Посещений:
РАЗВИТИЕ ОБОНЯТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ КУР

Экспрессия Нейрогенных Маркеров

Dynamic Expression of Neurogenic Markers in the Developing Chick Olfactory Epithelium
Esther Maier, Lena Gunhaga
Developmental Dynamics 238:1617-1625, 2009.

Neurogenesis in the olfactory epithelium begins in early embryos and proceeds throughout life. A comparison of neurogenic marker expression at different developmental stages and at different axes of the olfactory epithelium has not been reported in a coordinated way. In this study, we have in detail compared the temporal and spatial expression patterns of the precursor markers Hes5, Cash!, Ngn1, and the neuronal markers Gap43, HuC/D, Lhx2 in the developing olfactory placode and epithelium in chick embryos from HH10 to HH34. We show that Hes5 starts to be expressed in cells of the prospective olfactory placode at HH10, earlier then previously reported. During olfactory pit stages, the expression of Hes5., Cash/, Ngn1, Gap43, HuC/D, and Lhx2 varies throughout the anterior-posterior and superior-inferior axis of the olfactory epithelium. By HH34, expression of the precursor and neuronal markers show the first signs of apical-basal stratification of the epithelium.
Нейрогенез обонятельных сенсорных нейронов в обонятельном эпителии происходит в течение всей жизни и часто используется в качестве парадигмы для изучения нейрогенеза в целом, благодаря простой организации обонятельного эпителия.
Обонятельный эпителий возникает из обонятельной плакоды (Croucher and Tickle, 1989; Kramer et al., 2000). На ст. поздней гаструлы, клетки предшественники в пограничной области передней части нервной пластинки, между проспективной нейроэктодермой и эпидермисом, специфицируются как обонятельные и хрусталиковые плакодные клетки (Sjodal et al.. 2007). На ст. нервных складок, Hamburger and Hamilton stage (HH) 8 у кур (Hamburger and Hamilton, 1992) клетки предшественники обонятельных и хрусталиковых плакод пространственно разделяются (Bhattacharyya et al., 2004; Sjodal et al., 2007). На ст. HH14, обонятельные плакоды становятся видимыми как эктодермальные утолщения по бокам головы, которые постепенно инвагинируют, чтобы сформировать чашко-подобную структуру, наз. обонятельной ямкой на ст. HH17. На более поздних стадиях обонятельный эпителий увеличивается далее внутрь головной мезенхимы и формируются самостоятельные обонятельные бокалы. Зрелый обонятельный эпителий содержит стволово-подобные клетки, клетки нейрональных предшественников на разных стадиях созревания, обонятельные сенсорные нейроны, а также глия-подобные поддерживающие клетки.
Basic helix-loop-helix (bHLH) репрессорный ген Hes5, bHLH транскрипционные регуляторы chick achaete-scute1 (Cash1) и Neurogenin1 (Ngn1), нейрональные маркеры growth-associated-protein 43 (Gap43) и HuC/D и LIM-homeodomain transcription factor Lhx2, определяют клетки на разных стадиях в обонятельных сенсорных нейрональных клонах и обозначаются как нейрогенные маркеры в данном исследовании. В обонятельном эпителии нейрогенез происходит упорядоченным способом; stem-подобные клетки предшественники (Hes5-позитивные) подвергаются асимметричным клеточным делениям, чтобы создать временно амплифицирующиеся клетки предшественники (Cash1-позитивные), которые в свою очередь генерируют непосредственно клетки нейрональных предшественников (Ngn1-позитивные), которые продолжают делиться и, наконец, дифференцируются в обонятельные сенсорные нейроны (Kawauchi et al., 2004; Beites et al., 2005). Обонятельные сенсорные нейроны могут характеризоваться экспрессией Gap43 (Baizer et al., 1990), члена Hu класса РНК-связывающих белков, которые маркируют постмитотические нейроны, [HuC/D (Fornaro et al., 2003)] и Lhx2 (Kolterud et al., 2004).
Проводились генетические исследования мышей с целью выяснения роли этих транскрипционных факторов в обонятельном нейрогенезе. Мыши, мутантные по Mash1 (mouse homologue of chicken Cash1), неспособны генерировать обонятельные предшественники, а значит и обонятельные нейроны, помимо др. нейрогенных дефектов (Cau et al., 2002; Murray et al., 2003). У Ngn1 нулевых мутантных мышей дифференцировка нейральных предшественников в обонятельном эпителии заблокирована (Cau et al., 2002), тогда как Lhx2-дефицитные мыши обнаруживают относительно нормальную организацию обонятельного эпителия, но обнаруживают нарушения генерации обонятельных сенсорных нейронов (Hirota and Mombaerts, 2004; Kolterud et al.,2004). Поэтому экспрессия некоторых нейрогенных маркеров была отдельно описана в обонятельной ямке мыши (Cau et al., 1997, 2000, 2002; Hirota and Mombaerts, 2004; Kolterud et al., 2004). Однако сравнение паттернов нейрогенной экспрессии между видами не производили и экспрессия нейрогенных маркеров не изучалась в обонятельном эпителии кур. Более того, анализ коллективный временного и пространственного паттерна экспрессии этих маркеров не проводилс и у др. видов. такой анализ мог бы определить передне-заднее и верхне-нижнее положение предшественников, незрелых и зрелых нейронов в разные временные точки в обонятельном эпителии.
В данном исследовании анализировали временную и пространственный паттерны экспрессии Hes5, Cash1, Ngn1, Gap43, HuC/D и Lhx2 во время раннего развития обонятельных плакод у кур и обонятельного эпителия путем анализа ст. HH10, ещё до того как плакоды станут морфологически различимы до ст. HH34, когда формируются самостоятельные чашеобразные структуры (turbinates). Отобранные маркеры определяют клетки разных стадий в обонятельном сенсорном нейрональном клоне, это позволяет визуализировать прогресс от стволовых клеток и клеток предшественников к дифференцированным нейронам. Когда возможно мы сравнивали свои результаты с опубликованными данными по мышам, корректируя стадии развития кур и мышей, исходя из сравнения морфологии обонятельного эпителия и головы (Kaufman, 1998; Bellairs and Osmond, 1998).

