Подтверждение этой гипотезы и информация об идентичности miRNAs, которые могут обеспечивать этот процесс получены с помощью предсказанных сайтов мишеней для miRNA в 3'UTRs из xOtx2, xVsx1 или xOtx5b Cremisi and co-workers. Они сообщили, что многочисленные miRNAs (although none of the known or putative mammalian retinal progenitor-enriched miRNAs listed in Table 1), как и было предсказано, находят эти транскрипты. 4 из этих miRNAs, включая miR-17-5p, miR-34, miR-138 и miR-432, как и прогнозировалось, воздействуют на все три транскрипта. Ни один из этих сайтов мишеней, однако не был законсервирован в гомологах этих генов млекопитающих. Более того, существуют вполне достаточные прецеденты зависимого от клеточного цикла действия miRNAs, с несколькими miRNAs млекопитающих, находящихся по непосредственным транскрипционным контролем p53 и c-myc (Mendell,2005; He et al.,2007). Хотя и является привлекательной эта модель, но всё ещё не известно, экспрессируются ли какие-либо предполагаемые регуляторные miRNAs в родоначальниках сетчатки
, участвуют ли они в контроле трансляции гомеодоменовых факторов сетчатки.
Неожиданно, определенные экспрессирующиеся в сетчатке miRNAs обнаруживаются на высоких уровнях в виде не преобразованных предшественников. MicroRNAs первоначально транскрибируются в виде pri-miRNA с помощью RNA polymerase II и подвергаются сплайсингу и полиаденилированию подобно белок-кодирующим мРНК. Эти нативные pri-miRNAs, однако, обычно быстро расщепляются до в 60-bp шпилечных pre-miRNAs с помощью комплекса Drosha. За исключением ограниченного количества интронами кодируемых miRNAs (Ruby et al.,2007), большинство pri-miRNAs легко обнаруживаются только в клетках, дефицитных по Drosha (Mendell,2005). Наконец, pre-miRNAs расщепляются в цитоплазме с помощью Dicer. В относительно немногих случаях, где pri-miRNAs легко обнаруживаются, такие как BIC/miR-155 в иммунных клетках, pri-miRNA значительно менее многочисленны, чем соотв. зрелые miRNA (Eis et al.,2005; Kluiver et al.,2005).
Напротив, pri-miR-124a-1 (ранее описанная как RNCR3) составляет 0.2% от всех полиаденилированных транскриптов в постнатальной сетчатке, это делает ей более многочисленной, чем beta-actin мРНК (Blackshaw et al.,2004). Проверка общедоступных данных SAGE показала, что эта pri-miRNA столь же многочисленна в сетчатке человека. Анализ данных SAGE также показал, что pri формы miR-124a-2 и miR-9 многочисленны в сетчатке человека и мыши, хотя и в меньшей степени, чем pri-miR-124a-1 (Sharon et al.,2002; Blackshaw et al.,2004). Напротив, pri-форма очень многочисленного в сетчатке кластера miR-96/182/183 едва обнаружима даже с помощью RT-PCR, так что количество pri-miRNAs вряд ли отражает общую нехватку процессинга miRNA в сетчатке (Xu et al.,2007). Сегодня становится ясным, что роль, если таковая сущестует, в отношении количества pri-miRNAs может иметь значение в сетчатке, хотя высокие уровни др. не преобразованных pri-miRNAs недавно наблюдали в эмбриональных тканях и раковых клетках (Thomson et al.,2006), и это привело к предположению, что процессинг pri-miRNA с помощью Drosha может регулироваться при определенных условиях (Wulczyn et al.,2007). Недавнее открытие, что активированные Smads могут ассоциировать с Drosha комплексом и регулировать его активность, указывают на возможный механизм, с помощью которого это может осуществляться. Учитывая известную роль передачи сигналов BMP/TGFbeta в регуляции различных аспектов развития сетчатки (Davis et al.,2000; Sakuta et al.,2001; Kim et al.,2005), это может оказаться возможным механизмом действия этих факторов, которые были исследованы.
MRNA-LIKE NCRNAS
Opposite Strand Transcripts (OSTs)
Homeodomain-associated opposite strand transcripts (HOSTs).
