Посещений:
РАЗВИТИЕ ЯИЧНИКОВ

Генетический Контроль

To β or not to β : Canonical β-catenin signaling pathway and ovarian development
Sergei G. Tevosian, Nikolay L. Manuylov
Developmental Dynamics 237:3672-3680, 2008

The mammalian embryonic gonad is a unique organ primordium in that it can adopt two different developmental fates - namely, differentiate as either a testis or an ovary - with dramatic consequences for an individual. While a molecular cascade culminating in testis development is well characterized, the ovarian pathways still remain enigmatic. The canonical Wnt/β-catenin signaling implements a conserved mechanism of regulating gene expression that is integral to development of all metazoans. In this review, we summarize the recent evidence that suggests a central role for this signaling pathway in the development of the mammalian female.


Рис.1.  |  The canonical Wnt/β-catenin pathway (modified after Benchabane and Ahmed,[2008]). A: The default off-state. In the absence of a Wnt ligand, cytoplasmic β-catenin is constitutively engaged by a group of proteins termed the destruction complex containing the Axin and Adenomatous Polyposis Coli (APC) proteins. By recruiting the kinases, Casein Kinase 1 and GSK-3, the destruction complex facilitates the phosphorylation of β-catenin. The phosphorylated β-catenin serves as a substrate for the -Trcp E3 ubiquitin ligase that targets it for ubiquitination and proteasome-mediated degradation. B: The on-state. The signaling is initiated by WNT ligand binding to Frizzled (Fz) and LRP5/6 co-receptors ultimately leading to the inhibition of the destruction complex and β-catenin protein stabilization and entry into the nucleus. Nuclear β-catenin binding to T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor (LEF) transcription factors leads to the activation of target gene expression. The RSPO1 protein is thought to facilitate Wnt-Fz-LRP complex formation through fending off a secreted inhibitor, DKK1. C: The regulated off-state. DKK1 binding to the LRP5/6 co-receptor blocks Wnt signal transduction by preventing formation of the Wnt-Fz-LRP5/6 signaling complex.


Рис.1.  |  The canonical Wnt/β-catenin pathway is active in the embryonic ovaries but not the testes. The gonads from the embryos carrying an Axin2lacZ allele were stained for β-galactosidase (lacZ) expression. The samples (13.5 dpc) are oriented with the anterior end toward the left; the gonad (g) and the mesonephros (a segmentally organized structure that serves as a base for the gonad and a duct system, m) are separated by the dotted line. A,B: The downstream target of the canonical β-catenin pathway, Axin2, is expressed in the ovary (B) and not the testis (A).


Рис.1.  |  Sexual differentiation in mammals is driven by the opposing antagonistic activities of the transcriptional regulatory proteins: SOX9 in males and β-catenin/T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor (LEF) in females.

У большинства млекопитающих Sry, с Y хромосомой сцепленный тестисы-детерминирующий ген, инициирует детерминацию пола самцов и ведет к формированию семенников скорее, чем яичников из бипотенциальных эмбриональных гонад (e.g., Swain and Lovell-Badge,[1999]; Capel,[2000]; Wilhelm et al.,[2007]).
Sry экспрессия на 10.5-11 days postcoitum (dpc) сразу же запускает несколько выраженных клеточных трансформаций в эмбриональных семенниках мышей; напротив, в это же время эмбриональные яичники, по-видимому, не подвергаются каким-либо крупным морфологическим изменениям и выглядят дремлющими (rev. Brennan and Capel,[2004]). Первые цитологически обнаружимые признаки овариального ландшафта появляются только на 13.5 dpc, когда гоноциты вступают в мейоз; однако даже этот специфичный для самок процесс рассматривается как независимый от окружения яичников. Идея, что дифференцировка яичников нуждается в своём собственном наборе генов и происходит вскоре после (Eicher and Washburn,[1986]) или даже предшествует (McElreavey et al.,[1993]) таковой тестисов, главенствовала многие последние годы; однако гены, предназначенные для раннего развития яичников были идентифицированы только в начале 21-го столетия. Во многих лабораториях было открыто несколько sexually диморфных генов в развивающихся яичниках и выясняются теперь взаимоотношения между этими генами (e.g., Menke and Page,[2002]; Menke et al.,[2003]; Yao et al.,[2004]; Jorgensen and Gao,[2005]; Nef et al.,[2005]; Bouma et al.,[2007a]).
У самцов и самок предопределение и дифференцировка пола, как полагают, инициируется с помощью пол-специфических транскрипционных факторов в ограниченном количестве соматических клеток в зачатках гонад, чтобы позднее расшириться и усилиться с помощью внеклеточных сигналов с каскадом, достигающим кульминации во время развития соотв. органа (Kim and Capel,[2006]).