RESULTS AND DISCUSSION

Onset of Hes5 Expression in Prospective Olfactory Placodal Cells


Hes-гены, как известно, являются мишенями Delta-Notch сигнального пути (Jarriault et al., 1995). Роль Hes-генов в развитии обонятельного эпителия двойная; на ранних ст. развития Hes-гены участвуют как пре-паттерн формирующие гены, предопределяющие домен нейрогенеза внутри области обонятельных плакод, тогда как на более поздних стадиях Hes-гены участвуют в контроле количества нейральных предшественников, возникающих в этом домене за счет негативной регуляции нейрогенеза (Cau et al., 2000). Предыдущие исследования на мышах показали, что Hes5 экспрессируется в обонятельном эпителии на ст. E10.5 (~HH18 у кур) (Cau et al., 2000). У кур описаны три Hes5-подобных гена (Hes5-1, Hes5-2, Hes5-3)(Fior and Henrique, 2005). Т.к. Hes5-1, Hes5-2 и Hes5-3 обнаруживают сходные паттерны экспрессии в обонятельном эпителии (data not shown), поэтому в данном исследовании Hes.5 экспрессия представлена Hes5-1 и обозначается как Hes5. Полученные результаты показывают, что Hes5 может быть обнаружен в передне-латеральной головной эктодерме кур уже на ст. HH10 (Fig. 1B1-2). Базируясь на картах судеб у кур на ст.HH10, которые показывают, что клетки предшественники обонятельных плакод расположены в наиболее передней части эктодермы (Bhattacharyya et al., 2004), мы пришли к выводу, что Hes5-позитивный регион соответствует проспективным плакодным клеткам. Домен ранней экспрессии Hes5 униформен, это указывает на то, что у кур Hes5 участвует в формировании пре-паттерна проспективных обонятельных плакод. Более того, на этой ст. не обнаруживается экспрессия Cash1. Ngn1, GAP43, HuC/D или Lhx2 (data not shown). Т.о., на ст. HH10 проспективные обонятельные плакодные клетки экспрессируют Hes5, который, по-видимому, является самым ранним маркером, ассоциированным с нейрональной детерминацией обонятельных плакод у кур.