Широко распространено для белок-кодирующих генов транскрибироваться в ориентации голова-к-голове, при этом места старта транскрипции рассматриваемых генов разделены менее нескольких тысяч пар оснований и транскрипция происходит в противоположных направлениях. Крупно-масштабный анализ микромассивов у дрожжей и человека показал, что такие гены часто регулируются совместно, как и можно было ожидать , учитывая, что они обладают общими 5' cis-регуляторными последовательностями (Cohen et al.,2000; Trinklein et al.,2004). Неожиданная находка возникла в результате крупно-масштабного секвенирования кДНК, которые являются мРНК-подобными транскриптами, также часто транскрибируемыми голова-к-голове или в дискордантной ориентации с белок-кдирующими генами (Carninci et al.,2005; Katayama et al.,2005). Как полагают, в некоторых из этих случаев не сплайсированные и не преобразованные зрелые мРНК с этих пар перекрываются, существует обычно непонятный механизм спаривания гомологичных оснований между двумя транскриптами. Их более подходяще было обозначить как мРНК-подобные ncRNAs или более широко как opposite-strand transcripts (OST) скорее, чем антисмысловые транскрипты, как иногда они называются.
Первый OST был идентифицирован как соответствующий белок-кодирующему гену, который играет важную роль в развитии сетчатки, это был Six3-ассоциированный OST, первоначально наз. RNCR1 (Blackshaw et al.,2004). Анализ SAGE ярлыков Six3 и RNCR1 показал, что эти два транскрипта обнаруживают почти идентичные паттерны временной экспрессии, при этом экспрессия обеих РНК была высокой в родоначальниках сетчатки и снижалась драматически в конце ретинального нейрогеназа. Системные исследования OSTs, ассоциированных с ретинальными гомеодоменовыми факторами, подтвердили явную экспрессию Six3OS транскриптов и идентифицировали 7 др., ассоциированных с гомеодоменом транскриптов с противоположной нити (или HOSTs) партнера (Alfano et al.,2005). Эти HOSTs были названы Pax6OS, Six3OS, Six6OS, Vax2OS, CrxOS, Otx2OS, Pax2OS, и RaxOS по их партнерским транскрипционным факторам Pax6, Six3, Six6, Vax2, Crx, Otx2, Pax2 и Rax, соотв. Экспрессия в сетчатке каждого HOST была подтверждена с помощью reverse transcriptase (RT)-PCR анализа. Перекрывание в экзонных и интронных последовательностях иногда наблюдается между 5' концом HOSTs и некоторыми изоформами, ассоциированными с кодирующими мРНК, хотя определенно это не характерно для всех HOSTs или гомеодоменовых транскриптов. Напр., считается, что одна альтернативная 5' изоформа Six3 обнаруживается а интронной последовательности SixOS, ясно из анализа полной длины EST и CAGE тэгов (Geng et al.,2007; Rapicavoli and Blackshaw, unpublished data), что это довольно редкая изоформа Six3 и что большинство широко используемых точек старта транскрипции для Six3 располагается на несколько kilobases ниже общераспространенной точки старта для Six3OS. Исследование EST данных показало, что HOSTs k.sxyj подвергаются сплайсингу и полиаденилированию и наблюдается иногда сложный альтернативный сплайсинг; это особенно выражено для Six3OS, которые обнаруживают. по крайней мере, 10 разных сплайс-форм (Alfano et al.,2005; Geng et al.,2007).
Большинство из этих HOSTs лишены какого-либо белок-кодирующего потенциала и обнаруживают относительно невысокую гомологию первичных последовательностей среди видов млекопитающих, несмотря на это часто обнаруживаются в синтеничных позициях. Большинство, такие как Six3OS, подвергаются такому экстенсивному альтернативному сплайсингу, что мало общих последовательностей обнаруживается среди различных изоформ. Очень возможно, что они представляют собой подлинные ncRNAs. Самый длинный транскрипт Six6OS, однако, по-видимому, кодирует эволюционно законсервированный белок с неизвестной функцией, хотя некоторые полной длины альтернативные изоформы этого OST, по-видимому, являются некодирующими (Alfano et al.,2005). Др. интересным исключением является CrxOS, который кодирует высоко дивергентный гомеодоменовый белок, хотя он, как полагают, имеет пониженную способность белок кодирующего потенциала относительно экспериментально проверенных ORFs (Alfano et al.,2005). У человека, атипичный гомеодоменовый Tprx1 обнаружен в качестве OST для Crx (Booth and Holland,2007). Эти два предполагаемых белок кодирующих гена не обнаруживают первичной гомологии др. к др. кроме принадлежности к гомеодоменовому сверхесемейству. Поэтому возможно, что некоторые HOSTs могут также содержать ORFs, но что эти ORFs находятся под высоким давлением дивергентной селекции и не выявляются посредством филогенетического анализа, обычно используемого для идентификации белок-кодирующих генов. Возможно также, что некоторые OSTs могут кодировать как биологически активные ncRNAs, так и белки, как в случае базирующегося на РНК steroid receptor coactivator Sra-1 (Chooniedass-Kothari et al.,2004). Функциональные исследования, нацеленные на распознание этих двух возможностей необходимы, чтобы непосредственно установить эту возможность.
