденных damaged) сайтах с приемлемой скоростью, тогда как в тоже время низкое сродство гарантирует, что сборка комплексов на неспецифических сайтах ограничена. В самом деле, недавнее исследование показало, что прикрепление DSB репаративных белков Mre11, Rad50, или Nbs1 к хроматину искусственно повышает их сродство к ДНК, вызывая реакцию на повреждение ДНК в неповрежденных сайтах, это ведет к активации Chk1/Chk2 и аресту клеточного цикла (Soutoglou and Misteli. 2008). Это указывает на то, что связывание одиночного репаративного белка с высоким сродством с неспецифическими сайтами (т.e., неповрежденной ДНК) достаточно для запуска клеточной реакции на повреждение ДНК. Assembly of transcription initiation and elongation complexes Транскрипция использует сборку мультипротеиновых комплексов инициации транскрипции на хроматиновой нити. Различные исследования imaging живых клеток в комбинации с кинетическим моделированием выявило, что подобно белкам репарации ДНК мноие транскрипционные факторы, коактиваторы и RNA polymerases (RNA pol) быстро и обратимо соединяются на сайтах мишенях (Dundr et al., 2002; Hager et al., 2006; Darzacq et al.. 2007; Gorski et al., 2008). Случайно эти факторы собираются способом, который ведет к инициации транскрипции и продукции РНК (Darzacq et al., 2007). Несколько транскрипционных факторов и коактиваторов (напр., GR, GRIP-1, p53, TFIIB, and TFIIH) быстро диффундируют в ядро. В каждый данный момент, 15-25% этих белков соединяется на 3-5 s с хроматином (Hoogstraten et al., 2002; Gorski et al., 2006). Следовательно, короткое время пребывания (с временной шкалой в несколько сек) на хроматине является общим для транскрипционных факторов, некоторые обладают временем пребывания порядка 1 min (напр., андрогеновый рецептор и TATA box-связывающий белок; Chen et al., 2002; Farla et al., 2004), а др., по-видимому, более стабильно соединены с промоторами (Nalley et al., 2006; Yao et al.. 2006). Измерения динамики РНК полимеразы II в местах транскрипции показало, что из 100 RNA pol II молекул, которые взаимодействуют с геном, 84 делают это очень кратковременно со временем пребывания в несколько сек. , тогда как 15 молекул связаны несколько дольше (около минуты), и только 1 молекула участвует в элонгации, продуцируя молекулу мРНК (Darzacq et al., 2007). Эти исследования на живых клетках в комбинации с кинетическим моделированием показали, что большинство взаимодействий RNA pol II-promoter непродуктивно (Darzacq et al.. 2007). Это связано с началом транскрипции, показывающим, что сборка активного комплекса инициации транскрипции на промоторе медленная, сходная со сборкой комплексов во время репарации ДНК. Возможно, что ДНК промоторов существует в нескольких функциональных состояниях (напр., закрытый, неподготовленный, содержащий специфические посттрансляционные модификации, напр., гистоны), которые возникают, когда инициация транскрипции запущена (Hager et al., 2006). Аналогично с репарацией ДНК, каждое из этих состояний может служить в качестве субстрата для специфического набора транскрипционных факторов и корегуляторов. Ступенчатые и последовательные переходы через эти отличающиеся состояния могут помочь управлять процессом завершения (Fig. 1). Большинство in vivo исследований обязано решить, могут ли кинетические свойства транскрипционных комплексов быть общими.
Транскрипция генов ribosomal RNA (rRNA) с помощью системы RNA pol I также является очень динамичным процессом (Dundr et al., 1002). Большинство факторов преинициации (UBF1 and -2) и транскрипционных факторов (TAFr48) быстро обмениваются в течение 5 s на rRNA генах, тогда как замена TFIIH в ядрышках существенно более медленная (~25 s; Hoogstraten et al., 2002). Хотя полимеразы часто описываются как предсформированные комплексы (Seither et al., 1998), результаты экспериментов по imaging живых клеток строго указывают, что pol l собирается из своих индивидуальных компонентов на месте своей активности, где субъединицы быстро замещаются (~5 s; Dundr et al, 2002: Gorski et al., 2008). Подобно транскрипции с помощью RNA pol II только 1-3% из RNA pol I конечных событий приводят к элонгации, которая неэффективна в терминах ступеней ассоциации/диссоциации, необходимых для инициации транскрипции. Однако с несколькими десятками транскрипционных факторов событий связывания в секунду такой "неэффективный" механизм всё ещё даёт ~5000 рибосомальных транскриптов в минуту, подтверждая, что скорость рибосомальной продукции гарантирует жизнеспособность клеток (Dundr et al., Г.02). Интересно, что субъединицы RNA pol I обмениваются на промоторах rRNA приблизительно в 4 раза медленнее в S фазе, во время которой транскрипционный выход rRNA значительно выше, чем в G1. Это указывает на то, что более длительное время удержания индивидуальных субъединиц RNA pol I на промоторах непосредственно связано с более эффективным образованием транскрипционно активных RNA pol I комплексов (Gorski et al., 2008). Доминантно негативная мутация одного из факторов инициации снижает время пребывания субъединиц pol I subunits, приводя к снижению результатов транскрипции. Т.о., модулирование кинетики сборки/разборки RNA pol I может быть элегантным механизмом контроля транскрипционного выхода с генов rRNA (Gorski et al., 2008). Итак, эти исследования показали, что образование активных комплексов инициации транскрипции является самой медленным звеном и связано с большим количеством событий связываний и диссоциаций индивидуальных белков, что сходно с образованием комплексов репарации. Кроме того, кажущаяся неэффективной сборка комплексов во время инициации транскрипции может служить как регуляторный механизм, который снижает включение вредных (т.e., неспецифически связывающихся) белков в комплекс, процесс наз. kinetic proofreading (see "Kinetic proofreading").
