Реснички являются эволюционно законсервированными органеллами, которые обеспечивают подвижность, сенсорные и транспортные функции и необходимы для нормального развития и физиологии позвоночных^2-5. Поэтому дефекты ресничек лежат в основе широкого спектра болезней человека^{4, 5}. Среди ролей в ресничатых органах в эмбриогенезе позвоночных вклад ресничек в развитие внутреннего уха остается изученным слабо. У рыбок данио, Danio rerio, было предположено, что движения ресничек участвуют в биогенезе отолитов⁶, которые являются аналогами otoconia в отолитической мембране уха человека. Эти биоминерализованные частицы создают инерционную массу, которая облегчает девиации лежащих в основе микроворсинок и ресничек, инициируя тем самым сигнальные события, которые позволяют головному мозгу воспринимать звуки, тяжесть и линейное ускорение^{1, 7-9}. Во время раннего развития возникающие отолиты формируются из пула частиц предшественников и прикрепляются к ресничкам в отическом пузырьке⁶.

У простейших подвижность ресничек контролируется с помощью Dynein Regulatory Complex (DRC), который регулирует активность аксонемного dynein в ответ на сигналы от аппарата из радиальных спиц и центральной пары^10-15. Субъединица DRC trypanin законсервирована в разнообразных филетических группах^15-18, а гомолог trypanin у позвоночных (человека), growth arrest-specific 8 (here called GAS8, в согласии с базой данных HUGO, но также и первоначально обозначаем как GAS11) является белком, связывающим микротрубочки, локализованным в регионах регуляции dynein в клетках млекопитающих^19-21. Однако пока потребность в GAS8 и в DRC у позвоночных не установлена. Мы идентифицировали единственный гомолог trypanin у рыбок данио, кодирующий белок, который на 63.8% идентичен белку GAS8 человека и на 32.0% идентичен trypanin из Trypanosoma brucei (Fig. 1). Идентичность последовательностей и консервативная геномная структура (Fig. 2a)^{15, 22} указывают на то, что этот белок рыбок данио, обозначенный как Gas8, в самом деле член этого консервативного семейства dynein регуляторных белков^{13, 15}. Материнские gas8 транскрипты повсеместны у эмбриона во время раннего развития (Fig. 1b, c). На стадии 12 сомитов, однако, экспрессия становится сконцентрированной в развивающихся ушах (Fig. 1d, arrow) и персистирует в течение стадий 18- до 20-сомитов (Fig. 1e, Supplementary Fig. 1). Транскрипты также четко присутствуют в головном мозге, нервной трубке и пронефрических протоках (Fig. 1f-h). Следовательно, gas8 экспрессируется в реснитчатых тканях во время органогенеза у рыбок данио.

Чтобы определить, как потеря экспрессии gas8 влияет на развитие рыбок данио мы использовали антисмысловые morpholino олигонуклеотиды (Fig. 2). Гидроцефалия, гибель клеток нервной трубки и дефекты лево-правосторонней оси являются обычными у цилиарных морфантов и мутантов³ и были очевидными у gas8 морфантов (Fig. 2, Supplementary Fig. 2). Принимая во внимание высокую экспрессию gas8 в отическом пузырьке, мы исследовали развитие уха более тщательно. Спустя 2 дня после оплодотворения атрофия внутреннего уха очевидна у gas8 морфантов. Длина вдоль передне-задней оси была на 30% меньше, чем у контрольных эмбрионов (morphants, 52 ± 6 µm, n = 15; control, 73 ± 7 µm, n = 8; 24-27 hours post-fertilization (h.p.f.); see, for example, Figs 2e, f, 3a, b). На третий день после оплодотворения. в точности два отолита присутствуют у контрольных рыбок данио, один на переднем конце и один на заднем конце отического пузырька, расположенного вентральнее полукружных каналов⁶. Напротив у gas8 морфантов наблюдалось аномальное количество отолитов, слитые отолиты, аномально расположенные отолиты и небольшие отолиты (Fig. 2g-m). Исследование 24-h.p.f. и 27-h.p.f. эмбрионов показало, что тот же самый спектр дефектов обнаруживается во время начала образования отолитов (Fig. 2n-p). Фенотип отолитов пенетрантен на 95-100% , а совместные инъекции in-vitro-транскрибированной gas8 мРНК, несущей мутации 5 несовпадений пар оснований, чтобы предупредить morpholino гибридизацию устраняли дефект у большинства эмбрионов (Fig. 2g). Т.к. формирование паттерна внутреннего уха тесно связано с формированием паттерна neuraxis²³, то анализировали маркеры заднего мозга (egr2b), среднего мозга (eng2a), переднего мозга (otx2), передне-вентральной области внутреннего уха (fgf8a)²⁴ и во внутреннем ухе передне/задней оконечностей (bmp4)²⁵. Мы не выявили различий между контролем и gas8 morphants (data not shown). Следовательно, дефекты отолитов не связаны с аномалиями neuraxis или формированием паттерна внутреннего уха.