WNT SIGNALING PATHWAYS IN VERTEBRATES


Wnts составляют крупное семейство (19 гомологов у позвоночных) секретируемых белков. которые играют ключевые роли в разнообразных процессах, таких как эмбриональная индукция, генерация клеточной полярности и клеточной дифференцировки. Т.наз. канонический или β-catenin-зависимый путь передачи сигналов WNT изучен лучше всего ( rev., e.g., Clevers,[2006]; Gordon and Nusse,[2006]; Huang and He,[2008]; Fig. 1). Эта передача сигналов инициируется с помощью WNT лиганда, соединяющегося с Frizzled (Fz) и LRP5/6 ко-рецепторами, приводя в конечном итоге к стабилизации белка catenin и вступлению его в ядро. Ядерный β-catenin соединяется с T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor (LEF) транскрипционными факторами, приводя к активации экспрессии генов мишеней. Важно, что в отсутствие ядерного β-catenin, TCF/LEF белки действуют как репрессоры транскрипции, рекрутируя Groucho белки (rev. Eastman and Grosschedl,[1999]). Эта способность переключать между состояниями репрессора и активатора, по-видимому, обеспечивает жесткий контроль над экспрессией Wnt генов мишеней. Неканонический (β-catenin независимый) Wnt путь первоначально был описан у мух, у которых передача сигналов Wnt необходима для установления planar cell polarity (PCP). Сходный путь контролирует миграцию клеток во время развития позвоночных (напр., вытягивание оси тела и закрытие нервной трубки; reviewed in Karner et al.,[2006]).
Др. β-catenin-независимым Wnt путем является передача сигналов Wnt/Ca2+ , при которой WNT-Fz ко-рецепторы активируют гетеротримерные G белки и phospholipase C и запускают высвобождение внутриклеточного кальция (Ca2+). остаётся установить, однако, перекрываются ли эти пути или происходит контекст-специфическая индукция отдельных неканонических WNT путей. Первоначально было предположено, что только субнабор WNTs (напр., Wnt1 и Wnt3a) способен индуцировать канонический каскад, тогда как др. (напр., Wnt5a и Wnt4) действуют исключительно неканоническим способом (Wong et al.,[1994]; Shimizu et al.,[1997]). Современные мнения склоняются к др. модели, что члены семейства WNT могут действовать канонически или не канонически в зависимости от доступности рецепторов. Напр., канонический Wnt3a может активировать Rho киназу и PCP путь (Kishida et al.,[2004]), тогда как Wnt5aЮ как недавно было установлено, действует или канонически в присутствии LRP5/Fz4 рецепторного комплекса или супрессирует канонический путь, действуя посредством др. рецептора, ROR2 (Mikels and Nusse,[2006]). Неканоническая Wnt сигнальная трансдукция и перекрестные взаимодействия канонического и неканонических Wnt путей, по-видимому, очень сложны; эти механизмы только начинают понимать (Cadigan and Liu,[2006]; Kikuchi et al.,[2007]).

