Left-right (LR) асимметрия является широко распространенным явлением у всех позвоночных (Levin,[2005]; Raya and Belmonte,[2006]). Хотя лево-правосторонняя асимметрия неявна при внешнем осмотре, существуют выраженне различия между левой и правой сторонами в структуре и расположении внутренних органов, организации системы кровообращения и структуры головного мозга. У всех видов позвоночных, которые были изучены, повышена лево-стороняя активность секретируемых белков семейства transforming growth factor-β (TGFβ) Nodal и Lefty-2, и гомеобоксного белка Pitx2, они играют центральную роль в инициации лево-правосторонней асимметрии (Fig. 1; Shiratori and Hamada,[2006]; Schlueter and Brand,[2007]). Сигнальные пути Nodal, Hedgehog, Fgf, Wnt, Bmp и Notch конвергируют. чтобы регулировать активность Nodal; эти процессы уже рассматривались в обзорах (Hirokawa et al.,[2006]; Raya and Belmonte,[2006]; Shiratori and Hamada,[2006]).


Рис.1. A simplified schematic of the core left-right signaling pathway in the e8.5 (six-somite) mouse embryo. The embryo is viewed from the ventral side to highlight the ventrally located node. Nodal (blue), a transforming growth factor-beta (TGF) family ligand, is expressed around the periphery of the mouse node (outlined in black). Leftward fluid flow across the node requires the correct placement and rotation of nodal cilia (green), and leads to expression of Nodal in the left lateral plate mesoderm (LPM). Nodal signaling in the left LPM upregulates its own expression in a positive feedback loop and also induces expression of lefty2 and Pitx2. Lefty2 (red) antagonizes the activity of Nodal and limits its range of activity. Nodal made in the left LPM also activates the expression of lefty1 (purple) in the left prospective floor plate, dorsal to the notochord (black line extending anteriorly along the midline). Lefty1 antagonizes Nodal and prevents the spread of left signaling to the right LPM. The homeodomain transcription factor Pitx2 (yellow) controls later left-sided morphogenetic events. Lack of nodal and Pitx2 expression in the LPM leads to right-sided isomerism in the thorax (e.g., right pulmonary isomerism); bilateral expression of nodal and Pitx2 in the LPM leads to left pulmonary isomerism.

Генетические и эмбриологические эксперименты на мышах показали, что асимметричная активация Nodal зависит также от клеточной структуры и организации ткани двух структур срединной линии: узелка, морфологически самостоятельной группы клеток на кончике раннего эмбриона мыши и осевой срединной линии. Подвижные реснички узелка мышей генерируют лаво-направленный ток жидкости, который является важным для инициации экспрессии Nodal особенно на левой стороне эмбриона на ранней сомитной стадии (Hirokawa et al.,[2006]). Этот лево-направленный ток зависит от структуры нодальных ресничек, их положения на клетках узелка и физической организации клеток с ресничками внутри узелка. Поддержание лево-правосторонней асимметрии зависит от организации клеток срединной линии, которая ограничивает Nodal сигналы левой стороной эмбриона.

Хорошо известно, что подвижные реснички являются важными для лево-правосторонней асимметрии (Hagiwara et al.,[2004]; Bisgrove and Yost,[2006]; Hirokawa et al.,[2006]; Satir and Christensen,[2007]). Задолго до этого было известно, что узелок мышей является источником лево-правосторонней асимметрии, было известно, что каждая клетка вентрального узелка обладает одиночной ресничкой, проецирующейся с её апикальной (обращенной наружу) поверхности (Jurand,[1974]). Мутантные эмбрионы мыши, которые полностью лишены ресничек, обнаруживали аномальное формирование лево-правостороннего паттерна, который может быть впервые распознан морфологически как рандомизированная полярность петлеобразования сердца и молекулярно по билатеральной экспрессии nodal в латеральной пластинке мезодермы (LPM; Nonaka et al.,[1998]; Takeda et al.,[1999]; Murcia et al.,[2000]; Huangfu et al.,[2003]). Сходным образом, мышиные мутанты, у которых нодальные реснички присутствуют, но не подвижны, имеют тот же тип нарушения лево-правосторонней асимметрии (McGrath et al.,[2003]).