Как паттерн клеточной экспрессии, так и уровень экспрессии РНК данной HOST РНК и её партнера гомеодоменового транскрипционного фактора может быть или конкордантным или дискордантным в сетчатке. Уровни экспрессии РНК как HOST, так и ассоциированных с ними кодирующих последовательностей могут быть практически идентичными, как демонстрируют Six3 и Six3OS (Fig. 1). Уровни РНК HOST транскрипта могут быть также значительно менее многочисленными, чем кодирующие транскрипты, как это видно по Six6 и Six6OS. Паттерны клеточной экспрессии HOSTs и кодирующих последовательностей могут аналогично конвергировать или дивергировать. Six3OS в основном ко-экспрессируется с Six3 в сетчатке и клетках предшественниках диэнцефалона, тогда как некоторые др. регионы развивающегося мозга экспрессируют Six3, но не экспрессируют Six3OS (Geng et al.,2007). В зрелой сетчатке, разные Six3OS сплайс-формы обнаруживают отличающуюся экспрессию, при этом некоторые изоформы коэкспрессируются с Six3 в клетках ретинальных ганглиев, тогда как др. ограничиваются Muller глией, которая не экспрессирует Six3 (Blackshaw et al.,2004; Geng et al.,2007). Др. HOSTs экспрессируются в очень отличающихся клеточных паттернах от своих партнерских гомеодоменовых транскрипционных факторов. И CrxOS и Otx2OS экспрессируются прежде всего в амакринных и ганглиолярных клетках во взрослой сетчатке, тогда как Crx и Otx2 экспрессируются в фоторецепторах и биполярных клетках и т.о., обнаруживают довольно комплементарные паттерны экспрессии (Alfano et al.,2005). Единственным др. HOST, чей паттерн клеточной экспрессии был исследован в сетчатке это Vax2OS, который был независимо идентифицирован как транскрипционная мишень как для Crx, так и Nrl в недавнем базирующемся на микрочипах скрининге (Corbo et al.,2007; Hsiau et al.,2007). Vax2OS избирательно экспрессируется в палочковидных фоторецепторах и что уникально для транскриптов, скапливающихся в палочках, обнаруживается на более высоких уровнях в вентральной, чем в дорсальной части сетчатки. Это напоминает паттерн эмбриональной экспрессии Vax2, который ограничивается вентральными родоначальниками сетчатки (Barbieri et al.,1999; Ohsaki et al.,1999). Vax2 слабо экспрессируется в наружном ядерном слое взрослой сетчатки с накапливающейся РНК в наружном plexiform слое и т.о., также, скорее всего, перекрывается с Vax2OS во взрослой сетчатке.
Figure 1. SAGE tag level for Six3, Six6, Vax2, Prox1, and their associated noncoding OSTs in developing mouse retina. Data obtained from Blackshaw et al. (2004).
