Межклеточное слияние миобластов является критическим процессом для формирования соматических мышц во время эмбриогенеза у Drosophila и позвоночных, включая млекопитающих (Taylor. 2006). Кроме того, у позвоночных рост мышц после рождения нуждается в постоянном слиянии миобластов, возникающих из сателлитных клеток, стволовых клеток мышц позвоночных. Соматическая мускулатура Drosophila melanogaster хорошо охарактеризована и может служить как модель для выявления молекулярных механизмов, лежащих в основе слияния иобластов.

У Drosophila слияние миобластов возникает в результате динамических взаимоотношений между founder cells (FCs) и fusion-competent myoblasts (FCMs) (Bate, 1990). FCs зачинают процесс слияния и поэтому ответственны за уникальные характеристики каждого мышечного волокна. Большая популяция FCMs мигрирует в направлении, распознает и слипается с FCs (for reviews, see Abrnayr et al., 2005; Baylies et al., 1998: Chen and Olson, 2004; Taylor, 2000). Вследствие этих ступеней клеточных взаимодействий FC затем сливается с одной или двумя FCMs, давая клетку предшественник, которая в свою очередь сливается с дополнительными миобластамина второй ступени слияния до тех пор, пока мышца не достигнет соотв. размера (Bate, 1990; Rau et al., 2001). Исследования на клетках млекопитающих в культурах выявили, что существуют строгие этой модели на молекулярном уровне (Horsley and Pavlath, 2004).

Недавно обнаружено несколько важных молекул, необходимых для слияния FCs и FCMs. Напр., во время клеточной адгезии пронизывающие мембрану Immunoglobulin (Ig)-молекулы участвуют в установлении кольцеобразной fusion-restricted myogenic-adhesive structure (FuRMAS) (Kesper et al., 2007). Ig-доменовая молекула Dumbfounded [Duf, также известная как Kin of Irre (Kirre) (see FlyBase)] (Ruiz-Gomez et al., 2000: Striinkelnberg et al., 2001) формирует кольца в точках клеточных кантактов на FCs, тогда как Ig-доменовый белок Sticks and Stones (Sns) (Bour et al., 2000) формирует соотв. структуру на FCMs. Оба белка взаимодействуют гетеротипически, чтобы инициировать процесс слияния миобластов. Прогресс в слиянии проявляется экспансией FuRMAS в местах контакта FCs и FCMs с 1 µm до 5 µm (Kesper et al., 2007). Интересно, что Ig-доменовый белок Duf недавно идентифицирован у рыбок данио, указывая на консервацию молекулярного пути у насекомых и позвоночных (Srinivas et al., 2007).

Др. известными компонентами FuRMAS являются адапторный белок Rolling pebbles7 [Rols7, также известный как Antisocial (Ants)] (Chen and Olson, 2001; Menon and Chia, 2001; Rau et al., 2001) на FCs и Blown fuse (Blow) (Doberstein et al., 1997: Schroter et al., 2006) на FCMs. Rols7 индуцирует вторую ступень слияния (Rau et al., 2001) и экспрессируется как кольцо на FCs, подобно Duf, и доставляет сигнал от FC мембраны в цитозоль посредством взаимодействия с внутриклеточным доменом Duf посредством его tetratricopeptide (TPR) повторов (Kreiskotheret al., 2006). Blow, напротив, концентрируется как затычка в центре кольца, формируемого с помощью Sns (Kesper et al., 2007).

Во время процесса слияния актиновый цитоскелет миобластов организуется динамически. В соответствии с этим центр адгезивного кольца в FCs и FCMs содержит Filamentous actin (F-actin) (Kesper et al., 2007). Недавно мы установили, что актиновые регуляторы kette (Sehroter et al.. 2004) и wasp (Schafer et al., 2007) важны для слияния миобластов. Kette является Drosophila гомологом HEM2 (NAP1), и может быть обнаружен в комплексе с SCAR (гомологом WAVE у млекопитающих) и является членом семейства Wiskott-Aldrieh-syndrome protein (WASP) (reviewed by Ibarra et al., 2005). Более того, kette, как было установлено, взаимодействует генетически с blow во время слияния миобластов (Sehroter et al.. 2004). Члены семейства WASP обладают консервативным VGA (verprolin homologous, cofilin homologous and acidic) доменом, который участвует в соединении G-actin и Arp2/3 (Rohatgi et al., 1999; Miki and Takenawa, 1998; Machesky et al., 1999). Аллель wasp^3D303S лишен CA домена из VCA домена и т.о., нейтрализует функцию материнского WASP (Schafer et al., 2007). Более того, генетические данные указывают на то, что Kette противодействует функции WASP (Schafer et al., 2007). Взаимодействующий с WASP партнер Verprolin1 [Vrp1, также известный как Solitary (Sltr) и Wip; дрозофилийный гомолог WIP млекопитающих], однако действует в комплексе с WASP, чтобы гарантировать успешное слияние миобластов (Kim et al., 2007; Massarwa et al., 2007).