WNT SIGNALING IN THE DEVELOPING GONADS


Хотя несколько членов семейства Wnt экспрессируются в развивающихся гонадах млекопитающих (Kimura et al.,[2006]; Cederroth et al.,[2007]) превалирует Wnt4, который ассоциирует с половым развитием. Первоначально XX и XY зачатки гонад экспрессируют средние уровни Wnt4; однако эта экспрессия быстро подавляется у самцов после предопределения пола на 11.5 dpc, в то же время увеличивается у самок (Vainio et al.,[1999]; Jeays-Ward et al.,[2003]).
Роль Wnt4 в половом развитии изучали с помощью нокаутных и трансгенных экспериментов у мышей. Wnt4-нулевые самки маскулинизируются, что проявляется в отсутствии Мёллеровых протоков и сохранении Вольфовых протоков; Wnt4 дефицит также приводит к драматическому снижению количества развивающихся ооцитов. Дальнейшие исследования установили, что Wnt4 необходим, чтобы репрессировать миграцию стероидогенных и сосудистых эндотелиальных клеток в развивающиеся XX гонады; отсутствие Wnt4 ведет к продукции эктопических стероидов (напр., тестостерона) и образованию специфичных для самцов целомических кровеносных сосудов (Jeays-Ward et al.,[2003]; Heikkila et al.,[2005]). Маркеры раннего овариального развития, Follistatin (Fst) и Bmp2, не экспрессируются в отсутствие Wnt4 (Yao et al.,[2004]).
Эффект повышения дозы Wnt4 у мышей довольно умеренный во время эмбриогенеза и в основном ограничивается аномальным развитием целомических кровеносных сосудо у самцов (Jeays-Ward et al.,[2003]; Jordan et al.,[2003]). Напротив, у 4-х известных пациентов XY с дупликацией хромосомного участок 1p35, который включает локус WNT4, симптомы значительно более тяжелые и колеблются от изолированного крипторхизма до тяжелой генитальной двойственности (Jordan et al.,[2003]). Это расхождение может быть объяснено тем фактом, что дупликация у человека включает в себя и ген RSPO1 (см. ниже). Итак, хотя только присутствие ( или отсутствие) экспрессии Wnt4, по-видимому, недостаточно само по себе, чтобы запустить программу дифференцировки соматических клеток, передача сигналов WNT4 всё0таки контролирует некоторые критические элементы программы полового развития. Пока наше понимание передач сигналов Wnt в половой дифференцировке остается недостаточным (rev. Bernard and Harley,[2007]).

