Эти эксперименты также установили присутствие избирательных перекресно-репрессивных взаимодействий между парами белков из классов I и II, экспрессирующихся в соседних доменах предшественников (Figure 2A). Впервые это стало очевидным для класса II белка Nkx2.2 и для класса I белка Pax6 (Ericson et al, 1997a, 1997b; Briscoe et al, 2000). Наблюдалось, что Nkx2.2 расширяет свою экспрессию дорсально у эмбрионов с отсутвтвием Pax6. Это указывает на то, как система может оперировать, дальнейшие эксперименты с избыточностью функции показали взаимную перекрестную репрессию между Pax6 и Nkx2.2. Впоследствии сходные наблюдения были сделаны и для др. пар белков классов I и II (Briscoe et al, 2000; Vallstedt et al, 2001). Итак, полученные данные показали, что перекрестная репрессия между парами белков классов I и II устанавливает DV границы генной экспрессии, предопределяя тем самым позиции, в которых разные субтипы нейронов генерируются. Перекрестно-репрессивнрые взаимодействия также предоставляют правдоподобное объяснение подобным переключению реакциям генов на градиент Shh. Такой механизм объясняет превращение градиентного сигнала по типу всё или ничего изменение генной экспрессии, он существенен для функции морфогена. Более того, принцип перекрестно-репрессивных взаимодействий, наблюдаемый в нервной трубке, напоминает механизмы, используемые в др. развивающихся тканях, таких как формирование передне-заднего паттерна у эмбрионров Drosophila (Small and Levine, 1991).
Хотя способность Shh индуцировать удаленные субтипы нейронов концентрационно-зависимым способом подтверждает, что Shh действует непосредственно в дальних пределах, чтобы контролировать генную экспрессию, но нет непосредственных наблюдений in vivo градиента белка Shh. Возможно потому, что Shh осуществляет свой дально-действующий эффект путем индукции помежуточного сигнала, чтобы распространить позиционную информацию по нервной трубке. В лаб. Jessell показали в серии изящных генетических экспериментов на Drosophila,, что Patched (Ptc) является рецептором для Hh и что связывание Hh с Ptc ограничивает перемещение Hh по ткани (Chen and Struhl, 1996). Они продолжали конструировать мутантные формы Ptc, которые действовали как доминантные ингибиторы передачи сигналов как у Drosophila так и позвоночных. Мозаичная экспрессия версии позвоночной мутантной Ptc конструкции в нервной трубке ингибировала передачу сигналов в трансфицированных клетках и приводила к подавлению клеточных типов, обычно обнаруживаемых в вентральной части нервной трубки (Briscoe et al, 2001). Это указывало на то, что Shh действует непосредственно в широких пределах, чтобы контролировать генную экспрессию и клеточные судьбы в нервной трубке. Более того, мною было отмечено, что блокада передачи сигналов приводит к более дорсальному позиционированию клеток, реагирующих так, как если бы они подверглись действию высоких концентраций Shh. Это указывало на то, что подобно с Hh у Drosophila, механизм обратной связи ограничивает распространение Shh в нервной трубке; соотв. блокирование передачи сигналов увеличивает пределы действия Shh. э о заключение было в дальнейшем подтверждено в работе из лаб. Andrew McMahon's, включая недавнюю прямую демонстрацию градиента Shh в нервной трубке (Gritli-Linde et al, 2001; Jeong and McMahon, 2005; Chamberlain et al, 2008). В целом исследования строго свидетельствуют в пользу модели передачи сигнала и указывают на то, что Shh действует на расстоянии в нервной трубке. Вместе с доказательством его зависимой от концентрации активности это подтверждает, что передача сигналов Shh в нервной трубке удовлетворяет строгому определению морфогена.
Эти исследования установили градированную передачу сигналов Shh в нервной трубке. Это вызывает вопрос, как клетки передают информацию о внешней концентрации Shh посредством пути передачи сигналов, чтобы регулировать дифференциальную экспрессию генов в ядре. Это вопрос 'information processing' несмотря на некоторые интересные и успешные второстепенные находки всё ещё остается основным занятием моей лаб.