Ветвление F-actin инициируется с помощью de novo nucleation актина, запускаемой посредством активации Arp2/3 комплекса (reviewed by Takenawa and Miki. 2001). Сам по себе комплекс Arp2/3 неактивен и нуждается в наборе партнеров по связыванию, включая членов семейства WASP, чтобы стать активным (Machesky and Insall, 1998). Соединение этих белков, как полагают, ведет к конформационным изменениям в положении семи субъединиц комплекса Arp2/3, особенно в отношении позиции субъединиц Arp2 и Arp3 (Robinson et al.. 2001; Volkmann et al., 2001).

Здесь впервые описывается EMS-индуцированный Arp3-нулевой аллель Arp3^schwachling, дающий аномальный фенотип слияния миобластов. Ультраструктурный анализ Arp3^schwachling и wasp^3D3-035 выявил образование пор слияния у обоих мутантов. В то время как у Arp3^schwachling мутантов мембрана между сливающимися миобластами удаляется, у wasp^3D3-035 эмбрионов разрыв мембраны не завершается. Находка, что слияние у Arp3^schwachling эмбрионов нарушается, несмотря на образование пор слияния, указывает на то. что поры не расширяются у Arp3^schwachling мутантов. Поэтому. чтобы получить дополнительную информацию о регуляции F-actin при слиянии миобластов, мы исследовали АгрЗ wasp двойных мутантных эмбрионов, которые обнаруживали полный блок слияния миобластов. Этот фенотип указывает на то, что WASP не только регулятор актина, контролирующий полимеризацию F-actin во время слияния. Наши исследования на scar одиночных мутантах и scar vrpl двойных мутантах строго подтвердили, что первая и вторая ступени слияния нуждаются в разных наборах факторов нуклеации F-актина.

Discussion

Генетические данные, представленные в этом исследовании проливают новый свет на регуляцию ветвления F-actin во время слияния миобластов. Имеется три класса белков, которые инициируют полимеризацию новых актиновых филамент: actin-related protein complex Arp2/3, Formins и Spire. Эти классы белков эволюционно законсервированы у большинства эукариот и способствуют сборке нового актина за счет разных механизмов. Комплекс Arp2/3 единственный известный белковый комплекс, который инициирует новые актиновые филаменты, ответвляющиеся от уже существующих филамент. После контактов между клетками F-actin в основном присутствует на кончиках FCM и в области FC/растущих микротрубочек, к которым FCM прикрепляются (Kesper et al.. 2007). Наш анализ Arp3, wasp и scar мутантов показал, что ветвление F-actin существенно для слияния миобластов. Исходя из анализа двойных мутантов, мы полагаем, что WASP-Vrpl комплекс способствует образованию ветвящегося F-actin во время второй ступени слияния миобластов, это позволяет нам предложить новую модель регуляции актина во время слияния миобластов (see below).

Межклеточное распознавание и слипание происходят нормально у мутантов, у которых нарушен механизм образования актинового цитоскелета.

Данная работа проистекает из идентификации Arp3-нулевого аллеля. Слияние тяжело нарушается у Arp3^schwachling мутантов. Однако окрашивание с помощью anti-Duf четко показывает, что это не обусловлено неспособностью к межклеточному распознанию и слипанию. Напр., FCMs всё ещё прикреплен к сайту растущих мышечных трубок, где Duf экспрессируется у Arp3^schwachling и wasp^3D3-035 мутантных эмбрионов. Интересно, что миобласты также успешно слипаются у Arp3^schwachling и wasp^3D3-035 двойных мутантов, которые неспособны сливаться полностью (compare Fig. 1B and Fig. 4B with Fig. 4C). Duf служит для привлечения FCMs, которые могут мигрировать в направлении Duf-экспресс ирующего источника (Ruiz-Gomez et al.. 2000). Следовательно, способность FCMs мигрировать является обязательным условием для слияния миобластов. Миграция клеток, однако, также зависит от регуляции актинового цитоскелета. Наши наблюдения ясно показывают, что природа ареста слияния у Arp3^schwachling и wasp^3D3-035 одиночных мутантов и у Arp3^schwachling и wasp^3D3-035 двойных мутантов не связана ни с неспособностью FCMs мигрировать, ни с неспособностью FCs/myotubes и FCMs распознавать и слипаться, а скорее со специфическим дефектом межклеточного слияния.

WASP is required for the creation of an open fusion pore, whereas Arp3 promotes the integration of the FCMs into the growing myotube

ЭМ анализ Arp3^schwachling и wasp^3D3-035 мутантов далее заставил нас выяснять процесс, в котором образование F-actin необходимо во время слияния миобластов. WASP-Vrp 1 комплекс участвует в формировании пор слияния, как сообщают Massarwa et al. (Massarwa et al., 2007). В согласии с этим исследованием мы наблюдали, что мутации wasp^3D3-035 и wip^D30 останавливают слияние во время разрыва мембран, но не после образования pre-fusion комплекса (Kim et al., 2007). Мы установили, что pre-fusion комплекс, который был описан, состоит из 1.4 пузырьков на пре-фузионный комплекс (Estrada et al., 2007), и выглядит идентично как у мутантов, так и дикого типа эмбрионов.