Используя прямое изображение и эмбриологические манипуляции несколько групп продемонстрировали, что нодальные реснички у мышей подвижны и что они создают лево-направленный ток внеклеточной жидкости (nodal ток). Дальнейшие экспериментальные манипуляции продемонстрировали, что лево-направленный ток жидкости поперек узелка необходим и достаточен для установления лево-правосторонней асимметрии (LR asymmetry) (Nonaka et al.,[1998],[2002]; Okada et al.,[1999]; Supp et al.,[1999]; Takeda et al.,[1999]). Нодальный ток необходим во время короткого периода времени, со стадии 1-6 сомитов, который длится 6-7 ч (Shiratori and Hamada,[2006]).

Ресничка построена из кольца из 9 дублетов микротрубочек, которые распространяются на всю длину реснички. Образование ресничек зависит от общераспространенного стержневого аппарата, включая специфический kinesin-2 мотор, которые переносит груз на кончик реснички, частиц intraflagellar transport (IFT) и ретроградный цитоплазматический dynein мотор (Hagiwara et al.,[2004]). Нодальные реснички мышей довольно длинны: на эмбриональный день 7.5 (e7.5) или на LS/0B (late streak/zero bud) стадии (for staging nomenclature, see Downs and Davies,[1993]), они длиной в 1.5 и они достигают приблизительно 3-5 microns длины к EHF (e8.0) стадии (Fig. 2A; Sulik et al.,[1994]).


Рис.2.  |  Cilia position on cells of the node. A: Scanning electron microscopy of the node pit at 0B/EHF stage (e8.0). The anterior-posterior axis is labeled. At this stage, some cilia emerge from the center of the cell (arrowhead) and some cilia have shifted to a more posterior position (arrow). B: Schematics of ventral views of the node pit showing cilia position in cells at LS and EHF stages. Posterior is to the right. At LS stage cilia emerge from the center of each cell; by EHF stage most cilia emerge from the posterior. Nodal flow begins after EHF stage and is well established by LHF stage (e8.25; Okada et al.,[1999]). C: Schematic of lateral view of node pit cells at EHF stage. Posterior is to the right. Cilia emerge from the posterior of each cell; because the apical surface of each cell is domed, the cilia project posteriorly. Scale bar = 1 m.

Несколько транскрипционных факторов необходимы для образования нормальных нодальных ресничек. Foxj1 специфически необходим для образования подвижных ресничек в тканях, таких как легкие (Chen et al.,[1998]). В отсутствие Foxj1, присутствуют реснички нормальной длины, но выглядят неподвижными и в результате возникает рандомизированная асимметрия (Chen et al.,[1998]; Brody et al.,[2000]; Zhang et al.,[2004]). Rfx3 является одним из 5 гомологов у млекопитающих гена C. elegans daf-19 (Emery et al.,[1996]). Транскрипционный фактор daf-19 соединяется с X-box мотивами, которые присутствуют в регуляторных областях многих генов ресничек; daf-19 необходим для транскрипции генов ресничек у C. elegans (Swoboda et al.,[2000]). В то время как Rfx3 мутанты образуют нодальные реснички, реснички медленно растут и достигают лишь половину обычной длины на ст. двух сомитов, когда необходим нодальный ток жидкости (Bonnafe et al.,[2004]). Rfx3 мутанты обнаруживают рандомизированный LR situs (Bonnafe et al.,[2004]), указывая тем самым, что реснички д. иметь специфическую длину, чтобы эффективно генерировать нодальный ток. Нодальные реснички у эмбрионов, лишенных гомеобоксного транскрипционного фактора Noto короткие и имеют аномальные микротубулярные аксонемы, а мутантные эмбрионы имеют рандомизированный situs (Beckers et al.,[2007]). Экспрессия как Foxj1, так и Rfx3 снижена в узелке Noto мутантов (Beckers et al.,[2007]), это указывает на то, что Noto действует выше Foxj1 и Rfx3 в транскрипционном пути, который регулирует морфогенез нодальных ресничек.

