В раннем развитии эмбрионов позвоночных сигнальные молекулы необходимы для контроля индивидуальных клеток, чтобы инструктировать их где и как дифференцироваться в соотв. тип ткани. Зачаток конечности является прекрасной модельной системой для изучения дифференцировки и формирования паттерна мышц. Клетки гипаксиального дермомиотома сомитов, соседствующих с презумптивным зачатком конечности, подвергаются эпителиально-мезенхимному переходу в ответ на сигналы от смежной латеральной пластинки мезодермы (Chevallier et al., 1977; Christ et al., 1977; Jacob et al., 1978; Solursh et al., 1987; Hayashi & Ozawa, 1995) и затем отщепляются от сомитов и мигрирую в зачаток конечности. Мигрирующие миогенные предшественники первоначально экспрессируют транскрипционные факторы Meox2 (Mankoo et al., 1999) и CXCR4, Pax3 и Lbx1, последние три существенны для миграции (Vasyutina et al., 2005; Williams & Ordahl, 1994; Gross et al., 2000). Pax3 важен также для спецификации и пролиферации предшественников мышц конечностей (Bober et al., 1994; Goulding et al., 1994). Как только предшественники мышц достигают конечности, они продолжают пролиферировать и сливаться в дорсальные и вентральные пред-мышечные массы и начинают дифференцировку, экспрессируя миогенные регуляторные транскрипционные факторы (MRFs): Myf5, MyoD, MRF4 и Myogenin (rev. Pownall et al. 2002).
Гены Meox, как было установлено, играют перекрывающую и существенную роль в сомитогенезе мыши (Mankoo et al., 2003). Помимо неспособности развития осевого скелета компаундные мутантные эмбрионы (Meox1-/- ;Meox2-/-) обнаруживают драматический мышечный фенотип, при котором большинство скелетных мышц отсутствует или уменьшено в размере, одновременно со снижением или отсутствием экспрессии Pax3, Pax7 и Myf5 в сомитах (Mankoo et al., 2003). И Meox1 и Meox2 экспрессируются в развивающихся зачатках конечностей и законсервированы у кур и мышей (Reijntjes et al., 2007a), это указывает на их роль в развитии мышц конечностей. Домен экспрессии Meox1 перекрывается с таковым MyoD, тогда как домен экспрессии Meox2 перекрывается с Pax3 , но не с MyoD, указывая тем самым на дифференциальную роль двух генов Meox (Reijntjes et al., 2007a). Во время миогенеза мыши было продемонстрировано, что Meox2 и Pax3 ко-экспрессируются в мигрирующих миобластах, т.к. они де-эпителизировались в дермомиотоме, мигрируют в мезенхиму зачатка конечности и накапливаются в виде предмышечных масс. Мыши, гомозиготные по нулевой мутации Meox2 имеют уменьшенную мышечную массу и у них отсутствуют специфические мышцы и редуцирована экспрессия Pax3 в предшественниках мышц конечностей (Mankoo et al., 1999).
Retinoic acid (RA) низкого мол. веса (300 Da), сигнальная молекула, которая, как известно, затрагивает формирование паттерна у эмбрионов позвоночных, включая формирование паттерна конечностей и оси тела (rev. Maden, 2001). Многие ткани, такие как глаза, задний мозг и спинной мозг зависят регулируемой во времени и пространстве поставки RA. Без этой поставки RA возникает множество врожденных дефектов. Парадоксально, воздействие на эту тонко регулируемую систему избытком RA приводит ко многим дефектам, сходными с теми, что возникают при отсутствии RA. Показано, что неадекватные уровни (избыток или недостаток) RA вызывают широкий круг уродств в развивающихся тканях. Дефицит RA ингибирует продольный рост костей (Wolbach et al., 1947) а избыток RA также ингибирует продольный рост костей за счет преждевременного слияния epiphyseal ростовой пластинки (Pease, 1962, Standeven et al., 1996). В заднем мозге избыток ретиноидов затрагивает преимущественно передние ромбомеры (r1-4), при этом передняя часть заднего мозга меняется в направлении более заднего сегментного фенотипа (Durston et al., 1989; Morriss-Kay et al., 1991; Conlon and Rossant, 1992; Marshall et al., 1992; Sundin and Eichele, 1992; Wood et al., 1994; Hill et al., 1995) , а дефицит ретиноидов затрагивает заднеие ромбомеры (r4-8) , при этом они никогда не дифференцируются (Gale et al., 1999; White et al., 2000). В развивающихся глазах RA обработанных эмбрионов рыбок данио и мышей обнаруживается anophthalmia (Reijntjes et al., 2007b; Sulik et al., 1995), состояние также обнаруживаемое при дефиците RA (Wilson et al., 1953).