Rspo1 and Ovarian Development


Rspo, др. семейство генов с участием в половом развитии самок, также нацелено на путь трансдукции β-catenin. Недавно описанная мутация в гене, кодирующим R-SPONDIN1 (RSPO1) вызывает полное превращение женского в мужской пол, ассоциированное с ладонно-подошвенным гиперкератозом и предрасположенностью к раку кожи у людей (Parma et al.,[2006]). R-spondins (Rspos) был четко установлено как новое семейство растворимых регуляторов передачи сигналов β-catenin (Kim et al.,[2006a]). Член основатель, Rspo1 экспрессируется в целомическом эпителии бипотенциального урогенитального гребня уже на стадии 10.5 dpc, это сопровождается пол-специфическим увеличением в соматических клетках 12.5 dpc XX гонад; на 14.5 dpc, экспрессия в XX гонадах в 5 раз выше, чем в XY гонадах (Parma et al.,[2006]). Механизм действия RSPO белков сегодня неизвестен. Некоторые исследования показывают, что RSPO может непосредственно взаимодействовать с WNT белками и/или использовать Fz/LRP рецепторный комплекс (Kazanskaya et al.,[2004]; Nam et al.,[2006]), тодга как др. указывают на то, что RSPOs может также действовать независимо от WNTs, посредством отдельного рецепторного/сигнального пути, который ведет к активации catenin без использования Fz/LRP комплекса (Kim et al.,[2005],[2006a]). Примирительной моделью действия RSPO является предположение, что RSPO действует в присутствии как WNT, так и DKK лигандов и действует, чтобы уменьшить DKK1-вызываемое ингибирование β-catenin пути (Binnerts et al.,[2007]).
Первое сообщение, указывающее на связь мутации гена RSPO1 на смену пола породило ожидания, что RSPO1 может быть универсальным геном, детерминирующим женский пол; поэтому результаты нокаута Rspo1 у мышей (Chassot et al.,[2008]; Tomizuka et al.,[2008]) ожидали с затаенным дыханием. Внешне результаты выглядели как некий регресс: XX Rspo1-/- мыши оставались фенотипически самками. Более тщательный анализ продемонстрировал, что XX гонады у Rspo1 мутантов подвергаются смене пола, однако она была неполной и эмбриональные мутантные XX гонады напоминали скорее яичники, чем семенники и содержали ооциты. Маскулинизация в отсутствие Rspo1 происходила лишь постнатально и взрослые XX гонады уже походили на семенники с канальцами, лишенными зародышевых клеток.
Хотя мутация Rspo1 не вызывала смены пола, эти животные послужили инструментом для выявления связи между RSPO белками и Wnt/β-catenin каскадом в яичниках. Авт. (Chassot et al.,[2008]) предоставили убедительные доказательства, которые подтверждают роль канонического β-catenin пути в дифференцировке самок; до этой работы доказательства передачи сигналов β-catenin в развивающихся яичниках были неопределенны (Bernard and Harley,[2007]; Bernard et al.,[2008]). Эта неопределенность, по крайней мере, частично вытекала из наблюдения, что эмбрионы, несущие TOPGAL репортер (первый Wnt/β-catenin репортер, широко используемый для проверки мест передачи сигналов β-catenin у мышей; DasGupta and Fuchs,[1999]) , не обнаруживают сигнала в яичниках (напр., Manuylov et al., unpublished observations). Здесь авт. (Chassot et al.,[2008]) использовали более чувствительный репортер, Axin2LacZ , который продемонстрировал присутствие канонической передачи сигналов в соматических клетках развивающихся яичников, но не тестисов (Chassot et al.,[2008] and Fig. 2).