Первая связь между подвижностью ресничек и формированием LR паттерна была установлена в исследовании классической рецессивной мутации у мышей inversus viscerum (iv); iv/iv имеют рандомизированную LR асимметрию (Hummel and Chapman,[1959]; Layton,[1976]). Ген iv кодирует Left-right dynein (Lrd; MGI: Dnahc11), аксонемный dynein двигательный белок, который необходим для подвижности нодальных ресничек (McGrath et al.,[2003]). Приблизительно 70% нодальных ресничек подвижны и экспрессируют Lrd (McGrath et al.,[2003]). Оставшиеся нодальные реснички не экспрессируют Lrd и, по-видимому, неподвижны. Два типа ресничек перемешаны и неизвестно, расположены ли эти два класса ресничек в виде стереотипического паттерна.

Точная структура подвижных ресничек в узелке мышей всё ещё предмет спора. Подвижные реснички, такие как те, что в дыхательном тракте или яйцеводах, обычно имеют 9 наружных дублетов и одиночную пару центральных микротрубочек (9+2 конфигурация) в аксонеме реснички; подвижность таких ресничек продуцируется с помощью внутреннего и наружного плеч динеина, который заставляет центральные микротрубочки скользить относительно др. др. (Davenport and Yoder,[2005]; Satir and Christensen,[2007]). Напротив, первичная ресничка, называемая так из-за того, что они обычно находятся как одиночная на клетку ресничка и имеют распределение микротрубочек 9+0, т.e., они лишены центральной микротубулярной пары. 9+0 реснички обычно неподвижны. Трансмиссионная ЭМ нодальных ресничек показала 9+0 организацию микротрубочек с dynein плечами, которые соединяют соседние дублеты микротрубочек (Sulik et al.,[1994]; Takeda et al.,[1999]; Essner et al.,[2002]). Удивительно, но нодальные реснички производят вращательные движения, при которых ресничка сохраняет прямо направленную ориентацию, но дистальный конец движется по окружности вокруг оси вращения, в противоположность хлысто-подобным взад и вперед движениям, характерным для 9+2 ресничек (Nonaka et al.,[1998]); эта находка указывает на то, что 9+0 ресничка использует новый механизм для подвижности. Однако два недавних исследования идентифицировали 9+2 реснички в узелке мышей и 9+2 и 9+4 реснички в задней хордальной пластинке (posterior notochordal plate (PNC; структура, которая генерирует лево-направленный ток у эмбрионов кроликов)) кроликов (Feistel and Blum,[2006]; Caspary et al.,[2007]). Поэтому необходимы дополнительные исследования для определения структуры и пространственной организации подвижных ресничек.

Механизм, с помощью которого нодальный ток транслируется в асимметричную экспрессию nodal, всё ещё активно изучается. Первоначально были предложен две модели, известные как модели морфогена и двух ресничек. Модель морфогене предполагает, что нодальный ток продуцирует градиент сигнальных молекул в узелке (Nonaka et al.,[1998]; Okada et al.,[2005]), тогда как модеь двух ресничек предполагает, что нодальный ток вызывает деформацию механосенсорных ресничек в левую сторону узелка (Brueckner,[2001]; Tabin and Vogan,[2003]). Во всяком случае, нодальный ток, по-видимому, связан с повышением притока ионов Ca⁺⁺ на левую периферию узелка. Эта асимметрия притока Ca⁺⁺ сцеплена с асимметричной активацией экспрессии nodal в левой LPM (McGrath et al.,[2003]; Tanaka et al.,[2005]). Мутация гена Polycystin-2 (Pkd2), который кодирует белок, который скорее всего является Ca⁺⁺ каналом. блокирует повышение Ca⁺⁺ и рандомизирует LR ось (Pennekamp et al.,[2002]; McGrath et al.,[2003]). Модели морфогена и двух ресничек обсуждаются в обзорах (Levin,[2005]; Hirokawa et al.,[2006]; Raya and Belmonte,[2006]; Shiratori and Hamada,[2006]).