Эндогенная all-trans-RA была впервые идентифицирована в зачатках конечностей кур при использовании HPLC (Thaller and Eichele, 1987) и компонентов ретиноидного сигнального пути, таких как CRABP-II, RARα, RARβ, она экспрессируется в доменах конечности, ассоциированных с образованием мышц (Momoi, et al., 1992). В зачатках конечностей кур, RALDH2, генерирующий RA энзим, экспрессируется в области презумптивных мышечных масс, сосудов и двигательных аксонов (Berggren et al., 2001); а в конечностях мыши становление пред-мышечных масс, управляемое с помощью HGF, как полагают, находится под контролем RALDH2 (Mic and Duester, 2003). RA рецепторы экспрессируются в мышечных клетках, RA рецепторы и MyoD активируют транскрипционную активность др. др., эти белки взаимодействуют физически и их транскрипционная ко-активация нуждается в RA receptor-MyoD комплексе, который соединяется с MyoD ДНК связывающими сайтами в мышечных клетках (Froeschle et al., 1998). У кур RARa экспрессируется во всех клетках зачатка конечности на ст. 20-22, непосредственно перед или в самом начале миогенной детерминации (Momoi et al., 1992).
Предыдущие исследования с использованием клеточных линий продемонстрировали, что RA индуцирует миогенную дифференцировку клеток, происходящих из линии rhabomyosarcoma крыс, клеток C2 миобластов и первичных сателлитных клеток взрослых кур, клеток, которые вносят вклад в постнатальный рост мышц (Arnold et al., 1992; Albagli-Curiel et al., 1993; Halevy and Lerman, 1993). Однако, RA , как было показано, также ингибирует накопление белка тяжелой цепи миозина в первичной эмбриональной мышечной культуре мыши (Xiao et al., 1995) и в зависимости от своей концентрации активирует или репрессирует миогенез в черепно-лицевой мезенхиме (Langille et al., 1989). Физиологическая роль ретиноидов во время морфогенеза конечностей остается неопределенной, т.к. большинство исследований было сфокусировано на поздних стадиях дифференцировки и морфогенеза (Robson et al. 1994) или использовались культуры диссоциированных мышц: разные концентрации RA, как сообщалось, увеличивают или уменьшают экспрессию MyoD в зачатках конечностей кур (Momoi et al., 1992). Подразделение мышечной массы и развитие индивидуальных сухожилий нуждается во взаимодействиях между мышцами и сухожилиями (Kardon, 1998; Rodriguez-Guzman et al., 2006) , а компоненты пути передачи сигналов RA были обнаружены в развивающихся мышцах и сухожилиях конечностей мышей и кур (Abu-Abed et al., 2002; Berggren et al., 2001; Rodriguez-Guzman et al., 2006).
Мы сконцентрировали наше внимание на возможной роли RA на ранних стадиях миогенной детерминации и дифференцировки. Сначала мы исследовали, существование потребности в передаче сигналов RA в миогенной дифференцировке и/или дифференцировке с помощью использования ингибитора синтеза RA, citral, на кусочках, прикладываемых к развивающимся конечностям кур, где экспрессировались соотв. гены. Во-вторых, мы анализировали профили экспрессии генов, проявляющихся в мышечных предшественниках конечностей (
Meox2, Pax3, Myf5 и MyoD) в ответ на избыток воздействия all-trans-RA (tRA). Отсутствие RA вызывало подавление экспрессии
Meox2, Pax3, MyoD, Myf5 и Meox1 и указывало на потребность в RA для индукции миогенеза. Мы наблюдали дифференциальную чувствительность к RA в зависимости от состояния дифференцировки клеток: при локальном подавлении экспрессии
Meox2 и Pax3 в предшественниках наблюдалось подавление экспрессии генов мышечной дифференцировки
MyoD и Myf5 , а также
Meox1. Более того оба воздействия и citral и RA вели к снижению миогенной дифференцировки. Т.к. миогенная дифференцировка происходит в согласии с дифференцировкой сухожилий, то мы также исследовали, отвечают ли предшественники сухожилий в конечностях сходным образом на RA как и миогенные предшественники на стадиях, когда их развитие осуществляется независимо один от др. Полученные результаты указывают на сложную чувствительность к концентрациям RA во время миогенеза и развития сухожилий.