В некоторых случаях имеется, по-видимому, или взаимно усиливающие или реципрокные взаимоотношения между уровнями экспрессии HOSTs и их партнерских гомеодоменовых транскрипционных факторов. Взаимоотношения взаимного усиления наблюдаются для Vax2 и Vax2OS, поскольку мыши, несущие целенаправленную делецию Vax2 обнаруживают также снижение РНК Vax2OS (Alfano et al.,2005). В том же исследовании, однако сообщалось, что реципрокные взаимоотношения наблюдаются для Crx т CrxOS, поскольку избыточная экспрессия CrxOS с помощью аденовирусной трансдукции в постнатальную сетчатку приводила к снижению уровней мРНК Crx. Однако необходимо предостеречь, поскольку отобранная изоформа CrxOS содержала открытую рамку считывания и могла транслироваться в белок, как обсуждалось выше, и эти эксперименты не определяют непосредственно, обусловлены ли эти эффекты CrxOS-кодируемым белком или самой CrxOS РНК. В случае Six3 и Six3OS, ни того, ни др. взаимоотношения не наблюдалось, т.к. мыши, мутатные по Six3 не обнаруживали изменений в экспрессии Six3OS (Geng et al.,2007).
Novel OSTs associated with retinal transcription factors.
Далее мы исследовали степень, с которой OSTs обнаруживаются в ассоциации с транскрипционными факторами, которые преимущественно экспрессируются в развивающейся сетчатке мышей. Мы составили перечень из 100 транскрипционных факторов, которые, как было показано ранее, регулируют спецификацию судеб клеток сетчатки или экспрессируются в специфических типах клеток сетчатки во время развития (Blackshaw et al.,2004; Gray et al.,2004). Мы установили, что 35 из этих транскрипционных факторов имеют ESTs в Genbank, соответствующие предполагаемым OST, включая 18 из общего числа 34 гомеодомен-содержащих транскрипционных факторов (see Supp. Table ST1, which is available online). Это указывает на то, что феномен OSTs довольно распространен для онтогенетически важных транскрипционных факторов, но не исключителен для гомеодоменовых факторов.
Хотя некоторые из этих новых OSTs уже были ранее описаны в др. исследованиях, их экспрессия в сетчатке не была исследована (Engstrom et al.,2006). Чтобы идентифицировать OSTs, экспрессируемые на хорошо обнаружимых уровнях в сетчатке, мы исследовали, экспрессируются ли соответствующие SAGE тэги каким-либо из этих OSTs и установили, что 10 из 34 идентифицированных OSTs детектируются все за исключением одного, который был сплайсирован. 5 из этих OSTs уже ранее были описнаы в сетчатке (Six3OS, Six6OS, CrxOS, Otx2OS, and Vax2OS) (Alfano et al.,2005), тогда как 5 остальных оказались партнерами с мРНК для Lhx1, Prox1, Hmx1, Zfhx4 и Hes5 (Fig. 2). Некоторые из них, включая Lhx1OS, Prox1OS и Zfhx4OS присутствуют постоянно на более высоких уровнях, чем были идентифицировано ранее для HOSTs, за исключением многочисленных транскриптов Six3OS. RaxOS и Pax6OS не были обнаружены вообще в SAGE данных, поскольку OSTs, такие как CrxOS и Otx2OS, присутствуют лишь по одному каждый на пул более чем из 500,000 ретинальных SAGE tags (see Supp. Table ST2 for a list of all SAGE tag counts for the retinally expressed OSTs and associated transcription factors). паттерны клеточной экспрессии этих вновь идентифицированных OSTs предстоит исследовать .
Figure 2. Novel noncoding OSTs expressed in retina and associated with retinally-expressed transcription factors. See Supp. Tables ST1 and ST2 for more details on the OSTs.
Степень, с которой OSTs обнаруживаются в ассоциации с транскрипционными факторами сетчатки у видов иных, чем мыши, неясна. Предыдущие исследования сообщали, что OSTs, ассоциированы с экспрессирующимися в сетчатке транскрипционными факторами у человека такж как и у мышей (Alfano et al.,2005). Эти человеческие транскрипты часто обладают низкой гомологией первичных последовательностей с их мышиными аналогами, с существенно варьирующей позицией границ между интронами и экзонами. Более неожиданным оказалось, что геномные последовательности, транскрибируемые человеческими OSTs, часто лишь частично перекрывают эквивалентные мышиные OST, или в некоторых случаях не перекрывают вообще (Alfano et al.,2005; Babak et al.,2005). Ясно, что эволюционные ограничения на OSTs значительно сильне ослаблены, чем на ассоциированные с ними кодирующие транскрипты, факт, который позволяет идентифицировать настоящие гомологи особенно у позвоночных не млекопитающих.