The Gli-tzy ways of Shh signalling
Мы сфокусировались на вопросе, как градированная информация от передачи сигналов Shh воспринимается и передается чувствительным клеткам. Внутриклеточная передача сигналов от Shh зависит от двух трансмембранных белков: Ptc1, уже упоминавшегося, рецептора, который соединяется с Hh белками, и Smoothened (Smo), который ответственен за трансдукцию сигналов Hh внутри клетки (for reviews, see Ingham and McMahon, 2001; Varjosalo and Taipale, 2008). В отсутствие Shh, Ptc1 ингибирует активность Smo, а связь Shh с Ptc1 освобождает от этого ингибирования и делает возможной внутриклеточную передачу сигнала. Точный механизм передачи сигнала ниже Smo остается неясным и чрезвычайно интересен Однако доказательства указывают на то, что передача сигнала связана с регуляцией семейства транскрипционных эффекторов, содержащих цинковые пальчики (Gli1, 2 и 3). Все три гена Gli экспрессируются в нервной трубке и проводится несколько исследований, чтобы проверить их функции в формировании паттерна нервной трубки (Jacob and Briscoe, 2003; Ruiz i Altaba et al, 2003). Michael Matise в Alex Joyner's лаб. показал, что целенаправленная делеция Gli2 у эмбрионов мышей(Matise et al, 1998) ведет к неспособности генерации вентральной пластинки нервной трубки и соседнего домена предшественников V3 нейронов: т.е. типов клеток, индуцируемых самими высокими концентрациями Shh. Одновременно с потерей этого типа клеток, обнаруживается вентральная экспансия в продукции соседних MNs, тогда как классы нейронов, расположенные дорсальнее MNs оставались неизменными. Компаундные мутанты с отсутствием Gli1 и Gli2 обнаруживают более тяжелые дефекты, чем мутанты Gli2-/- (Park et al, 2000); однако эти эмбрионы всё ещё продуцируют MNs и интернейроны дорсальнее MNs. то указывает на то, что Gli2, с частично перекрывающиеся помощью от Gli1, необходим для спецификации клеточных типов,которые нуждаются в наивысших уровнях передачи сигналов Shh. Однако остается открытым вопрос относительно роли Gli3 и может ли активность Gli участвовать в контроле всех реакций на Shh.
Despina Stamataki вместе с Johan Ericson тестировал участие активности Gli и функции Gli3 в формировании нервного паттерна, используя укороченную версию Gli3, которая лишена доменов активации транскрипции, но сохраняет свою ингибирующую функцию, чтобы блокировать активацию транскрипции всех Gli в нервной трубке эмбрионов кур. Подобно результатам с мутантной конструкцией Ptc1, которая ингибировала передачу сигналов, укороченный Gli3 вызывал вентрально-дорсальный сдвиг в качественных характеристиках клеток предшественников и одновременно неспособность генерировать MNs и вентральные интернейроны (Persson et al, 2002; Meyer and Roelink, 2003). Это подтвердило чрезвычайную важность активности Gli в обеспечении позиционной информацией клеток, отвечающих на градиентную передачу сигналов Shh. Gli3 , по-видимому,функционирует прежде всего как ингибитор передачи сигналов Shh в нервной трубке. Подтверждением этой идеи является то, что в отсутствие Gli3, домены предшественников, расположенные в промежуточной области нервной трубки, распространяются дорсально, одновременно со сдвигом в качественных характеристиках нейронов, генерируемых в этой области. Этот фенотип исправляется у мышей, несущих целенаправленно измененный аллель Gli3, полученный в лаб. Uli Ruther's. Этот аллель кодирует только укороченную изоформу Gli3 (Bo"se et al, 2002), эквивалентную протеолитически измененному Gli3. Более того, устранение функции Gli3 у Shh-/- эмбрионов частично восстанавливает экспрессию некоторых транскрипционных факторов вентральных предшественников, которые обычно теряются у мутантных Shh эмбрионов (Litingtung and Chiang, 2000). Это подтверждает идею, что лишь репрессирующая активность Gli3 необходима в нервной трубке.
