Среди генов TALE, Mkx наиболее близок к Iroquois (Irx) классу (Anderson et al.,[2006]; Liu et al.,[2006]; Takeuchi and Bruneau,[2007]). Mkx мыши имеет 56% гомологию с Irx2 по всему гомеодомену (35/63 остатков) и 82% (14/17 остатков) в частности в Helix III, которая физически взаимодействует с ДНК. Сюда входит консервация аланина в домене распознавания ДНК в Helix III, который, как полагают, участвует в определении последовательности мишени энхансера для Irx белков. Irx гены могут быть отличены от Mkx по присутствию высоко законсервированного IRO Box в С-терминальной половине всех Irx генов (Burglin,[1997]). Члены семейства Irx позвоночных регулируют различные наборы онтогенетических событий, включая камера-специфическую транскрипцию в сердце, спецификацию и позиционные характеристики нейроэктодермы позвоночных, морфогенез ветвления лёгких, формирование паттерна нефронов и формирование организатора у рыбок данио (Bao et al.,[1999]; Bruneau et al.,[2001]; Kudoh and Dawid,[2001]; Gomez-Skarmeta and Modolell,[2002]; Matsumoto et al.,[2004]; Lecaudey et al.,[2005]; van Tuyl et al.,[2006]; Reggiani et al.,[2007]). Исследования, проведенные на куриных Irx2 и Drosophila Mirr предсказывают, что члены семейства Irx действуют, репрессируя транскрипцию (Matsumoto et al.,[2004]; Bilioni et al.,[2005]). Кроме того, активность по репрессии транскрипции Irx4, как было показано, существенна для собственно спецификации камер сердца. Однако механизмы. с помощью которых гены Iroquois функционируют, всё ещё неизвестны.
Во время эмбрионального развития транскрипция
Mkx впервые обнаруживается в дорсо-медиальном и вентро-латеральном регионах дермомиотома созревающих сомитов, которые содержат высоко пролиферативные клетки миогенных предшественников (Anderson et al.,[2006]). Тонкая регуляция между пролиферацией и дифференцировкой этих клеток является важной для баланса между поддержанием пула миогенных предшественников и экспансией скелетных мышц (Amthor et al.,[1999]). Дифференцировка миогенных предшественников может быть измерена с помощью использования метода миогенной конверсии, который измеряет способность bHLH транскрипционного фактора MyoD превращать фибробласты в миобласты. С помощью этого метода мы установили, что Mkx является сильным ингибитором миогенной дифференцировки, которая зависит от связывания ДНК посредством Mkx гомеодомена. Биохимический анализ установил, что Mkx обладает репрессирующей активностью транскрипции, что обеспечивается с помощью трёх консервативных доменов в С-терминальной области белка. Этот регион формирует сложный комплекс с ко-репрессором Sin3A/HDAC и субнабором Polymerase II общих транскрипционных факторов. Следовательно, Mkx может действовать как репрессор генов, необходимых для дифференцировки тканей предшественников.
DISCUSSION
Mkx, недавно идентифицированный гомеобоксный ген, транскрибируемый в дискретных клетках эмбриональных предшественников системы скелетных мышц, включая скелетные мышцы, сухожилия и хрящи (Anderson et al.,[2006]). Mkx играет критическую роль в генетических путях, которые ведут к развитию этих тканей. В этом отношении паттерн экспрессии Mkx перекрывается с Pax3 и paraxis в предшественниках скелетных мышц, scleraxis в предшественниках сухожилий и Sox9 в предшественниках хрящей осевого скелета (Anderson et al.,[2006]). Анализировали биохимическую функцию Mkx в клеточной культуре. Mkx может функционировать как транскрипционный репрессор и содержит три малых репрессорных домена. Co-IP эксперименты предсказывают, что Mkx репрессирует транскрипцию посредством или HDAC-зависимого ремоделирования хроматина или за счёт ассоциации с общим аппаратом транскрипции. Наконец, миогенное превращение 10T1/2 клеток демонстрирует, что экспрессия Mkx способна блокировать MyoD-управляемую дифференцировку мышц. В целом данное исследование идентифицировало Mkx как мощный регулятор дифференцировки скелетных мышц, который действует посредством трёх доменов, чтобы управлять транскрипционной репрессией.
Суперкласс TALE гомеодомен-содержащих белков показал, что они важные регуляторы клеточной пролиферации, дифференцировки и формирования паттерна разных наборов тканей во время развития. Некоторые члены суперкласса TALE , как сообщалось, действуют как репрессоры транскрипции, включая гены близко родственные Irx, Pbc и TGIF классы (Asahara et al.,[1999]; Sharma and Sun,[2001]; Wotton et al.,[2001]; Matsumoto et al.,[2004]). Мы установили, что Mkx также может действовать как транскрипционный репрессор. Эта активность картирована в трёх коротких доменах, которые способны функционировать независимо, если слиты с гетерологичным ДНК-связывающим доменом. Короткие MRD's сходным образом функционируют как домены межбелковых взаимодействий с ко-репрессорами. Это подчёркивается тем фактом, что остатки, критические для функции MRD1 все появляются на той же самой стороне альфа-спирали, создавая потенциальную поверхность для взаимодействия с белком. Короткие альфа-спирали, как было установлено, участвуют в межбелковых взаимодействиях нескольких транскрипционных факторов, включая BCL2 и MDM2 (Arkin and Wells,[2004]). В случае MRD1, мы оказались способны идентифицировать Sap18 в качестве партнёра по связыванию. Короткие модулярные репрессивные мотивы были описаны для др. транскрипционных репрессоров. Наиболее заметными являются 55 aa en D домен белка engrailed, 57 aa C2D2 домен eve и 13 aa Sin3A Interacting Domain (SID) семейства Mad (Jaynes and O'Farrell,[1991]; Han and Manley,[1993a],[b]; Eilers et al.,[1999]). MRD последовательность в Mkx не обнаруживает существенной гомологии с этими мотивами и поэтому представляет новые репрессивные домены. Необходимо отметить, что MRD3 кажется единственным ортологом у позвоночных этого гена. Учитывая способность MRD3 независимо репрессировать транскрипцию, это наделяет ортологи Mkx позвоночных дополнительной регуляторной функцией.