Изучение RSPO1-Wnt4 связи является одним из наиболее удовлетворяющих аспектов работы. Авт. (Chassot et al.,[2008]) показали, что Rspo1 действует выше Wnt4 в каскаде дифференцировки самок: в 12.5 dpc XX Rspo1-/- гонадах Wnt4 драматически подавляется, тогда как в XX Wnt4-/- гонадах уровни Rspo1 не изменяются. Интересно, что специфическое для самок увеличение экспрессии Wnt4 в Rspo1-/- гонадах теряется неполносттью, а только задерживается и с 14.5 dpc и далее экспрессия Wnt4 нормальная. Соотв., в противоположность устранению гена Wnt4, у XX Rspo1 мутантов не обнаруживается драматической потери зародышевых клеток во время эмбриогенеза - хотя две работы слегка отличаются в этом отношении. Обе группы подчеркивают низкие количества гоноцитов, вступающих в мейоз у Rspo1-/- XX мутантов, относя это или за счет изменений в адгезии зародышевых клеток (Chassot et al.,[2008]) или повышенного апоптоза (Tomizuka et al.,[2008]). Т.к. мейотические клетки, как известно, противостоят дифференцировке семенников (Adams and McLaren,[2002]; Yao et al.,[2003]) , то возможно, что низкие количества мейотических гоноцитов у мутантов Rspo1 являются фактором. вносящим вклад в возникновение маскулинизации на более поздних стадиях развития. Нарушение способности зародышевых клеток вступать в мейоз невероятно, однако это может быть единственной причиной маскулинизации, т.к. даже полный блок мейоза не приводит к смене пола (Baltus et al.,[2006]).
Пограмма генной экспрессии самок в XX Rspo1-/- гонадах оказывается под угрозой, это проявляется в драматическом (10-15раз) снижении экспрессии гена Fst; было бы интересно различить, является ли это результатом временной потери гонадами экспрессии Wnt4 (что стоит выше Fst, Yao et al.,[2004]) или это несвязанао с Wnt4. Др. известные элементы женской программы, по-видимому, менее нарушены: экспрессия гена Foxl2 не меняется и экспрессия Bmp2 остается незатронутой (Chassot et al.,[2008]) или сниженной на 50% (Tomizuka et al.,[2008]). Авт. также показали достоверное увеличение при эктопической экспрессии стероидогенных энзимов; однако это опять же скорее всего косвенный результат временной потери экспрессии Wnt4, которая ведет к притоку стероидогенных клеток из мезонефросов, как это описывают (Vainio et al.,[1999]; Heikkila et al.,[2002]; Jeays-Ward et al.,[2003]).
Итак, хотя критическая роль Rspo1 в регуляции развития самок млекопитающих неопровержима, генетическое обеспечение Rspo1-/- фенотипа (особенно механизм поздней смены пола) остается непонятным. Участвует ли обычно Rspo1 в супрессии мужской программы в XX гонадах, также остается неопределенным. Нокаут Rspo1 не включает раннюю индукцию экспрессии Sox9 и, по-видимому, имеет место случай частичной супрессии XX (женской) программы скорее, чем программы смены пола. Транскрипция гена Sox9 и ядерный импорт этого белка в семенниках становится возможны в результате prostaglandin D2, гормона. синтезируемого с помощью prostaglandin D synthase (Pgds; Malki et al.,[2005]; Wilhelm et al.,[2005]); сходным образом, FGF9,как известно, активирует экспрессию Sox9 (Kim et al.,[2006b]). Хотя умеренное увеличение экспрессии генов Pgds и Fgf9 и наблюдается в Rspo1-/- XX гонадах на 14.5 dpc, экспрессия Sox9 , по-видимому, включается только на 18.5 dpc, следовательно, связь между этими событиями может быть косвенной.