Тем не менее, идентификация OSTs, ассоциированных с транскрипционными факторами сетчатки довольно таки прямая, если задаться вопросом, присутствуют ли OSTs любого типа в 5 kb от точки старта транскрипции соотв. кодирующего транскрипта. Используя эти критерии для исследования геномов кур, лягушек и рыбок данио, мы установили, что OSTs обнаруживаются ассоциированными в 22 из 37 транскрипционных факторов, которые имеют ассоциированные OSTs у мышей, по крайней мере, у одного из этих трех видов (Supp. Table ST1). 9 из 10 экспрессируемых в сетчатке мышей OSTs представлены в Supp. Таблица ST2 представляет аналоги у позвоночных не млекопитающих (see Supp. Table ST1). Почти в половине OSTs не млекопитающих, ассоциированные OST подвергались сплайсингу, указывая, что эти транскрипты являются настоящими мРНК. Эти данные указывают на то, что OSTs обнаруживаются повсюду в ветви позвоночных, хотя вопрос о существовании различий в количестве или сложности OSTs среди разных позвоночных далек от ясности.
How might OSTs work?
Какова функция и механизм действия этих OSTs ? Учитывая их тесную близость к онтогенетически важным белок-кодирующим генам, наиболее вероятной гипотезой может быть та, что они действуют в цис-положении, чтоб регулировать экспрессию своих белок-кодирующих генов путем облегчения или затруднения транскрипции (Fig. 3A). Известны многочисленные примеры естественно возникающих помех транскрипции или транскрипционного молчания генов, где транскрипция осуществляется посредством энхансерной или промоторной области соседнего гена, редуцируя или элиминируя экспрессию этого гена. В некоторых случаях, таких как SRG1 транскрипт у дрожжей, который блокирует активацию гена SER3, используется транскрипционная регуляция белок-кодирующего гена с помощью ncRNA (Martens et al.,2004,2005). Напротив, может также происходить облегчение транскрипции, когда осуществляется транскрипция ncRNA посредством регуляторной области соседнего гена, дозволяя доступ транскрипционных регуляторов к энхансерным элементам в транскрибируемой области (Ho et al.,2006).
Figure 3. Potential transcript and transcription-dependent mechanism of action of ncOSTs. A: The act of transcription through the upstream cis-regulatory sequences of the protein coding gene associated with the ncOST acts to promote or prevent recruitment of transcription factors to regulatory elements in the transcribed region. The ncRNA itself is irrelevant to the regulation of the associated gene, and is degraded after transcription. B: The ncRNA itself interacts with protein factors directly to modulate expression and/or activity of the associated protein-coding gene.
По крайней мере, один некодирующий OST в сетчатке может действовать в транс-положении, чтобы регулировать судьбу клеток сетчатки. Недавно мы наблюдали, что эктопическая избыточная экспрессия и нокдаун Six3OS/RNCR1 в сетчатке новорожденных ведет к изменениям судеб клеток. Интересно, что эти изменения частично фенокопируют изменения, обнаруживаемые при избыточной экспрессии Six3 и доминируют над негативной экспрессией, указывая, что Six3 и Six3OS/RNCR1 могут также взаимодействовать in vivo , чтобы регулировать судьбы клеток (Rapicavoli and Blackshaw, unpublished data).
Др. исследование, осуществленное вне сетчатки указывает на то, что OSTs могут, по крайней мере частично, действовать в транс-положении, регулируя транскрипцию соседних генов (Fig. 3B). В этом случае, сама ncRNA может выполнять функции, которые отличаются от простого действия транскрипции посредством геномного локуса, покрываемого транскриптом (Fig. 2). Это вообще-то наиболее чётко демонстрируется действием Evf-2, ncRNA, ассоциированной с локусом Dlx5/6 (Feng et al.,2006), который сам по себе строго экспрессируется в родоначальниках сетчатки (Rapicavoli and Blackshaw, unpublished data). Evf-2 может действовать в транс-положении, чтобы активировать транскрипцию локуса Dlx5/6 посредством взаимодействия с Dlx2, др. членом семейства Dlx. Dlx5 и Dlx6 являются членами семейства гомеодоменовых белков, которые родственны генам дрозофилы Distalless. Гены Dlx играют важные роли в дифференцировке нейронов и в формировании черепно-лицевого и ножного паттерна в развитии. Гены Dlx 5/6 транскрибируются в конвергентной ориентации и идентифицированы важные межгенные энхансерные элементы для локусов Dlx5/6 (Zerucha et al.,2000). Evf-2 транскрибируется с ei, ультраконсервативного региона локса Dlx5/6, который располагается между Dlx5 и Dlx6. Evf-2 взаимодействует непосредственно с Dlx-2, чтобы увеличить активность Dlx5/6 энхансера, путем соединения с энхансерным элементом, ei. Evf-2 т.о.,, по-видимому, действует, по крайней мере, частично, как RNA-based транскрипционный коактиватор.