Discussion
Передача сигналов RA важна для морфогенеза многих эмбриональных систем, включая задний мозг, сердце и глаза, но её роль во время ранних стадий миогенной спецификации и дифференцировки в конечностях неизвестна. Мы анализировали эффекты как ингибирования синтеза RA, так и воздействие избытка RA на миогенных предшественников конечностей после миграции и в начале дифференцировки.
Особенно нас интересовала расшифровка, какие из сигналов, что участвуют в дифференцировке и морфогенезе мышц конечностей, обеспечиваются посредством Meox гомеодоменовых транскрипционных факторов. Ранее мы описали роль семейства Meox гомеобоксных генов в развитии мышц конечностей (Mankoo et al., 2003), и мы продемонстрировали, что Meox2 является компонентом генного каскада, который регулирует скелетный миогенез в конечностях (Mankoo et al., 1999); и что в конечностях кур эти гены дифференциально экспрессируются: Meox2 экспрессируется в более широком домене дорсальной и вентральной части конечности, перекрывающемся с таковым Pax3, тогда как экспрессия Meox1 обнаруживается глубже в конечности и перекрывается с таковой MyoD, и имеется узкий регион перекрывания Meox1 и Meox2 (Reijntjes et al., 2007a). Здесь мы изучали чувствительна ли экспрессия Meox к передаче сигналов RA в развивающихся конечностях кур.
Несколько исследований изучали эффекты RA на миогенную дифференцировку в конечностях. Большинство исследований было сфокусировано на поздних стадиях дифференцировки и морфогенеза (Robson et al. 1994) или использовали культуру диссоциированных мышц: разные концентрации RA или увеличивают или уменьшают экспрессию MyoD в зачатках конечностей кур (Momoi et al., 1992). Воздействие citral и RA изменяло развитие muscle bellies дистальной части конечности, демонстрировало, что взаимодействия мышца-сухожилие частично обеспечиваются за счет апоптоза, регулируемого с помощью передачи сигналов RA (Rodriguez-Guzman et al., 2006). В зависимости от условий восстановленные RALDH2 мутантные мышиные эмбрионы показали аномальную миграцию предшественников мышц передних конечностей, но экспрессировали MyoD на ст. E11.5, это было расценено как доказательство того, что отсутствует потребность в RA для миогенной дифференцировки (Mic and Duester, 2004). Однако в данном исследовании проводилось восстановление за счет воздействия RA на беременных матерей, это приводило к возможности, что RA-зависимая экспрессия генов инициируется до того, как RA будет удалена. Более того, восстановленные конечности были маленькими и экспрессия MyoD занимала значительно меньший домен, чем в контрольных конечностях. Здесь мы показали, что потеря передачи сигналов RA в конечности влияет на дифференцировку миогенных конечностей. Обработка ингибитором RA, citral, приводила к подавлению экспрессии миогенных генов как в клетках предшественниках (Pax3 и Meox2, подавление Meox2 было более значительным, чем Pax3), так и в миобластах, готовых к дифференцировке (Myf5 и MyoD, подавление MyoD было более сильным, чем Myf5). Эти результаты согласуются с подавлением экспрессии нейрального Pax3 и миогенной дифференцировки гена Myogenin в сомитах в отсутствие RA, как было описано для vitamin A дефицитных перепелов (Wilson et al., 2004; Maden et al., 2000). Кроме того, исследования in vivo у эмбрионов рыбок данио показали, что передача сигналов RA необходима для начала миогенной дифференцировки в сомитах (Hamade et al., 2006). Снижение экспрессии MyoD может быть прямым, т.к. MyoD экспрессирующие клетки отвечают на RA и физически взаимодействуют с RXRs, чтобы сформировать ДНК связывающие комплексы (Froeschle et al. 1998), или может быть следствием негативной регуляции Pax3 и Myf5, хотя индукция MyoD в Meox2 мутантных конечностях происходит нормально, тогда как экспрессия Pax3 и Myf5 снижена (Mankoo et al., 1999). Итак, эти данные демонстрируют, что RA необходима для миогенной детерминации и дифференцировки, но дифференциальная реакция миогенных генов указывает но то. что потребность в сигналах RA сложная.