Обусловлены ли дефекты отолитов несоответствующим образованием или расположением ресничек в отическом узелке. Спустя 24 h.p.f., видны два класса ресничек в отическом пузырьке⁶ (Fig. 3a, Supplementary Movie 1). Многочисленные короткие реснички были широко разбросаны по всему отическому пузырьку, а небольшие участки более длинных 'tether' ресничек обнаруживались исключительно на переднем и заднем полюсах. Между 19 и 27 h.p.f., небольшие предшественники частиц соединялись на ограниченных (tether) ресничках, чтобы сформировать передний и задний отолиты⁶. Исследовали распределение ресничек и их размеры у морфантных эмбрионов во время критического временного промежутка 19-27 h.p.f., когда реснички, как предполагается, начинают действовать по сборке отолитов. На ст. 20 сомитов (соотв. приблизительно19 h.p.f. у дикого типа), контрольные и морфантные эмбрионы имеют реснички в развивающемся отическом пузырьке (data not shown). gas8 морфанты при этом обнаруживали незначительную задержку развития, общее свойство морфантных рыб. Поэтому, мы определяли стадии, базируясь на онтогенетической прогрессии, определенной в ref. 26. На ст. 24 h.p.f., как короткие, так и tether реснички обнаруживались в соотв. местах у контрольных и gas8 morphant эмбрионов (Fig. 3b, Supplementary Movie 2). Размеры отического пузырька были уменьшены, как отмечалось выше, но мы не обнаруживали существенных отличий в длине ресничек между контрольными (tether, 5.9 ± 0.2 µm; short, 1.4 ± 0.1 µm; n = 5 embryos) и morphant (tether, 5.9 ± 0.4 µm; short, 1.2 ± 0.2 µm; n = 7 embryos) эмбрионами. На более поздних стадиях, tether реснички персистируют, тогда как короткие реснички начинают исчезать, как и ожидалось⁶ в контрольных и morphant эмбрионах (data not shown). Реснички обнаруживались также в пронефрических протоках и нервной трубке у gas8 морфантов (data not shown). Следовательно, потеря экспрессии gas8 не предупреждает образования и поддержания или правильного позиционирования ресничек.

Т.к. гомологи GAS8 у простейших, trypanin у T. brucei и paralyzed flagella 2 у Chlamydomonas reinhardtii, специфически участвуют в контроле за колебаниями ресничек^13-15, поэтому изучали подвижность ресничек in vivo, с помощью высокоскоростной видео микроскопии. У всех контрольных эмбрионов обнаруживаются от одной до трех колеблющихся tether ресничек вблизи каждого возникающего отолита (Fig. 3, Supplementary Fig. 3, Supplementary Movies 3-5). Колебания ресничек непосредственно участвуют в формировании отолита или располагаются непосредственно вблизи (5-10 µm удаление), часто заставляя осциллировать сам отолит (Supplementary Movies 3, 5). Эти колебания ресничек с частотой 34 ± 6 Hz (n = 20) на 24 h.p.f. Короткие реснички неподвижны (Supplementary Movie 6). Это контрастирует с предыдущим сообщением, показавшим, что tether реснички неподвижны, тогда как короткие реснички распределены по всему уху и подвижны⁶. Причина такого расхождения неясна, но возможно это обусловлено техническими трудностями, связанными с наблюдениями за подвижными ресничками, что было установлено косвенно в ранних работах и наблюдалось непосредственно здесь. У gas8 морфантов на каждой изученной стадии (19-27 h.p.f.), большинство эмбрионов обладало неподвижными tether ресничками (60%, n = 30; Fig. 3, Supplementary Fig. 3, Supplementary Movies 7-8). Итак, gas8 морфанты обладают эктопическими отолитами, расположенными у основания неподвижных tether ресничек (Fig. 2o). В некоторых случаях морфанты обладают эктопическими колеблющимися ресничками (23%, n = 30). Чтобы подтвердить, что ушной фенотип обусловлен неподвижностью ресничек, а не потерей др., неизвестной функцией gas8 вызывали нокаут двух генов, непосредственно участвующих в подвижности ресничек: ген для белка leucine-rich repeat-containing 50, lrrc50, наружного плеча субъединицы dynein, необходимого для подвижности ресничек^{27, 28}; и left-right dynein ген dnah9, хорошо охарактеризованный двигательный белок, участвующий в подвижности ресничек²⁹. Те же самые результаты были получены после нокдауна lrrc50 (Supplementary Figs 4, 5). Более того, одновременный нокдаун lrrc50 и dnah9 оказывает синергичный эффект, вызывающий более значительные дефекты подвижности и отолитов, чем каждый одиночный нокдаун. Эти воздействия не затрагивали ни развития головного мозга и не вызывали гибели клеток нервной трубки и перикардиального отека. Во всех случаях аномальные размеры, количество и расположение отолитов непосредственно коррелировали с нарушениями подвижности ресничек у морфантов (Supplementary Fig. 4).