At HH14, Olfactory Placodal Cells Express Hes5, Cash1, Ngn1, Gap43, and HuC/D


На ст. HH14 (~ 22 сомита) обонятельный плакодный эпителий начинает утолщаться (Fig. 2A). В предыдущих исследованиях кур отслеживались первые миграторные клетки, происходящие из обонятельных плакод, наз. epithelioid клетками (Croucher and Tickle. 19S9: Drapkin and Silverman. 1999) ~ HH14 путем анализа HuC/D-позитивных клеток, выявляющего ранние постмитотические нейроны (Fornaro et al.. 2001). Однако паттерн экспрессии Hes5, Cash 1, Ngn1, Gap43 или Lhx2 не был исследован ни у кур, ни у мышей на этой стадии. Наши результаты показали, что на ст. HH14, помимо экспрессии Hes5 в немногих клетках может обнаруживаться экспрессия Cash1, Ngn1 Gap43 и HuC/D области обонятельных плакод (Figs. 2B-F). Экспрессия Lhx2 не обнаруживается внутри или около плакод на этой ст. Hes5 экспрессируется в широком домена, распространяющемся почти на всю область обонятельной плакоды (Fig 2B,1-4) Напротив, Cash1, который маркирует временно амплифицирующиеся клетки предшественники, может обнаруживаться только в немногих клетках передней части обонятельной плакоды (Fig. 2C1_4). Более того, на этой ст. нейрональные маркеры Ngn1, Gap43 и HuC/D также экспрессируются в немногих клетках передне-латеральной области обонятельной плакоды (Fig. 2D2,3; E 2,3 F1-3) , но отсутствуют в наиболее задней части плакоды (Fig. 2D4 E4 F4). Более того, на этой ст.обнаруживаются немногие Ngn1, Gap43 и HuC/D-позитивные нейроны в головной мезенхиме вблизи плакодного эпителия (Fig. 2D2, E2 , F1 arrowheads), выявляя первые клетки, мигрирующие прочь от обонятельной плакоды. Функция этих рано вычленяющихся нейронов остается неясной, хотя они, как полагают, перфорируют базальную ламину обонятельного эпителия, создавая отверстия, которые позднее используются возникающими обонятельными аксонами (Drapkin and Silverman, 1999), когда строится тракт обонятельного нерва и мигрирует в направлении переднего телэнцефалона (Fornaro et al., 2003). Предыдущие исследования на мышах описали самую раннюю экспрессию Mash 1 и Ngn1 в обонятельном эпителии около ст. E10.5 (Cau et al., 1997, 2000). Наши результаты показали, что в развивающейся обонятельной плакоде кур Cash1, Ngn1 и Gap43 экспрессируются на ст. НН14 (~E9.5 у мыши). Различия в начале экспрессии Mash1/Cash1 и Ngn1 у кур и мышей скорее всего обусловлено отсутствием анализа на более ранних ст. у мыши скорее, чем видовыми различиями, но это ещё предстоит подтвердить.