Анализ tRA обработанных зачатков передних конечностей показывает, что экспрессия Meox1 строго подавляется по всему зачатку конечности, тогда как экспрессия Meox2 затрагивается в меньшей степени, причем подавление происходит только вокруг места воздействия смоченного tRA кусочка. Это подтверждает перекрывающиеся и уникальные функции каждого из генов внутри доменов их экспрессии, причем Meox2 экспрессируется в клетках предшественниках, а Meox1 в более глубоких слоях дифференцированных клеток. Интересно, что экспрессия Meox1 и Meox2 также изменяется по-разному в трансплантированном нервном гребне в ответ на RA, экспрессия Meox1 активируется, а экспрессия Meox2 подавляется (Williams et al., 2004), показывая, что реакция Meox генов на RA также зависит от контекста, приводя к уникальности функций этих близко родственных генов.
Воздействие избытком tRA индуцирует локальное подавление Pax3 в конечностях кур способом, сходным с таковым для Meox2. Ко-экспрессия Meox2 и Pax3 в зачатках конечностей кур (Reijntjes et al., 2007a) и в мигрирующих миобластах конечности у мыши и подавление экспрессии Pax3 в этих же клетках в отсутствие Meox2 (Mankoo et al. 1999); строго подтверждает роль Meox2, вместе с Pax3, в спецификации мышечных клеток. Способом сходным с его влиянием на Meox1, избыток tRA вызывает сильное снижение экспрессии Myf5 и MyoD в развивающихся зачатках конечностей. Сильные эффекты как citral, так и tRA, приводящие к широкому подавлению генной экспрессии указывают на более высокую чувствительность к концентрациям citral и tRA, как и предполагалось, исходя из снижения концентрации химического воздействия по мере удаления от смоченного кусочка. Локальное подавление, напротив, указывает на то, что относительно высокие концентрации необходимы, чтобы вызывать эффект. Обработка и citral и RA ведет к тяжёлому снижению в формировании миозин-позитивных мышечных трубок. Дифференциальная чувствительность к RA, обнаруживаемая при экспрессии Pax3 предшественниками и экспрессии Myf5 миобластами, примечательна, т.к. известно, что Pax3 непосредственно регулирует экспрессию Myf5 в гипаксиальных частях сомитов и мышечных предшественниках конечностей (Bajard et al., 2006); и указывает на быстрые изменения в реакции на RA, т.к. клетки переключаются с состояния предшественников на дифференцировку. Экспрессия RA рецепторов в мышечных предшественниках (Froeschle et al., 1998) подтверждает эффекты RA на миогенез, мы наблюдали прямой негативный эффект.