Эта потенциальная функция не является беспрецедентной, т.к. ncRNA SRA, как стало известно с некоторых пор, действует как транскрипционный коактиватор за счет непосредственного взаимодействия со стероидными рецепторами (Lanz et al.,1999), тогда как ncRNAs NRSE и HSR, как было установлено, регулируют активность REST и HSF-1, соотв. (Kuwabara et al.,2004; Shamovsky et al.,2006). Однако история значительно сложнее для Evf-2. Регион Evf-2, который важен для активации транскрипции с помощью ei путем Dlx2, в точности соответствует самой ei последовательности. Кажется вполне вероятным, что Evf-2 РНК может непосредственно спаривать свои основания с ei последовательностью в ДНК, тем самым изменяется структура хроматина или облегчается рекрутирование транскрипционных факторов это и приводит к активации транскрипции в соединении с Dlx2.
Др. исследование на Drosophila и млекопитающих связано с ncRNAs, транскрибируемыми с кластера Hox генов, чтобы изменить структуру хроматина, что в свою очередь ведет к нарушению регуляции транскрипции Hox генов. Одной из таких ncRNA у дрозофилы является bxd, которая содержит энхансерные элементы для соседнего Ubx гена. Хотя имеется согласие в том, что транскрипция bxd в самом деле регулирует конформацию хроматина в этих энхансерных элементах, которые в свою очередь, регулируют экспрессию Ubx, однако существует разногласие в отношении эффекта bxd и механизма его действия. Было предположено, что bxd действует в транс-положении, чтобы рекрутировать гистоновые methyltransferases на Ubx энхансерные элементы и тем самым способствовать стабильной активации транскрипции (Sanchez-Elsner et al.,2006). Однако др. группы считают, что bxd не оказывает влияния в транс-положении, а вместо этого действует в цис-положении посредством вмешательства в транскрипцию, чтобы предупредить рекрутирование белков trithorax на энхансерные элементы и тем самым репрессировать экспрессию Ubx (Petruk et al.,2006).
Человеческие с HOX комплексом ассоциированные OSTs, как было установлено, также регулируют структуру хроматина. HOTAIR является OST, расположенным на границе двух доменов хроматина в локусе HOXC (Rinn et al.,2007). Истощение HOTAIR не оказывает эффекта на транскрипцию генов кластера HOXC, но ведет к активации транскрипции в кластере HOXD, который расположен на др. хромосоме. HOTAIR, как было установлено, непосредственно ассоциирует с Polycomb Repressive Complex 2 (PCR2), который обеспечивает транскрипционное молчание. Истощение HOTAIR , кроме того, ведет к потере как Suz12 (компонента PRC2), так и H3K27me3 в HOXD локусе, это подразумевает, что HOTAIR ncRNA действует в транс-положении, чтобы рекрутировать PRC2 на HOXD локус и тем самым способствовать транскрипционному молчанию. Наконец, John Mattick's группа недавно продемонстрировала, что два новых OSTs, Hoxb5/6as и Evx1as, могут ассоциироваться с транскрипционно активным хроматином в эмбриональных стволовых клетках мышей. Однако геномные регионы, с которыми эти OSTs ассоциируют, ещё предстоит определить(Dinger et al.,2008).