Хотя вентральные типы клеток генерируются у двойных мутантов Shh;Gli3 формирование паттерна в чем-то нарушено, в особенности строгая DV организация характеристик нормальной нервной трубки, что менее очевидно (Litingtung and Chiang, 2000). Это подтверждает две вещи. Во-первых, индукция наиболее вентральных типов клеток происходит в отсутствие передачи сигналов Shh до тех пор, пока устранена репрессивная активность Gli3 Во-вторых, др. внешние сигналы могут предоставлять позиционную информацию, хотя и менее аккуратно, в вентральную часть нервной трубки, когда передача сигналов Shh устранена. Т.о., без транскрипционного пускового сигнала от Gli белков клетки лишены позиционной информации, предоставляемой передачей сигналов Shh, несмотря на это перекрестно=репрессивные взаимодействия между транскрипционными факторами предшественников остаются. Следовательно, внутри индивидуальных предшественников стохастические отклонения или др. внешние сигналы могут детерминировать генную экспрессию. В этой ситуации стохастические отклонения или проявление др. внешних сигналов являются способом, c помощью которого соседние клетки могут воспринимать разные позиционные качественные значения, приводящие к существованию в нервной трубке перемешанных клеточных характеристик. В этом контексте интересно отметить, что передача сигналов BMP, которая исходит от дорсального полюса нервной трубки влияет на реакцию предшественников в вентральной части нервной трубки на Shh. Обработка эксплантов нервной пластинки фиксированными концентрациями Shh в BMPs приводит к вентрально-дорсальному сдвигу в предшественниках и в качествернных характеристиках субтипов нейронов (Liem et al, 2000). Напроив, белки, ингибирующие BMP, вентрализуют реакцию клеток нервной пластинки на набор концентраций Shh (Liem et al, 2000). Передача сигналов BMP следовательно, может участвовать в установлении DV паттерна может оказывать существенное влияние нагенную экспрессию у Shh;Gli3 двойных мутантных мышей.
Заключение, что Gli белки действуют ниже Shh, чтобы контролировать формирование вентрального паттерна посредством регуляции транскрипции генов мишеней, ведет к привлекательной модели, объясняющей активность морфогена Shh. В этой модели градированная передача сигналов Shh индуцирует градиент активности Gli путем всё большего ингибирования Gli репрессорной активности и усиления Gli активаторной функции (Jacob and Briscoe, 2003). Чтобы протестировать эту модель Despina вместе с Fausto Ulloa плучили серию доминантно активных Gli конструкций, каждая продуцировала разные уровни транскрипционной активности. В согласии с моделью эксперименты с избыточной функцией с этими конструкциями подтвердили, что прогрессивные изменения в уровне активности Gli оказались достаточными, чтобы соперничать с паттерн-формирующей активностью градированной передачи сигналов Shh (Stamataki et al, 2005). Это указывает на то, что во время развития нервной трубки продуцируется градиент транскрипционной активности Gli, который зеркально отражает градиент передачи сигналов Shh. Т.о., уровень активности Gli, продуцируемый в чувствительных клетках, д. быть пропорциональным концентрации Shh, которая на них воздействует.
В этой модели 2-3-х кратные различия во внеклеточной концентрации Shh достаточны, чтобы переключить профиль генной экспрессии, они преобразуются в сходные малые различия в уровне активности Gli. Это предполагает, что небольшие, если вообще, происходят амплификации сигнала во время сигнальной трансдукции. Анализ др. морфогенов сигнальных путей (Shimizu and Gurdon, 1999; Stathopoulos and Levine, 2002) привел к сходному заключению. Напр., в серии элегантных исследований John Gurdon с коллегами, изучавшими индукцию c помощью Activin во время спецификации мезодермы пришли к заключению, что трехкратные различия в абсолютном количестве рецепторов, оккупируемых Activin обеспечивают трехкратнрые различия в уровне транскрипции SMAD2 в ядре и этого достаточно, чтобы сделать возможным выбор между индукцией двух генов, Xbra и Xgsc (Dyson and Gurdon, 1998; Shimizu and Gurdon, 1999). Т.о., очевидо, что общим свойством морфогенов является то, что различия в силе сигнала непосредственно транслируются без амплификации в ядро. Этот механизм контрастирует с типом стратегии сигнальной трансдукции, напр., с использованием киназных каскадов, которые амплифицируют сигнал во время внутриклеточной передачи приводя к существенным нижестоящим различиям в сигнале.