Помимо структуры и подвижности ресничек нормальный нодальный ток, по-видимому, зависит от точной позиции узелковых клеток. Вращательные ротации нодальных ресничек, по-видимому, предваряют генерацию ламинарного лево-направленного тока, но гидродинамическое моделирование предсказывает, что ротации ресничек могут генерировать левонаправленный ток, если только ось ротации сориентирована в направлении задней части узелка (Cartwright et al.,[2004]). Прямые наблюдения подтвердили, что реснички в самом деле позиционированы в направлении кзади в каждой нодальной клетке (Nonaka et al.,[2005]; Okada et al.,[2005]). Поверхность каждой центральной нодальной клетки куполообразна (Okada et al.,[2005]); если позиционированная взади ресничка выходит перпендикулярно к поверхности, то она оказывается под углом 25-40° в направлении кзади. Т.о., функция нодальных ресничек как продуцентов лево-направленного тока зависит как от подвижности ресничек, так и от наклона кзади каждой из ресничек, это в свою очередь зависит от кривизны апикальной поверхности каждой pit клетки и от задней стороны точки выхода каждой реснички. Апикальная куполообразность не является обычной характеристикой цилиндрического эпителия. Эта находка указывает на то, что куполообразность клеток в нодальной ямке активно регулируется; , однако механизм регуляции неизвестен.


Рис.3.  | Morphology of the mature node. A: Scanning electron micrograph (SEM) of EHF (e8.0) stage embryo, ventral view, anterior to the left. The node is visible as a teardrop-shaped pit of cells with small apical surfaces, surrounded by larger squamous crown cells, which are contiguous with the endoderm germ layer. B: Confocal micrograph of an EHF stage embryo showing the ventral node viewed en face, anterior to the left. Phalloidin (green) labels cortical F-actin rings at the apical surface of the polarized node pit cells; DAPI (blue) labels nuclei. Note the small apical surfaces of the cells of the node and axial midline. C: SEM of a LB stage node fractured in the transverse plane, ventral side down. Ciliated, apically constricted ventral node cells are exposed to the surface, and lie beneath the columnar epithelium of the dorsal node. Scale bars = 40 m in A, 10 m in B, 5 m in C.

Важность ориентации ресничек подтверждается анализом inversin (inv) мутантных мышей (Okada et al.,[2005]). Мутация inv, которая обусловливается трансгенной инсерцией, необычно из-за того, что она вызывает реверсию лево-правосторонней асимметрии скорее, чем рандомизацию или изомеризацию оси (Yokoyama et al.,[1993]). Нодальный ток у invмутантов медленный и неполяризованный и 20% ресничек у мутантов ориентированы кпереди скорее, чем кзади (Okada et al.,[2005]). Неправильная ориентация ресничек может быть обусловлена дефектами механизмов, которые позиционируют реснички или может быть обусловлена нарушением структуры узелка у мутантов (Okada et al.,[1999]).

Скоординированная поляризация положения ресничек по эпителию вентрального узелка является типом планарной полярности, в которой клетки эпителия продуцируют поляризованные структуры или подвергаются поляризованным движениям в плоскости эпителиального слоя (Okada et al.,[2005]; Bisgrove and Yost,[2006]; Wang and Nathans,[2007]). В таком случае ресничка каждой клетки зрелого узелка позиционирована на задней стороне клетки в плоскости вентрального узелка. В нервной пластинке и во внутреннем ухе гены пути неканонической Wnt/planar cell polarity контролируют плоскостную полярность planar polarity (Wang and Nathans,[2007]). Однако мутанты по неканоническому пути Wnt у мышей, включая Vangl2, Celsr1, Scrib, Fz3/6 двойных мутантов и Dvl1/2 двойных мутантов, не обнаруживают очевидных дефектов полярности в петлеобразовании сердца или в др. аспектах лево-правосторонней асимметрии (Hamblet et al.,[2002]; Curtin et al.,[2003]; Montcouquiol et al.,[2003]; Murdoch et al.,[2003]; Torban et al.,[2004]; Wang et al.,[2006]). Т.о., сигналы, контролирующие позицию ресничек, остаются не идентифицированными.