Lhx2 Expression Is First Detected in the Olfactory Placode at HH17


Мы анализировали экспрессию нейрогенных маркеров в обонятельной плакоде на ст. НН17 (~30 сомитов). На этой ст. эпителий плакоды существенно утолщен по сравнениию с HH14 и становится видимым в виде зубца в передене-латеральной позиции головы. Hes5 всё ещё строго экспрессируется почти во всех клетках обонятельной плакоды (Fig. 3B1-4), и только в наиболее задней части обонятельной плакоды уровень экспрессии Hes5 снижается (Fig. 3B5). На этой ст., Cash1 is экспрессируется только в немногих клетках в медиальной части плакоды, тогда как сильная экспрессия Cash1 ограничивается клетками, расположенными в базальной части эпителия по соседству с мезенхимой и краем плакоды ( Fig. 3C2_4). Подобно паттерну экспрессии Cash1 обонятельные нейрональные маркеры Ngn1, Gap43 и HuC/D экспрессируются в клетках, расположенных в медиальной части плакоды и большинство Ngn1-, Gap43- и HuC/D-позитивных клеток находится вблизи базальной ламины (Fig.3D2,3, E2,3, F2-4). Только на ст. HH17 начинает обнаруживаться экспрессия Lhx2 в медиальной части плакоды в немногих округлой формы клетках вблизи базальной ламины (Fig. 3G2,3, arrow). Кроме того, экспрессия Ngn1, Gap43, HuC/D и Lhx2 также обнаруживается в нейронах, мигрирующих прочь от плакоды, наз. мигрирующей массой в направлении передней части телэнцефалона (Fig. 3D2, E2_4, F2,3, G2,3, arrowheads). Т.о., относительно небольшое количество Lhx2-позитивных клеток в медиальной части обонятельного эпителия сравнимо с количествами Lhx2-позитивных клеток в мигрирующей массе, указывая, что на ст. HH17 большинство дифференцированных нейронов в обонятельном эпителии покидает плакоду и мигрирует прочь. Это согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими, что нейроны, возникшие первыми в обонятельном эпителии, покидают плакоду и строят и расширяют обонятельный нерв (Croucher and Tickle, 1989; De Carlos et al.. 1995). Кроме того, предыдущие исследования продемонстрировали, что обонятельный нерв очевиден на ст. HH18 в виде дорожки, вдоль которой разные обонятельные клетки эпителиального происхождения мигрируют в направлении передней части телэнцефалона (Croucher and Tickle, 1989; De Carlos et al., 1995; Drapkin and Silverman, 1999). Наши результаты показывают, что на ст. HH17 все Lhx2-позитивные миграторные клетки экспрессируют HuC/D, но не все HuC/D клетки являются Lhx2 позитивными ( Fig. 3H), указывая тем самым,что на этой ст. могут быть , по крайней мере, две подгруппы HuC/D-позитивных нейронов, мигрирующих из обонятельных плакод; однако, судьба этих нейронов неясна. Итак, мы показали, что нейрогенез начинается в обонятельной плакоде ещё до инвагинации обонятельного эпителия.