Understanding assembly and functioning of genome-controlling complexes Исследования на живых клетках GFP-меченных белков, участвующих в процессах, ассоциированных с хроматином, дали большой и сложный набор данных, который труден для интерпретации и интегрируется без помощи кинетического моделирования. Математическое модулирование количественных in vivo массивов данных является мощным инструментом для получения механистической информации о процессах. ассоциированных с геномом. Оно делает возможным подсчет биофизических параметров белков и их взаимодействий, таких как коэффициенты диффузии и констант скорости ассоциации/диссоциации, которые не могут быть определены непосредственно in vivo. Более того, моделирование кинетических свойств ассоциированных с хроматином систем как целого скорее. чем их индивидуальных компонентов предоставляет детальную информацию о свойствах таких систем (unpublished data: Dundr et al., 2002; Politi et al., 2005;
Darzacq et al., 2007). Улучшенные математические инструменты доступны для описания кинетики диффузии, связывания и процессов реакции белков и для определения параметров модели из экспериментальных данных (Phair and Misteli, 2001). Разработаны реакционно-диффузионные модели, которые позволяют определять коэффициенты диффузии, а также константы скорости связывания и диссоциации белков из FRAP, потери флюоресценции пои photobleaching и FCS данные, исходя из дифференциальных уравнений или симуляций Monte Carlo (Zotter et al., 2006; Wachsmuth et al., 2008; van Royen et al., 2009). Кроме того, были разработаны модели обыкновенных дифференциальных уравнений образования белковых комплексов на хроматине, которые количественно оценивают процессы образования мультипротеиновых комплексов с учетом диффузии очень быстрой на временной шкале, при которой происходят реакции ассоциации и диссоциации (Dundr et al.. 2002; Politi ct al.. 2005: Darzacq et al., 2007; Gorski et al., 2008). Пионерские исследования imaging живых клеток в комбинации с кинетическим моделированием показали, что белки лишь случайно формируют активные мультипротеиновые комплексы на хроматине (unpublished data: Dundr et al., 2002; Darzacq et al., 2007; Gorski et al., 2008). Эти первые попытки описать сборку мультипротеиновых комплексов подтверждают, что низкая вероятность сборки ферментативно активных белковых комплексов может быть общим характерным геном-ассоциированным процессом.
Эти находки подтверждают сценарий, в котором белки не соединяются в фиксированном порядке, чтобы образовать мультипротеиновый комплекс. Скорее сборка комплексов осуществляется из разного состава белков. Комплексы, содержащие корректные наборы белков, необходимы, чтобы катализировать специфические ассоциированные с хроматином события (e.g.., разматывание, вырезание, синтез ДНК или гистоновые модификации), образуются с низкой вероятностью. Эта "probabilistic" точка зрения на сборку комплексов (depicted in Fig. 1) отличается от широко распространенного мнения, что сборка комплексов на хроматине происходит посредством упорядоченного механизма, в котором каждый белок включается ступенчатообразно в связанный с хроматином комплекс. Будущие исследования позволят проверить, может ли механизм, предложенный здесь для репарации ДНК и транскрипции быть распространен и на др. системы в ядре. Kinetic proofreading Взаимодействие сборки обратимых белковых комплексов и частых АТФ-управляемых необратимых ступеней, катализируемых с помощью мультипротеиновых комплексов может увеличить специфичность геном-контролирующих процессов вне специфичности связывания его индивидуальных компонентов с помощью механизма, известного как kinetic proofreading (Hopfield, 1974). При таком механизме, комплекс белок-ДНК проходит через серию промежуточных состояний высокой энергии, отбираемых для компонентов с относительно низкой скоростью диссоциации, приводя тем самым к более тонкому разграничению между специфическим связыванием с настоящими субстратами и неспецифическим связыванием с не субстратами. Напр., NER белок XPC обладает удивительно небольшим различием в сродстве между неповрежденными сайтами (т.e., с неправильным субстратом) и повреждениями ДНК (настоящим субстратом). Тем не менее NER система как целое различает с высокой специфичностью между поврежденной и неповрежденной ДНК. Кинетическое моделирование показывает, что kinetic proofreading может драматически увеличивать специфичность системы к настоящему субстрату помимо способности распознавания белка, чтобы различать настоящие субстраты от фальшивых (Hopfield, 1974; Qian, 2008). Kinetic proofreading распознавание повреждений с помощью NER системы может использовать гидролиз АТФ с помощью helicase TFIIH и несколько циклов ассоциации/диссоциации XPC и TFIIH (Giglia-Mari et al., 2006). Важно, что многие ассоциированные с геномом процессы участвуют в ферментативных реакциях, включая гидролиз АТФ, развертывание, инцизию, лигацию и посттрансляционные модификации белков (напр., гистонов), которые могут управлять ходом ассоциированных с геномом процессов
(see Fig. 1).
|