В задней части хордальной пластинки эмбрионов кроликов и в gastrocoel roof пластинке эмбрионов Xenopus (ткани, которые генерируют лево-направленный ток), реснички первоначально локализованы в центре апикальной поверхности, но позднее становятся локализованными в её задней части (Feistel and Blum,[2006]; Schweickert et al.,[2007]). Мы наблюдали сходную картину в узелке мышей: на LS/0B стадии (e7.25) большинство нодальных ресничек локализуются в центре клетки, но они становятся расположенными в задней её части на более поздних стадиях (unpublished and Fig. 6A; schematized in Fig. 2B,C). На EHF стадии (e7.75), базальные тельца каждой реснички также обнаруживаются локализованными кзади (Nonaka et al.,[2005]); положение базального тельца на промежуточных стадиях образования реснички не исследовалось. Смена положения нодальных ресничек напоминает события, которые происходят во время установления планарной полярности во внутреннем ухе (Kelly and Chen,[2007]). Киноцилий (первичная ресничка волосковых клеток улитки) располагается в задней части каждой волосковой клетки улитки, где она организует шевроно-подобное расположение базирующихся на актине стереоцилий вокруг него. Однако киноцилий первоначально образуется в середине клетки; позднее он перемещается прочь от срединной линии вдоль медиолатеральной оси (Sobkowicz et al.,[1995]; Frolenkov et al.,[2004]; Jones et al.,[2008]). Т.о., возможно, что положение в задней части нодальных ресничек зависит от регулирующих движений базального тельца в заднюю часть клетки.

Реснички, которые генерируют лево-направленный ток жидкости у эмбрионов мышей, располагаются на узелке, специализированной группе клеток на дистальном конце раннего эмбриона. Анатомические сравнения между видами позвоночных и современные модели нодального тока указывают на то, что гладкая, ciliated поверхность поверх которой перемещается ламинарный ток жидкости влево, является важной для формирования LR паттерна (Hirokawa et al.,[2006]).

У мышей лево-направленный ток генерируется подвижностью ресничек в узелке, начинающейся на ст. LB/EHF (e7.5) (Nonaka et al.,[1998]). Зрелый узелок на ст. EHF (e7.75) эмбриогенеза становится видимым с помощью scanning electron microscopy (SEM) в виде впадины, слезинко-образного эпителиального поля, клетки которого локализуются дистально на вентральной поверхности эмбриона (Fig. 3A). Зрелый узелок состоит из приблизительно 250 клеток в ямке приблизительно в 50-60µm в ширину, 70-90 µm в длину и до 50µm в глубину (Sulik et al.,[1994]; Yamanaka et al.,[2007]). Узелок состоит из двух слоёв цилиндрического эпителия смыкающихся базальными поверхностями: дорсальная часть узелка является продолжением окружающего его эпибласта, тогда как вентральная часть узелка является продолжением соседнего энтодермального эпителия (Fig. 3A,C). Клетки в узелковой ямке и хордальной пластинке, которые тянутся кпереди от узелка, обладают апикально-базальной полярностью и что характерно обладают небольшой апикальной (наружной) поверхностью, как это видно с помощью SEM (Sulik et al.,[1994]) или конфокальной микроскопии (Figs. 3B, 8B). Клетки как узелковой ямки, так и хордальной пластинки также характеризуются выдающейся моноресничкой (monocilium) на своей апикальной поверхности (Jurand,[1974]; Poelmann,[1981]; Sulik et al.,[1994]). Узелковая ямка окружена 20-30 слущивающимися клетками с крупной апикальной поверхностью, наз. венечными (crown) клетками, которые являются продолжением окружающей энтодермы (Figs. 3A, 5E).