Taking some time
Модель безусловно упрощена. на игнорирует динамическую природу реакции клеток на передачу сигналов Shh. Это подчеркивается исследованиями передачи сигналов Shh в развивающихся конечностях, показавшими что продолжительность передачи сигналов Shh помимо концентрации Shh, влияет на формирование паттерна (Ahn and Joyner, 2004; Harfe et al, 2004). Eric Dessaud оценивал влияние продолжительности на интерпретацию передаваемых сигналов Shh в нервной трубке. Он снова обратился к технике использования эксплантов нативной нервной ткани , чтобы ответить, как развивается реакция клеток на Shh во времени (Dessaud et al, 2007). Он установил, что индукция одного из транскрипционных факторов предшественников Nkx2.2, который нуждается в более высоких концентрациях Shh, чем в предшественниках MN маркер Olig2, он нуждается и в более продолжительной индукции, чем Olig2. Более того, концентрации Shh, которые индуцируют Nkx2.2, вызывают временную экспрессию Olig2. Эта in vitro реакция на Shh была параллельной таковой in vivo благодаря последовательному началу экспрессии Olig2 и Nkx2.2.
Чтобы исследовать причину такой временной зависимости реакции Eric анализировал исходы пути сигнальной трансдукции Shh путем подгонки метода репортеров для активности Gli в эксплантах, полученных Fausto Ulloa. Это позволило ему измерить уровни активности Gli, индуцируемые определенными концентрациями Shh в специфическое время (Figure 3A). Результаты этих экспериментов показали, что чувствительность клеток к передаче сигналов Shh прогрессивно снижается. Клетки сначала появляются как очень чувствительные к воздействию лиганда. В результате низкие концентрации Shh были достаточны, чтобы продуцировать высокие уровни активности Gli. С увеличением времени клетки становятся десенсибилизированными к сигналам Shh ; поэтому необходимо, чтобы концентрации Shh обязательно достигали наивысших уровней, чтобы обеспечить повышенную активность Gli. Как результат разные концентрации Shh генерируют внутриклеточный сигнал для разных периодов времени, так что продолжительность передачи сигналов пропорциональна концентрации Shh. Эти результаты привели нас к предположению, что механизм 'temporal adaptation' трансформирует внеклеточные концентрации морфогена Shh в ограниченные временем периоды сигнальной трансдукции, так что продолжительность передачи сигналов оказывается пропорциональной концентрации лиганда(Dessaud et al, 2007, 2008).
Figure 3.
Figure 3 :
A temporal adaptation mechanism interprets graded Shh signalling. (A) Cells exposed to a high concentration of Shh ([Shh]H) sustain high levels of Gli activity for a prolonged period of time and induce Nkx2.2. By contrast, although exposure to a lower concentration of Shh ([Shh]L) is initially able to induce high levels of Gli activity, these levels are not maintained and the cells express Olig2. The decrease in Gli activity indicates that cells adapt to the concentration of Shh over time. (B) Upregulation of Ptc1, and possibly other negative regulators of the pathway such as Hhip1, contributes to the gradual adaptation of cells to ongoing exposure to Shh. Initially (t=tau) the level of Ptc1 is low, thus even a low concentration of Shh is sufficient to bind the available Ptc1 and initiate high levels of signalling. The transcriptional upregulation of Ptc1 by Shh signalling results in the gradual accumulation of Ptc1 protein in responding cells (t=tau+1). If the cells are exposed to a high concentration of Shh, sufficient ligand will be available to bind the induced Ptc1; signal transduction will therefore be maintained. By contrast, in cells exposed to low concentration of Shh, unliganded Ptc1 will begin to build up; this will inhibit signal transduction.
View full figure (239 KB)
Эти результаты ставят вопрос, как клетки превращают внеклеточные концентрации в пропорциональные периоды сигнальной трансдукции. Счастливым образом функция Ptc1 представляет объяснение постепенной десенсибилизации клеток с началом передачи сигналов Shh (Figure 3B). Ptc1, будучи рецептором и негативным регулятором Shh пути, является транскрипционной мишенью белков Gli (Goodrich et al, 1996; Marigo and Tabin, 1996). В ответ на передачу сигналов Shh клетки неуклонно активируют Ptc1, как и др. ингибиторы передачи сигналов Shh, запуская петлю негативной связи по отнрошению к пути. Это означает, что повышенные концентрации Shh необходимы, чтобы блокировать ингибирующую активность накапливающегося Ptc1. В соответствии с этим ингибирование Ptc1 c помощью siRNAs приводит к тому, что низкие концентрации Shh оказываются достаточными для индукции экспрессии маркеров, обычно ассоциирующих только с высокими концентрациями лиганда (Dessaud et al, 2007). Это указывает на критическую клеточно автономную роль Ptc1 в интерпретации градированной передачи сигналов Shh, дополняя предыдущие исследования, показавшие, что роль Ptc1 заключается в контроле за распределением лиганда (Chen and Struhl, 1996; Jeong and McMahon, 2005).