Neurogenesis in the Olfactory Pit Proceeds Along Distinct Axes


На ст. HH18, обонятельные плакоды начинают инвагинировать и к HH22 (~E12.25 у мыши) формируется обонятельная ямка чашко-образной формы (Fig. 4). Край обонятельной ямки называется inferior регионом, тогда как инвагинировавшая часть эпителия наз. superior регионом (Fig. 4).У мыши ст. E10.5-E12 являются самыми ранними стадиями, на которых были изучены отдельно нейрогенные маркеры в обонятельном эпителии (Cau et al., 1997, 2000, 2002). Однако в этих исследованиях не были проанализирована экспрессия различных нейрогенных маркеров на разных передне-задних уровнях обонятельного эпителия. Чтобы проанализировать этот вопрос в деталях мы коллективно исследовали паттерн экспрессии Hes5, Cash 1, Ngn1, Gap43, HuC/D и Lhx2 на ст. HH22. Как и на более ранних ст. развития, Hes5 экспрессируется в большинстве клеток обонятельной ямки и отсутствует в inferior регионах ямки (Fig. 4B1-6). На ст. HH22, домен экспрессии Hes5 в обонятельной ямке выглядит неоднородным ( Fig. 4B2-6), в соответствии с ролью Hes-генов в Notch-обеспечиваемой латеральной ингибиции в нейрогенной области обонятельной ямки (Cau et al., 2000). На ст. HH22, экспрессия Cash1 исключается из наиболее передней области обонятельной ямки (Fig. 4C1). В медиальной части ямки экспрессия Cash1 локализуется в inferior регионе обонятельного эпителия (Fig. 4C2,3), тогда как в задней части обонятельной ямки Cash1-позитивные клетки обнаруживаются в superior регионе эпителия (Fig. 4C4-6). На ст. HH22, Ngn1, Gap43 и HuC/D экспрессируются в виде рассеянных паттернов вдоль передне-задней оси обонятельной ямки при этом большинство экспрессирующих клеток находится в superior регионе передне-медиальных уровней (Fig. 4D2-4, E2-4, F2-4). В задней части обонятельной ямки количество Ngn1-позитивных клеток выше (Fig. 4D5,6, по сравнению с Gap43- и HuC/D-позитивными нейронами (Fig. 4Е5,6, F5,6). Экспрессия Ngn1 обнаруживается как в апикальной, так и базальной частях обонятельного эпителия случано распределенной вдоль передне-задней оси (Fig. 4D1_6). Напротив, Gap43- и HuC/D-позитивные клетки локализуются в базальной части эпителия по соседству с мезенхимой и наивысший уровень экспрессии Gap43 и HuC/D обнаруживается в медиально-superior регионе обонятельной ямки (Fig. 4E2-4, F2-4). Более того, на ст. HH22, Lhx2 экспрессируется в субнаборе HuC/D-позитивных клеток в медиальной части обонятельной ямки в наиболее superior регионе эпителия (Fig. 4G3,4,H). Более ограничены домены экспрессии Gap43, HuC/D и Lhx2в медально-superior части обонятельной ямки, по сравнению с более широкой экспрессией Cash1 и Ngn1, это четко напоминает тот факт, что Cash1 и Ngn1 экспрессируются клетками нейральных предшественников, тогда как Gap43, HuC/D и Lhx2 экспрессируются обонятельными сенсорными нейронами. На этой ст. наблюдается мало очевидной дивергенции в паттернах экспрессии Hes5, Cash1, Ngn1, Gap43 и Lhx2 в середине передне-задней оси обонятельной ямки у кур по сравнению с экспрессией у мыши (Cau et al.. 1997. 2000. 2002; Hirota and Mombaerts, 2004; Kolterud et al., 2004). Однако наши результаты показывают. что нейрогенез в обонятельной области протекает вдоль определенных осей обонятельной ямки, с наиболее дифференцированными нейронами, расположенными в medial-superior позициях. Кроме того, на этой ст. экспрессия Ngn1, Gap43, HuC/D и Llix2 также обнаруживается в миграторных нейронах, которые выходят из обонятельного эпителия (Fig. 4D1-2, E1-2, F1-2, G1-3). Предыдущие исследованияна курах показали, что приблизительно на ст. HH22 небольшая фракция миграторных клеток является GnRH (gonadotropin-releasing hormone) нейронами, которые мигрируют посредством обонятельного нерва в гипоталямус (Mulrenin et al., 1999).
На ст. HH25 паттерны экспрессии Hes5, Cash1, Ngn1, Gap43, HuC/D и Lhx2 сходны с паттернами экспрессии на ст. HH22, но количества нейронов увеличиваются (data not shown), это согласуется с прогрессированием нейрогенеза в обонятельном эпителии.