Интересны межвидовые вариации в структуре ткани, которая продуцирует или воспринимает лево-направленный ток (schematized in Fig. 4). Мышиный узелок покрыт со своей вентральной поверхности Reichardt's мембраной, которая продуцирует небольшие не выходящие за её границы пространства для нодального тока (Fig. 4A). PNC является структурой с ресничками, которая продуцирует лево-направленный ток у эмбрионов кроликов (Okada et al.,[2005]). PNC является более широком, чем туловище хордальной пластинки (Feistel and Blum,[2006]; Blum et al.,[2007]) и образует более удлиненную структуру, чем более короткий треугольной формы узелок мыши. В отличие от мышиной вентральной части узелка вентральная поверхность PNC кролика является выпуклой, с кривизной наружу в направлении вентральной поверхности (Okada et al.,[2005]; Blum et al.,[2007]). У кроликов PNC направленный вправо возвращающийся ток проходит через задний край PNC, тогда как в узелке мыши возвращающийся ток проходит непосредственно по узлу, в слое более уделенном от поверхности узелка, чем левонаправленный ток (Okada et al.,[2005]). Возможно, что эти различия в движении жидкости могут быть обусловлены различиями в форме этих двух органов.


Рис.4.  | Comparison of the organs of asymmetry among vertebrate species. Transverse view, dorsal is up. Ectoderm is red, paraxial mesoderm is yellow, endoderm/hypoblast is teal, and the organ of asymmetry is violet, with green cilia. The mouse ventral node and rabbit posterior notochordal plate are positioned beneath the ectoderm and are laterally contiguous with the endoderm/hypoblast. Mesoderm fills the space between the ectoderm and endoderm germ layers lateral to the node. The ventral pit of the mouse node is covered by Reichardt's membrane, creating an enclosed space. The teleost Kupffer's vesicle is an enclosed sphere in zebrafish (shown here) and, in medakafish, a hemisphere; cilia are concentrated on the dorsal anterior surface. The Xenopus gastrocoel roof plate is contiguous with the lateral endoderm; cilia project into the gastrocoel cavity. Panels are not size-matched.

Kupffer's vesicle (KV) является временной сферической структурой, которая формирует хвостовую почку у эмбрионов костистых рыб к концу гаструляции (Essner et al.,[2002]). Каждая клетка у рыбок данио в KV эпителии проецирует одиночный 9+2 monociliumв просвет пузырька (Cooper and D'Amico,[1996]; Melby et al.,[1996]; Kramer-Zucker et al.,[2005]; Amack et al.,[2007]). Эти реснички наклонены в направлении кзади и они ротируют вращательно, подобно нодальным ресничкам мышей (Essner et al.,[2005]; Kramer-Zucker et al.,[2005]). недавний трехмерный анализ выявил неожиданный аспект геометрии KV: как реснички, проецирующиеся в сферический пузырек могут продуцировать лево-направленный ток жидкости. Этот анализ продемонстрировал, что 80% ресничек KV находятся на дорсальной полусфере и эти реснички многочисленны в передней трети дорсальной стороны (Kreiling et al.,[2007]). Обогащение ресничками дорсальной стороны топологически сходно с мышиным узелком и может объяснить net лево-направленного тока. У рыб медака только дорсальная поверхность KV имеет реснички; эта поверхность выпукла и как и у кроликов возвращающиеся право-направленный ток происходит по задней стороне (Okada et al.,[2005]).

Реснички в gastrocoel roof plate (GRP) у Xenopus laevis также генерируют лево-направленный ток. GRP очень отличен по структуре от узелка мышей: он является частью слоя мезодермы, которая лежит позади хорды на ст. гаструлы лягушек (Shook et al.,[2004]). GRP клетки обладают подвижными monocilia, которые, подобно ресничкам узелка мыши, проецируются из задней части клетки и продуцируют лево-направленный ток жидкости (Essner et al.,[2002]; Shook et al.,[2004]; Okada et al.,[2005]; Schweickert et al.,[2007]). Не был измерен ток возврата у эмбрионов Xenopus (Schweickert et al.,[2007]). Интересно отметить, что GRP не находится в утопленном кармане gastrocoel, а скорее является единым с соседней латеральной энтодермой (Shook et al.,[2004]); эта находка указывает на то, что, по крайней мере, у Xenopus, морфологическая стенка не обязательна для восприятия генерируемого током сигнала. Такого типа изменчивость между структурами из органов асимметрии может отражать различия в том, как током-генерируемый сигнал воспринимается (Raya and Belmonte,[2006]).