Наконец, 5 из ncOSTs , представленных в Supp. Table ST1, перекрывают 5' последовательности своих ассоциированных белок кодирующих транскриптов, потенциально открывая возможность спаривания гомологичных оснований и образования двунитчатой РНК из двух транскриптов. Это продемонстрировано для Prox1 и Hes5 на Figure 2. Поскольку неясно, действительно ли такие дуплексы образуются in vivo, давая естественные sense-antisense пары, которые могут ингибировать трансляцию (Werner and Berdal,2005), и сто они могут также служить субстратами для генерации эндогенных siRNAs, направленных против кодирующих транскриптов (Tam et al.,2008; Watanabe et al.,2008).
ncRNAs, экспрессирующиеся с локусов гомеодоменовых транскрипционных фаткоров, могут таким образом регулировать транскрипцию или партнерского транскрипционного фактора с оппозитной нити или, альтернативно, членов семейства, расположенных в отдельных локусах. ncRNAs могут также действовать в цис-положении, блокируя транскрипцию за счет вмешательства в транскрипцию или вообще активировать транскрипцию за счет облегчения транскрипции. Они могут также действовать в транс-положении, чтобы репрессировать транскрипцию путем соединения с polycomb белками или активируя транскрипцию путем соединения с др. гомеодоменовыми транскрипционными факторами или членами семейства trithorax. Цис и транс-действующие механизмы OSTs, более того, не являются взаимо исключающими. Интересно, что ряд хроматин-модифицирующих белков, включая как компоненты PRC2 ДНК methyltransferase комплекса, непосредственно соединяются с РНК (Zhang et al.,2004; Bernstein et al.,2006; Jeffery and Nakielny,2004). Вообще-то ncRNAs управляют гистоновыми модификациями в хроматине, виляя тем на экспрессию транскрипционных факторов. ncRNAs могут т.о. действовать как критические регуляторы экспрессии транскрипционных факторов у высших организмов, по крайней мере частично, облегчая ремоделирование хроматина.
Other Retinal mRNA-Like ncRNAs
Sox2OT.
При исследовании детей с билатеральной anophthalmia, было открыто, что ген Sox2 расположен в интроне ncRNA, которая была названа Sox2 overlapping transcript (Sox2OT) (Fantes et al.,2003) в то время как ген Dlx6 расположен в интроне ncRNA Evf-2 (Feng et al.,2006). В противоположность OSTs, Sox2OT транскрибируется с той же самой нити, что и Sox2 и подвергается сплайсингу поблизости от своего партнерского белок-кодирующего гена. Функциональные взаимоотношения между Sox2 и Sox2OT неясны. Однако, Sox2 экспрессируется по всей развивающейся нервной системе эмбрионов и постнатально, а Sox2OT обнаруживается обильно в EST и SAGE библиотеках из развивающейся сетчатки и головного мозга, указывая тем самым, что Sox2 и Sox2OT могут экспрессироваться совместно. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, так ли это на самом деле.
TUG1.
Taurine upregulated gene (TUG1) был открыт и охарактеризован как новая ncRNA сетчатки, которая, по-видимому, действует посредством механизма, отличного от такового для miRNA и OSTs (Young et al.,2005). TUG1 был найден при скрининге генов, которые усиливают реакцию на taurine, который индуцирует продукцию палочковидных фоторецепторов (Altshuler et al.,1993; Young and Cepko,2004). Когда TUG1 был подвергнут нокдауну, то развивающиеся палочковидные фоторецепторы обнаруживали дефекты миграции в наружный ядерный слой, эктопическую экспрессию специфичных для колбочек маркеров и повышенный апоптоз в трансфицированных клетках. Механизм действия TUG1 остается неясным.
Xist and Tsix.