Рис. 8 A представляет новую мдель слияния миобластов, исходя изданных нашего исследования. Table 1 суммирует молекулы, которые необходимы для процесса слияния. Наши исследования Arp3 мутантов показывают, что базирующиеся на полимеризации силы ветвления F-actin необходимы после стадии разрыва мембран. После того как мембраны оказываются удаленными между сливающимися миобластами, FCMs д. стать интегрированными в FC и растущих мышечных трубках. Поскольку Arp3^schwachling мутанты неспособны сливаться после удаления мембран, то мы полагаем, что F-actin необходим, чтобы сделать возможной интеграцию в растущих мышечных трубках. После Duf- и Sns-обеспечиваемого распознавания FCs и FCMs, дальнейшие важные белки для слияния миобластов, напр., Blow, рекрутируются в точку слияния в FCMs. мы установили, что Vrp1 локализуется на кончиках филоподий FCMs. Kim et al. (Kim et aL, 2007) и Massarwa et aL (Massarwa et al., 2007) показали, что локализация WASP на мембране зависит от активности Vrp1. Т.о., рекрутирование WASP, по-видимому, ведет к увеличению F-actin в месте слияния. Как результат образование пор слияния инициируется и расширяется вплоть до того, когда FCM станет наконец вовлеченным в FC/growing myotube.

The Arp2/3 activators WASP and SCAR control F-actin formation during the second step of myoblast fusion, whereas the first fusion step is independent of WASP

Наш морфологический и статистический анализ ядер из DA1 мышц подтвердил, что слияние не происходит у Arp3 wasp двойных мутантов. Поскольку wasp^3D3-035 мутанты д. быть лишены способности способствовать образованию F-actin, то остановка слияния подобно мутантам Arp3^schwachling после образования предшественников оказалась неожиданным результатом. Поэтому мы исследовали, контролирует ли актиновый регулятор SCAR кроме того и ветвление F-actin во время слияния миобластов. эксперименты с двойными мутациями и эпистазом scar и wasp выявили, что это происходит в самом деле. Полное нарушение слияния миобластов у Arp3 wasp двойных мутантных эмбрионов - несмотря на присутствие материнских wasp and Arp3 - согласуется с находкой, что SCAR необходим для слияния миобластов и позволяет нам предположить, что SCAR и WASP контролируют разные ступени слияния миобластов (Fig. 8B). Наши генетические данные подтверждают, что WASP единственный необходим во время второй ступени слияния. это согласуется с предыдущими данными. представленными Massarwa et al. (Massarwa et al., 2007). Это подразумевает, что SCAR является важным для первой ступени слияния. Однако слияние миобластов не нарушается полностью у scar^Δ37-нулевых мутантных эмбрионов. Предоставляемый матерями продукт scar, по-видимому, способен компенсировать потерю зиготического scar во время слияния миобластов. Несмотря на это клоны scar зародышевой линии с редуцированными уровнями материнского и зиготического SCAR белка обнаруживают усиленный myoblast-fusion фенотип (Richardson et al., 2007). Поскольку потеря материнского scar нарушает оогенез, то невозможно устранить полностью материнский компонент scar (Zallen et al.. 2002), Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты по определению участия SCAR в контроле только первой ступени слияния или в обеспечении функционального перекрывания с дополнительным фактором.

Слияние миобластов у scar vrp1 двойных мутантов блокировано полностью, это может указывать на то, что SCAR регулирует первую ступень слияния вместе с WASP-взаимодействующим партнёром Vrp1. Белок Vrp1 экспрессируется со ст. 10 и далее, незадолго до инициации первой ступени слияния. Члены семейства Verprolin/WIP , как сообщалось, влияют на полимеризацию актина WASP-независимым способом (reviewed by Anton and Jones, 2006; Aspenstrom, 2005). остается проверить, происходит ли это во время слияния миобластов у Drosophila.

Помимо регуляции первой ступени слияния активность SCAR может быть также необходима для второй ступени слияния. Подтверждение этому получено нами ранее, что гомолог у позвоночных Kette, HEM2, который присутствует в комплексе с SCAR, важен для слияния миобластов (Schroter et al., 2004). Kette и WASP обладают антагонистическими функциями во время слияния миобластов (Schafer et aL, 2007). Т.к. ранее мы показали, что экспрессия WASP в FCs неспособна устранить wasp мутантный фенотип, то можно предположить, что только активность WASP необходима в FCMs (Schaier et aL, 2007). Поэтому мы можем предсказать, что полимеризация ветвящихся актиновых филамент может регулироваться специфическим от типа миобласта зависимым образом (Fig. 8B).

Итак, наши наблюдения впервые показали, что клеточный аппарат, ведущий к образованию F-actin, контролируется разными наборами факторов, способствующих нуклеации, во время первой и второй стадий слияния.