Sin3A/HDAC стержневой комплекс хорошо изучен благодаря своей способности управлять ген-специфической транскрипционной репрессией. Помимо acetyltransferase активности HDACs, стержневой комплекс служит в качестве каркаса для рекрутирования др. энзимов, которые модифицируют нуклеосомы и общий аппарат транскрипции (Yang et al.,[2002],[2003]). Ни Sin3A, ни HDACs не обладают прирождённой ДНК-связывающей активностью, указывая тем самым, что взаимодействие с ДНК-связывающими транскрипционными факторами необходимо, чтобы локализовать репрессорный комплекс. Кстати, некоторые транскрипционные факторы, включая TALE суперкласс гомеодоменовых белков Pbx1 и TGIF, как было показано, связываются с Sin3A (Sharma and Sun,[2001]; Wotton et al.,[2001]; Silverstein and Ekwall,[2005]). Было показано, что Mkx также соединяется с Sin3A/HDAC комплексом. Sin3A, Hdac1 и Sap18 все они взаимодействуют с С-терминальной областью Mkx, которая действует как функциональный репрессор in vivo. Удалось показать, что Sap18 может взаимодействовать только с MRD1. Sap18, как известно. играет роль в стабилизации Sin3A/HDAC комплекса и взаимодействует с Sin3A (Zhang et al.,[1997]). Локализация Sap18 с помощью гетерологичного ДНК-связывающего домена с репортёрным геном приводит к репрессии транскрипции (Zhang et al.,[1997]). Т.о., рекрутирование Sap18 может объяснить репрессию, наблюдаемую для MRD1 и может быть также важным для рекрутирования Mkx на более крупный Sin3A/HDAC комплекс. Mkx гомеодомен также способен ко-иммунопреципитировать с Sap18, это оказалось неожиданным, учитывая, что этот домен не обладает репрессирующей активностью. Интересно бы установить мишени для MRD2 и MRD3 и определить, помогают ли они стабилизировать взаимодействия Sin3A/HDAC комплекса с Mkx или действуют посредством нового механизма.
Возможность ко-иммунопреципитации TFIIA1, TFIIB и Tbp создаёт возможность того, что Mkx способен репрессировать транскрипцию посредством HDAC-независимого механизма. Генеральные транскрипционные факторы существенны для образования RNA Polymerase II иниационного комплекса на месте старта транскрипции. Связывание этих белков может приводить разрушению иниационного комплекса, что ведёт к молчанию генов (Heinzel et al.,[1997]; Laherty et al.,[1997]; Nagy et al.,[1997]). Наш анализ продемонстрировал, что крупная С-терминальная область в Mkx может соединяться с Tbp, который находится в той же самой области, которая также связывает Sin3A/HDAC комплекс. Поскольку описано связывание Tbp и TFIIB с Sin3A (Burke and Baniahmad,[2000]), то это делает возможным, что Mkx обусловленная репрессия осуществляется посредством одного крупного комплекса.
Развитие скелетных мышц зависит от баланса между самообновлением клеток миогенных предшественников, ассоциированных с периферией мышц, и их дифференцировкой в мышечные волокна. Клетки дорсо-медиальной и вентро-латеральной губ (DML and VLL, respectively) дермомиотомов являются источником самообновляющихся премиогенных клеток, которые вносят вклад в расширение миотома, зачатка скелетных мышц (Christ and Ordahl,[1995]; Cossu et al.,[1996]; Denetclaw et al.,[1997]; Venters and Ordahl,[2002]). Спецификация этих клеток с помощью bHLH мышечных регуляторных факторов MyoD, Myf5, Mrf4 и myogenin, сбалансирована с помощью мышечных антагонистов, таких как Notch, Pax3, Pax7 и follistatin, которые способствуют пролиферации и блокируют транскрипцию мышце-специфических генов, и с помощью мышечных агонистов, таких как myostatin. Мы заинтересовались ролью Mkx в дифференцировке скелетных мышц, исходя из динамичной его экспрессии в миогенных предшественниках во время развития. Mkx транскрибируется специфически в регионах DML и VLL, демонстрируя тем самым роль в контроле дифференцировки премиогенных клеток (Anderson et al.,[2006]). Чтобы проверить эту гипотезу. мы использовали классический метод миогенного превращения в клеточной культуре. Мы установили, что Mkx ингибирует дифференцировку MyoD-индуцированных миобластов способом, зависящим от связывания ДНК. Т.к. генетический путь, с помощью которого это происходи, неизвестен, то можно предположить, что Mkx может действовать выше миогенных факторов и репрессировать их транскрипцию. Это также подтверждается наблюдениями, что Mkx не транскрибируется в миотомном компартменте сомитов, указывая тем самым, что подавление транскрипции Mkx может быть необходимой ступенью для дифференцировки миогенного клона.
Сайт создан в системе
uCoz