By HH29, Hes5 Is Expressed in a Scattered Manner in the Olfactory Epithelium


Примерно на ст. HH29 (~ E14 у мыши), морфология носовой полости начинает меняться и начинают формироваться носовые conchae (Croucher and Tickle. 1989; Leibovici et al.. 1996). Обонятельный и респираторный эпителий теперь могут быть отличены лр. от др. по своей морфологии (Croucher and Tickle, 1989; Leibovici et al.. 1996). Обонятельный эпителий толще и расположен внутри головной мезенхимы (Fig. 5A), но на этой ст. стратификация ещё не началась. По сравнению с мышами, где обонятельный эпителий начинает приобретать многослойную морфологию около ст. E12.5 (Cau et al., 2000), развитие обонятельного эпителия у кур осуществляется заметно медленнее. Респираторный эпителий является тонким слоем клеток и располоагется дистально в носовых ходах (Fig. 5A). Не обнаруживается экспрессии Hes5, Cash1, Ngn1, Gap43, HuC/D или Lhx2 в респираторном эпителии (Fig. 5B-G), это согласуется с тем фактом, что дыхательный эпителий не дает обонятельных сенсорных нейронов.
На ст. HH29, хотя Hes5 экспрессируется почти во всей нейрогенной области, уровни экспрессии значительно ниже, чем на более ранних стадиях и паттерн salt-and-pepper-Iike четко различим (Fig. 5B1-4), в согласии с ролью Hes5 в латеральной ингибиции (Cau et al., 2000). В соответствии с экспрессией Hes5 немногие разбросанные Cash1-позитивные клетки могут быть выявлены по всей нейрогенной области (Fig. 5C1-4). На этой ст., Ngn1 экспрессируется в виде salt-and-pepper паттерна вдоль всего обонятельного эпителия (Fig. 5D1-4). Более того, большинство клеток в обонятельном эпителии экспрессирует Gap43 и HuC/D (Fig. 5E1-4, F1-4), а субнабор HuC/D-позитивных клеток экспрессирует Lhx2 (Fig. 5G1-4). На ст. HH29. мигрирующие нейроны, которые слудуют по обонятельному нерву в направлении телэнцефалона, экспрессируют Gap43, HuC/D и Lhx2 (Fig. 5E2 and data not shown).

Stratification of the Chick Olfactory Epithelium Is First Detected at HH34


На ст. HH34, Hes5 экспрессируется в апикальной части обонятельного эпителия верхней конхи (Fig. 6A). Большинство Cash1- и Ngn1-позитивных клеток также присутствует в апикальной области, а немногие Cash1- и Ngn1-экспрессирующие клетки выявляются в срединной области обонятельного эпителия (Fig. 6В, С). На этой ст. Gap43, HuC/D и Lhx2 экспрессируются преимущественно в базальной части эпителия, но Gap43-, HuC/D- и Lhx2-позитивные клетки выявляются вдоль всей апикально-базальной оси обонятельного эпителия (Fig. 6D-F). Т.о., на ст. HH34,инициальная стратификация обонятельного эпителия у кур становится отчетливой.
Итак, в данном исследовании мы описали детально временную и пространственную экспрессию Hes5, Caslil, Ngn1, Gap43, HuC/D и Lhx2, во время ранних стадий нейральной детерминации и нейрогенеза в обонятельном эпителии кур. Hes5 экспрессируется в проспективной обонятельной плакоде уже на ст. HH10, раньше, чем описывалось прежде и до того как плакода станет морфологически видимой, указывая тем самым, что Hes5 может участвовать в детерминации нейрогенной области эпителия. Более того, наши результаты показали, что нейрогенез начинается в обонятельной плакоде до инвагинации обонятельного эпителия. На ст. обонятельной ямки как передне-заднее, так и superior-inferior различия исследуемых нейрогенных факторов становятся очевидными, при этом большинство дифференцированных нейронов оказывается локализованным в medial-superior положении. Напротив, на ст. HH29 нейрональные маркеры Gap43, HuC/D и Lhx2 экспрессируются равномерно по всему обонятельному эпителию. Разные паттерны экспрессии нейрональных маркеров между HH22 и HH29 скорее всего отражают пространственную экспансию нейрогенеза из рано ограничиваемой медиальной области ямки на ст. HH22 до всего обонятельного эпителия на ст. HH29. На ст. HH34, стратификация обонятельного эпителия кур четко обнаружима, при этом маркеры предшественников Hes5, Cash1 и Ngn1 экспрессируются в апикальной части эпителия, тогда как нейральные маркеры Gap43, HuC/D и Lhx2 экспрессируются преимущественно в базальной части обонятельного эпителия. Полученные результаты паттерна экспрессии нейрогенных маркеров в обонятельном эпителии кур согласуются с ранее опубликованными данными на мышах и указывают на то, что существует законсервированный паттерн нейрогенеза обонятельного эпителия у позвоночных.
Сайт создан в системе uCoz