Эти данные оказались очень сходными с механизмом бактериального хемотаксиса (Wadhams and Armitage, 2004). Хемотаксис также базируется на негативной петле обратной связи, которая контролирует продолжительность внутриклеточной передачи сигналов, чтобы воспринимать внешний градиент. В самом деле, постепенная адаптация клеток к внеклеточным сигналам , как полагают, позволяет воспринимать и преобразовывать концентрационные пределы сигналов в разные ситуации (Matthews and Reisert, 2003). Преобразование концентраций лиганда в соотв. продолжительность внутриклеточной передачи сигналов предлагает альтернативу установленным механизмам передачи сигналов морфогена: механизм, который очень сходен с гипотезой 'sequential cell context', предложенной Pages and Kerridge (2000). Более того, адаптационный механизм объясняет, почему и количество и продолжительность экспозиции Shh важны для клеточной реакции. Это может быть приложимо и к др. тканям, таким как зачатки конечностей, формирование паттерна которых также зависит от времени и концентрации передаваемых сигналов Shh (Harfe et al, 2004). Это кажется вполне приемлемым, что эволюция выбирает сравнимые стратегии для измерения концентраций внешних факторов в очень разных ситуациях и для очень разных целей.
Модель вместе с исследованиями др. систем указывает на то,что традиционное определение морфогена нуждается в пересмотре. В узкой интерпретации French Flag Model, чувствительные клетки ткани считаются пассивными реципиентами позиционной информации, предоставляемой градированными сигналами (Jaeger and Reinitz, 2006; Jaeger et al, 2008). это не согласуется со случаем передачи сигналов Shh в нервной трубке. Реакция клеток на передачу сигналов Shh , по-видимому, позитивная регуляция Ptc1, является фундаментальной по отношению к генерации реакций на морфоген. Кроме того регуляторные взаимодействия между транскрипционными факторами, которые транскрипционно контролируются c помощью Shh в предшественниках, являются важными для генерации соотв. паттерна нейрогенеза в нервной трубке. Это подтверждает мнение, что позиционная информация в вентральной части нервной трубки является частично как внезапно возникшее свойство, которое базируется как на градиенте лиганда, так и на реакции клеток мишеней. Итак, сигнал и ткань сотрудничают, чтобы продуцировать морфоген. Экспериментальные находки для др. морфогенов и тканей также ведут к модификациям и выработке конвенционного определения морфогена (Jaeger and Reinitz, 2006, Jaeger et al, 2008).
Модель также ставит дополнительные вопросы. Каковы относительные вклады продолжительности и уровня передачи сигналов Shh-Gli для спецификации каждого из доменов предшественников, которые зависят от передачи сигналов Shh? Каковы соотв. геномные мишени для передачи сигналов Shh и каковы разные продолжительности или количества активностей Gliгенную экспрессию? Каковы молекулярные механизмы, которые соединяют и регулируют чувствительные гены в предшественниках? Какие чувствительные гены специфицируют качественные особенности субтипов нейронов? Какие пределы экспериментальных подходов - генетических, молекулярных, imaging и модельных - будут необходимы. В частности, данные подчеркивают важность методов, которые делают возможными измерения активности ключевых компонентов сигнальных путей и методы, которые манипулируют с продолжительностью активности этих компонентов. Помимо формирования DV паттерна передача сигналов Shh также влияет на др. свойства нервных клеток, такие как жизнеспособность и пролиферация. Как Shh достигает этого и как рост и формирование паттерна нервной трубки интегрированы, изучено плохо. Однако реагенты и техника, доступные сегодня, д. позволить решить этот вопрос. Наконец, как это связано с др. сигнальными путями? Некоторые секретируемые др. молекулы важны для формирования паттерна нервной трубки и они, по-видимому, в значительной степени обеспечивают взаимодействие между путями, в которых активированы. В большинстве случаев детали механизмов и вклады их в нейральное развитие ещё предстоит определить. Насколько механизм временной адаптации, выявленный здесь, имеет отношение и к др. градированным сигналам, или насколько интерпретация разных морфогенов базируется на самостоятельных стратегиях?
Сайт создан в системе
uCoz