Негативный эффект RA на экспрессию Myf5 и MyoD наблюдался после обработки RA первичных мышечных культур, приготовленных в результате диссоциации мышц задних конечностей новорожденных мышей, MyoD транскрипты были снижены. а транскрипты Myf5 и MRF4 не обнаруживались (Xiao et al., 1995). используя первичные диссоциированные культуры из 13.5 dpc зачатков конечностей мышей и мышц задних конечностей новорожденных обработанных 10-5 M RA, эти авт. также продемонстрировали, что воздействие RA ведет к драматической потере экспрессии MyHC. Сходным образом у кур micromass культуры клеток, приготовленные из зачатков передних конечностей ст. 20, и обработанные RA давали меньше дифференцированных миогенных клеток (Robson et al., 1994). В данной работе мы показали, что воздействие RA ведет к 43% снижению MyHC позитивных клеток в micromass культурах клеток кур. Эти данные строго указывают на то, что дифференцирующиеся миобласты конечностей обладают более высокой чувствительностью и поэтому разными реакциями на передачу сигналов RA, чем предшественники. Сходным образом миогенная дифференцировка обнаруживает сходную реакцию в сомитах vitamin A дефицитных эмбрионов перепела, у которых отсутствует RA, подавлена экспрессия Myogenin, но не экспрессия Myf5 (Maden et al., 2000). Это также подтверждается тем, что миогенная реакция клеток rhabdomyosarcoma на RA зависит от их статуса дифференцировки (Ricaud et al., 2005), взаимосвязь между состоянием дифференцировки и чувствительностью к RA также описана в клетках рака яичников (Caliaro et al., 1994).
RA рецепторы соединяются с соотв. сайтами связывания посредством гетеродимеризации с RXR белками. Мы анализировали ряд сайтов связывания RXR в последовательности в 200 bp выше и в 100 bp ниже точки старта транскрипции каждого мышиного гомолога миогенных генов, используя Genomatix MatInspector software (Cartharius et al., 2005). Интересно, что ряд RXR сайтов обнаруживает позитивную корреляцию с чувствительностью к действию citral (MyoD>Meox2>Pax3> Meox1>Myf5), однако эта корреляция не распространяется на реакцию на обработку tRA; указывая тем самым, что действие RA на ранних стадиях миогенеза сложное.
Потеря генной экспрессии не обусловлена не-специфическими эффектами на клеточную гибель, а способностью индуцировать экспрессию Cyp26 и дифференциальной реакцией на избыток RA. Более того, tRA вызывает эктопическую экспрессию Cyp26A1 и Cyp26B1 в мезенхиме зачатка конечности, то ново, т.к. до этого полагали, что избыток tRA д. индуцировать только экспрессию Cyp26 в др. доменах экспрессии Cyp26, но не в регионах, где Cyp26s никогда не экспрессируются, напр., эктопическая экспрессия Cyp26A1 может быть индуцирована в развивающейся васкулатуре, месте экспрессии Cyp26B1 (Reijntjes et al., 2005).
Развитие мышц нуждается в тесно интегрированной дифференцировке как миогенных, так и предшественников ассоциированной с мышцами соединительной ткани. RALDH2, главный энзим, генерирующий RA, экспрессируется в предшественниках соединительной ткани, двигательных нейронах и сосудах конечностей кур, но не в миобластах (Berggren et al. 2001). Компоненты передачи сигналов RA выявлены в развивающихся сухожилиях и мышцах мышей (AbuAbed et al., 2002) кур (Rodriguez-Guzman et al., 2006), демонстрируя, что RA играет роль на более поздних стадиях развития сухожилий. RA участвует в регуляции морфогенеза дистальных мышц и сухожилий с помощью апоптоз-зависимого механизма (Rodriguez-Guzman et al., 2006). Однако роль RA в предшественниках сухожилий неясна. Мы наблюдали подавление экспрессии специфичного для сухожилий гена Scleraxis в ответ как на избыток RA, так и подавление передачи сигналов RA. Важно, что эта потеря экспрессии Scleraxis не зависит от эффектов RA митогенные и сухожильные предшественники, развивающиеся сначала независимо (Kardon, 1997), указывая на механизм, который координирует дифференцировку этих тканей.
To conclude, we have shown that RA signalling is essential for maintenance of premyogenic cells and myogenic commitment within the limb bud. Excess RA signalling inhibits myogenic differentiation suggesting that a gradient of RA activity controls the rate of myogenic commitment. We show that RA signalling is essential for the early stages of myogenesis and tendon development, RA could also modulate the rate of myogenic differentiation by interactions with tendons and the vascular system at later stages of morphogenesis. We have shown that both inhibition and excess RA can negatively effect myogenic differentiation emphasizing the importance of an exquisitely controlled local concentration of RA. Moreover we have shown the response to RA is dependent on the state of differentiation of limb muscle precursors.
Сайт создан в системе
uCoz