ЭМ и изучение клеточных клонов помогли определить, как развиваются стереотипированные структуры узелка мышей (Poelmann,[1981]; Sulik et al.,[1994]; Yamanaka et al.,[2007]). Узелок возникает из группы клеток, локализованных вблизи переднего края первичной полоски на ст. mid-streak до ст. поздней полоски (MS до LS). мы установили, что на ст. MS узелок невидим и наружная поверхность эмбриона покрыта слущивающимися энтодермальными клетками (Fig. 5A,B). Морфогенез узелка у мышей начинается, когда несколько групп цилиндрических клеток с небольшой апикальной поверхностью становится видимой вблизи дистального конца эмбриона на LS (e7.5) стадии (Fig. 5C,D; Sulik et al.,[1994]). Кластеры клеток с небольшими апикальными поверхностями также присутствуют более кпереди по срединной линии эмбриона (Fig. 5C; Poelmann,[1981]; Sulik et al.,[1994]). Эти кластеры клеток с небольшими апикальными поверхностями отделяются с помощью слущивающихся клеток с крупными поверхностями (Sulik et al.,[1994]).


Рис.5.  | Scanning electron micrographs (SEM) of the stages of node morphogenesis. All panels show ventral views of the distal tip of the embryo, the position of the node. Anterior is to the left. Staging is according to Downs and Davies ([1993]). B, D, F, and H are higher magnifications of A, C, E, and G, respectively. A,B: MS (mid-streak, e7.25) stage. Visceral endoderm covers distal region of the embryo. C,D: LS stage (e7.5). Clusters of cells with small apical surfaces and cilia begin to appear in groups near the presumptive node (arrows, C) and the axial midline (arrowheads, C). Some endoderm cells lie over the node field (arrowhead, D). Most cilia are located in the center of node cells at this stage. E,F: 0B stage (e7.5-e7.75). The node region is free of overlying endoderm but has not adopted a concave shape. Cilia are longer and continue to project outward. G,H: EHF stage (e7.75). The pit of the node is concave; cilia have elongated and project posteriorly. The panel in G is a lower magnification view of the embryo shown in Figure 3A. These images are from embryos in the C3H/HeJ inbred strain. Scale bars = 20 m in A,C,E,G, 2 m in B,D,F,H.

На OB стадии (e7.5-e7.75) узелок выглядит как одиночное поле клеток с небольшой апикальной поверхностью (Fig. 5E,F). На этой стадии реснички приблизительно длиной в 2 µm и часто торчат вертикально к поверхности узелка (Fig. 5F). Область узелка плоская и слегка ниже уровня соседних венечных клеток (Fig. 5E). На EHF стадии (e7.75) образуется узелковая ямка и приобретается финальная форма узелка (Fig. 5G). Реснички длиной в 3-4 µm и проецируются в направлении кзади (Fig. 5H).

Переход между этими двумя конфигурациями - множественными небольшими полями, сдавленных клеток, разделенных энтодермальными клетками и одиночным полем вентральных нодальных клеток (Fig. 5C,G) - лишь в начале выяснения. В 1981 Poelmann предположил, что кластеры происходящих из полоски предшественников узелка вставляются между клетками энтодермального слоя (Poelmann,[1981]). Недавние эксперименты по прямому наблюдению задокументировали перестройки нодальных клеток благодаря экспрессии enhanced green fluorescent protein (eGFP) нокаутированных по локусу noto (Yamanaka et al.,[2007]). Мыши экспрессируют noto, гомологичный Xenopus Xnot и floating head рыбок данио, исключительно в узелке и хорде, а Noto-GFP аллель воспроизводит этот паттерн (Abdelkhalek et al.,[2004]). Прежде, чем узелок станет видимым на вентральной поверхности эмбриона, Noto-GFP⁺ клетки уже расположены в виде листка под энтодермальным слоем (Yamanaka et al.,[2007]). Сходным образом клетки с ресничками обнаруживаются в PNC кроликов во время появления PNC благодаря расположению поверх слоя гипобласта (Feistel and Blum,[2006]; Blum et al.,[2007]). Мы выявили клетки с ресничками под энтодермой на LS стадии (e7.5) у эмбрионов мышей с помощью SEM и конфокальной микроскопии (Fig. 6B,C). Т.о., инициальный участок появления цилиндрических клеток с ресничками может отражать постепенное удаление лежащих поверх энтодермальных клеток или за счет клеточной гибели или перемещений, хотя организация клеток предшественников узелка до их полного проявления, неизвестна. Предшественники узелка могут быть представлены в одиночном поле или в нескольких кластерах и неизвестно, изменяет ли поле предшественников узелка форму, когда формируется зрелый узелок. Эти наблюдения подтверждают, что поведение вентральной части узелка и энтодермы в чем-то скоординированы, так что энтодермальные клетки мигрируют из презумптивной вентральной части узелка, в то же самое время клетки вентральной части узелка конвергируют в направлении срединной линии и собираются в слезинко-образную ямку (summarized in Fig. 7). Ничего не известно о том, как передаются сигналы между этими двумя слоями ткани, координирующие их поведение.