Близнецовые локализованные в ядре ncRNAs Xist и Tsix являются критическими регуляторами инактивации Х хромосомы (Plath et al.,2002; Wutz and Gribnau,2007). Xist и Tsix, обе являются мРНК-подобными и длиной в десятки kilobase, транскрибируются с Xic (X-inactivation center) в антисмысловой ориентации и действуют противоположным образом, чтобы специфицировать, какая Х хромосома подвергнется инактивации. Xist затем стабильно экспрессируется с инактивированной Х хромосомы и делает молчащей инактивированную Х хромосому в цис-положении путем связывания всего вдоль хромосомы и затем рекрутируя посредством механизмов, которые всё ещё не охарактеризованы, белки семейства polycomb, которые ведут к гетерохроматинизации неактивной Х хромосомы. Этот процесс случайной инактивации Х происходит перед имплантацией, а паттерн инактивации Х хромосомы стабильно наследуется дочерними клетками. Неожиданно, и Xist и Tsix экспрессируются динамично во время развития сетчатки у мышей в субнаборах клеток как наружного, так и внутреннего слоёв нейробластов у эмбрионов. Постнатальная экспрессия ограничивается внутренним ядерным слоем приблизительно в конце первой недели постнатального развития с минимальной экспрессией в фоторецепторах и ганглиолярных клетках (Blackshaw et al.,2004). Это позволяет предположить, что эти клетки негативные по Xist и Tsix могут избегать X-инактивации, хотя генетические доказательства указывают на то, что это не так (Reese et al.,1999). Может существовать альтернативный клеточно-специфический путь Х-инактивации или драматические клеточно-специфические вариации в уровнях Xist могут быть необходимы для обеспечения Х-инактивации. Интересно, что ряд исключений из канонического механизма действия Xist был недавно открыт. При определенных условиях неактивная Х хромосома может поддерживаться без модификаций, а Xist может быть избирательно ассоциирован с Х хромосомой без того, чтобы она становилась инактивированной или модифицированной (Wutz and Gribnau,2007). Является ли такой механизм действия важным для Xist в сетчатке, ждет дальнейшего исследования.
RNCR2/MIAT/Gomafu.
Наконец, др. длинная, ядерная мРНК-подобная некодирующая РНК недавно открыта, как преимущественно экспрессируемая в развивающейся сетчатке. По-разному наз. RNCR2 (Blackshaw et al.,2004), MIAT (Ishii et al.,2006) и Gomafu (Sone et al.,2007), это РНК, которая эволюционно законсервирован от амфибий до млекопитающих (Rapicavoli and Blackshaw, unpublished data) длиной в 9, подвергается сплайсингу и подобно Xist сохраняемым в ядре транскриптом. Она, однаконе ассоциирует с хроматином, но вместо этого соединяется специфически посредством неохарактеризованных субдоменов с ядерным матриксом (Sone et al.,2007). Она экспрессируется избирательно в развивающейся ЦНС и ПНС (Ishii et al.,2006; Sone et al.,2007), и также экспрессируется в фокальных регионах взрослого головного мозга (Mercer et al.,2008). Транскрипты многочисленны в развивающейся сетчатке, составляя максимум в 0.2% от полиаденилированных РНК на ст. Е18 у мышей (Blackshaw et al.,2004). Она строго экспрессируется в субнаборе как родоначальных, так и постмитотических клеток, с выраженной и постоянной экспрессией в субнаборе незрелых амакринных клеток, однако фактически не обнаружима в др. амакринных клетках на той же стадии развития (Blackshaw et al.,2004). Недавние данные из нашей лаб.показали, что поскольку избыточная экспрессия не дает очевидных фенотипических отклонений сетчатки, а нокдаун RNCR2 в развивающейся сетчатке способствует развитию как амакринных клеток так и Muller глии (Rapicavoli and Blackshaw, unpublished data), это указывает на роль этой ncRNA в избирательном ингибировании специфических клонов клеток сетчатки. Как RNCR2 осуществляет свою функцию на молекулярном уровне пока неясно.
CONCLUSIONS AND FUTURE PROSPECTS
The field of retinal ncRNAs is certain to expand dramatically in the years ahead. The use of high-throughput sequencing in combination with microarray-based approaches should lead to the identification of a comprehensive catalog of both miRNAs and other ncRNAs that are dynamically expressed in developing retina. Electroporation and retroviral infection make it quite straightforward to overexpress and knockdown ncRNA expression in vivo, and we should soon obtain proof that ncRNAs play a role in retinal cell fate specification. Likewise, reporter assays allow ready identification of miRNA target sequences, and within a few years we should begin to get the outlines of the miRNA regulatory network in retinal progenitors. This will determine whether these RNAs actually play a major role in regulating progenitor competence. The bigger challenge ahead lies in identifying the biochemical targets and mechanisms of action of biologically active mRNA-like ncRNAs. Of specific interest is unraveling what is likely to be the complex interplay of both trans-acting RNA-mediated effects and cis-acting transcription-dependent effects of these ncRNAs in modulating the activity and expression of developmentally important protein coding genes. Noncoding RNAs are likely to be an extremely functionally heterogeneous class of biomolecules, and it is likely to be a long time before we know how far and wide this unexplored country stretches.
Сайт создан в системе
uCoz 