Отолиты представляют собой композитные кристаллы, собираемые из общего пула малых частиц предшественников. Авт. полагают, что дефекты отолитов в морфантов с нарушениями ресничек возникают как следствие аномального тока жидкости и сопутствующей неспособности собственно управлять перемещениями частиц предшественников. Чтобы протестировать эту гипотезу мы изучали паттерны тока жидкости в отическом пузырьке путем отслеживания перемещений предшественников отолитов при высоком временном разрешении. Наблюдалась прямая корреляция между биениями ресничек и током жидкости (Fig. 4, Supplementary Movies 9-11). У контрольных эмбрионов перемещение частиц предшественников вблизи отолита было неслучайным, тогда как оно на удалении от отолита превращалось в Броуновское движение (Fig. 4g, h, Supplementary Movies 9-10), в соответствии с предыдущим сообщением⁶. Биения ресничек запускали локальный ток вблизи отолита, привлекая предшественников к основанию tether реснички и направляя их в направлении отолита (Supplementary Fig. 6, Supplementary Movies 9-10). Напротив, у gas8 морфантов частицы вблизи tether ресничек обнаруживали чисто диффузное поведение (Fig. 4, Supplementary Movie 11). Следовательно, отсутствие биений ресничек ограничивает частицы случайным перемещением, приводящим к образованию эктопических агрегатов.

Полученные результаты демонстрируют, что Gas8 необходим для нормальной подвижности ресничек в отическом пузырьке и существенен для нормального развития уха. Отический пузырек является закрытым эпителиальным органом и ток жидкости в нем, как полагают, вносит вклад в формирование отолитов⁶. Наше исследование предоставляет прямые доказательства в пользу этой гипотезы. На базе высокоскоростной видео микроскопии ресничек и количественного анализа перемещений частиц предшественников, мы предлагаем новый зависимый от ресничек гидродинамический механизм биогенеза отолитов (Fig. 4). В этой модели подвижность tether ресничек на полюсах отического пузырька создает завиток, который привлекает предшественников отолитов (Fig. 4i, l), тем самым предотвращая случайное распределение частиц предшественников и концентрируя их вблизи двух участков tether ресничек. Это гарантирует предпочтительное осаждение на полюсах отического пузырька. На полюсах отического пузырька подвижность tether ресничек далее служит для рассеивания частиц предшественников локально и осцилляции отолитов, увеличивающей область эффективного контакта с предшественниками (Fig. 4j). Итак, это предупреждает частицы от осаждения , чтобы сформировать эктопические агрегаты и способствует эффективному униформному росту отолита. Эта модель объясняет разные свойства фенотипа отолитов, наблюдаемые у gas8 морфантов (Fig. 4k, m).

Наши находки пополняют список онтогенетических процессов, нуждающихся в динамических импульсах от жидкости для собственно роста и формирования паттерна, и показывают, что эпигенетические сигналы являются частью программы эмбрионального развития. У людей дефекты слуха и баланса обычны среди старых и являются наиболее частыми наследственными сенсорными дефектами у новорожденных³⁰. Хотя пациенты с ciliopathies встречаются нечасто, которые приводят к потере слуха⁴, наши результаты д. стимулировать исследования по анализу более легких изменений во внутреннем ухе. Итак, наше исследование демонстрирует потребность в подвижных ресничках в развивающемся ухе позвоночных и подтверждает, что субъединицы DRC д. рассматриваться как кандидаты на роль генов болезни, вносящих вклад в ciliopathies у людей.