Рис.6.  |  The intermediate stage of node morphogenesis, when ciliated cells emerge from beneath overlying endoderm. A,B: Confocal images of embryos labeled with anti-Arl13b (green) to highlight cilia (Caspary et al.,[2007]), phalloidin (red) to show cell boundaries, and DAPI to label nuclei (blue). A: LS stage embryo, ventral view, anterior to the left; 3D rendering showing scattered clusters of ventral node cells. The notochordal plate (bracket) is visible to the left (anterior). Cilia are mostly located at the center of each cell's apical surface. B: yz-projection of confocal z-stack, LS stage embryo; distal is up. Cilia (arrows) are visible on some cells still covered by endoderm. Several cilia are visible on cells that have already emerged onto the ventral surface (arrowheads). C: Scanning EM of a LS stage embryo (a higher magnification of Fig. 5D), showing cilia (arrowhead) visible beneath an overlying endoderm cell. Scale bars = 30 m in A, 10 m in B, 2 m in C.


Рис.7.  |  Steps in node morphogenesis. Camera lucida-style renderings depict the cell boundaries, traced from scanning electron micrographs of embryos shown in Figure 5 A,C.G. A: MS stage. B: LS stage. C: EHF stage. Blue represents endoderm, purple represents ventral node and notochordal plate. Black lines depict approximate plane of section in (D-F). D-F: Cartoons showing a model of node morphogenesis, representing transverse sections through MS, LS, and EHF stage nodes showing the arrangement of cell layers. Red, epiblast; purple, ventral node; yellow, paraxial mesoderm; blue, endoderm. A,D: Ventral node begins to differentiate before emergence onto the ventral surface of the embryo: cells make cilia and begin to epithelialize. B,E: Emergence occurs gradually during 0B to LB stages, as endoderm is cleared by an unknown process from the distal tip of the embryo. C,F: Formation of the distinctive pit shape occurs after emergence onto the ventral surface. A-C, anterior up; D-F, epiblast up, endoderm below.

Клетки вентральной части узелка д. быть также организованы в цилиндрический эпителий со своей апикальной поверхностью, обращенной вентрально (противоположно эпибласту). Noto-GFP⁺ клетки обнаруживаются в передней части первичной полоски до образования узелка (Yamanaka et al.,[2007]), это указывает на то, что эти клетки начинают экспрессировать Noto и приобретают судьбу узелка или ствола хорды, когда они начинают отделяться от полоски. По-видимому, Noto-экспрессирующие предшественники узелка становятся мезенхимными, как только они выходят из первичной полоски, но затем превращаются в эпителий (с противоположной эпибласту полярностью) под энтодермальным слоем, прежде чем энтодермальные клетки начнут перемещаться прочь, чтобы открыть узелок. Наконец, нодальный эпителий становится непрерывным с соседним эпителием дефинитивной энтодермы. Механизмы, которые регулируют эпителизацию вентральной части узелка и инсерцию в энтодерму, неизвестны.