β-catenin Stabilization Leads to a Male-to-Female Sex Reversal


Современное мнение на детерминацию пола млекопитающих подчеркивает, что две альтернативные судьбы, женская и мужская, возникают как тесно взаимосвязанные части, детерминируемые антагонистическими активностями. Поэтому, чтобы иметь силу одно д. быть способно сместить баланс в пользу одного из двух возможных исходов развития. Т.к. известно, что активация Sry или Sox9 у самок д. превзойти путь развития яичников и активировать мужскую программу в XX гонадах, но не совсем ясно, может ли женская программа сходным образом накладываться поверх мужской программы при нормальных XY условиях. В противоположность гену Sox9 , который необходим и достаточен для мужской дифференцировки (Vidal et al.,[2001]; Chaboissier et al.,[2004]; Sekido and Lovell-Badge,[2008]) - ранняя активация Sox9 может фактически быть квинессенцией для полной смены пола женского на мужской - нет одиночного женского гена, по-видимому, обладающего обеими этими квалификациями.
Главный успех в деле восстановления необходимой симметрии был достигнут недавно в Blanche Capel's lab, где было установлено, что происходит смена с мужского на женский пол после стабилизации β-catenin пути (Maatouk et al.,[2008]). Эти авт. разумно предположили, что индивидуально потеря Wnt4или Rspo1 у мышей ведет только к частичной смене XX пола. Сходным образом избыточная экспрессия Wnt4 недостаточна для смены пола XY мышей (Jeays-Ward et al.,[2003]; Jordan et al.,[2003]), это указывает на то, что простое увеличение дозы Wnt4 недостаточно для преодоления мужского пути. Однако у XY пациентов, несущих хромосомное удвоение, которое удачным образом включало WNT4 и RSPO1 гены наблюдалась реверсия пола (Jordan et al.,[2001]), это позволило предположить, что позитивная регуляция обоих этих лигандов у мышей может быть необходима, чтобы противодействовать мужскому развитию. Т.к. обе передачи сигналов WNT4 и RSPO1 конвергируют (по крайней мере частично) при активации канонического β-catenin пути, поэтому авт. предприняли более прямой подход: вместо попыток избыточно экспрессировать лиганды они получили постоянно активную (недеградируемую) форму β-catenin (Harada et al.,[1999]) в соматических клетках развивающихся яичников. В своем сообщении авт. убедительно показали, что стабилизация β-catenin достаточна, чтобы блокировать мужской путь в XY гонадах (Maatouk et al.,[2008]). Стабилизация β-catenin ведет к тому, что судьба соматических клеток выключается и теряется специфичная для самцов экспрессия SOX9 и AMH, тогда как экспрессия генов, обычно обнаруживаемых в соматических клетках яичников (Foxl2, Bmp2, Wnt4 и Fst), увеличивается. Неудивительно, что тяжи семенников не образуются у таких XY мутантов (Maatouk et al.,[2008]).
Белок β-catenin может быть стабилизирован (постоянно активированным) путем удаления его N-терминального домена; в своих исследованиях авт. базировались на недавно полученной Sf1-Cre линии мышей (Bingham et al.,[2006]) , чтобы делетировать экзоны, которые кодируют эту часть белка. Хотя хирургически точный подход Sf1-Cre генного таргетинга позволяет активировать β-catenin в определенной популяции клеток, нет гарантии полной эксцизии (а, следовательно, сильной активации гена) внутри желательного периода развития. Это составляло особенно актуальную проблему для быстро развивающегося органа, где появление клеточной популяции с бросающейся в глаза программой генной экспрессии отделено от терминальной дифференцировки этих клеток только узким 24-ч периодом. Др. словами, количество CRE энзима, продуцируемого с трансгена Sf1 д. быть достаточным для генерации в конечном счете достаточно стабилизированного β-catenin - чтобы во время блокировать быструю экспансию мужской программы в XY гонадах.
Хотя XY самки после реверсии пола стабилизированным β-catenin не полностью лишены эмбриональных мужских характеристик, напр., одной из самых ранних характеристик эмбрионов самцов, целомных сосудов. Такое неполное блокирование мужской программы может быть обусловлено ранним взрывом экспрессии Sox9, которая временно возникает в XY гонадах со стабилизированным β-catenin. Остаточная экспрессия Sox9 может быть вызвана задержкой накопления эктопического β-catenin или может быть независимой от β-catenin. Чтобы решить этот вопрос, авт. дополнили свой генетический подход фармакологической активацией Wnt/β-catenin пути с помощью lithium chloride (LiCl) в культивируемых гонадах. LiCl, как известно, блокирует GSK-3 энзим, основной компонент комплекса деструкции β-catenin (Doble and Woodgett,[2003]).
Фармакологический подход позволил завершить и подавить раннюю мужскую программу, включая экспрессию Sox9 и образование сосудов. LiCl-обеспечиваемая стабилизация β-catenin супрессирует оба эти остатка мужской программы, поэтому их взаимозависимость остается неясной. Следует отметить, что эктопические целомические сосуды также формируются у некоторых XX мутантов (напр., Fst, Wnt4 [Yao et al.,[2004]]) и у XX Rspo1 мутантов, они формируются в отсутствие какой-либо обнаружимой экспрессии Sox9 (Chassot et al.,[2008]; Tomizuka et al.,[2008]). Хотя генетический и фармакологический подходы, по-видимому, находятся в согласии, следует учитывать перспективу, что плейотропная природа LiCl может быть фактором, вносящим вклад в строгую блокировку мужской программы: ионы лития могут быть нацелены и на киназы, отличные от GSK-3 (Davies et al.,[2000]); сходным образом, GSK-3 может иметь мишени иные, чем β-catenin (Orme et al.,[2003]).
Каков возможный механизм индукции β-catenin реверсии пола? Авт. (Maatouk et al.,[2008]) предложили кажущуюся неотразимой модель: стабилизированный β-catenin (если экспрессируется достаточно рано) эффективно завладевает раньше др. способствующим мужскому развитию действием SOX9 (Fig. 3). Противоположные действия этих двух белков хорошо документированы. Sox9 ингибирует каноническую передачу сигналов Wnt/β-catenin а яичниках (Chassot et al.,[2008]); SOX белки также, как известно, вмешиваются и в др. β-catenin онтогенетические программы (напр., Liu et al.,[2007]). Гетеродимеризация SOX9 и β-catenin белков при дифференцировке хондроцитов ведет к их взаимной деградации (Akiyama et al.,[2004]; Hill et al.,[2005]). Такая β-catenin-SOX9 взаимная аннигиляция может быть не единственным механизмом: напр., партнеры для β-catenin, TCF/LEF, принадлежат тому же самому HMG-доменовому сверхсемейству, что и SOX белки и такое структурное взаимоотношение намекает на то, что др. сценарии (напр., конкуренция за общего партнера по спариванию или за места связывания ДНК) также возможны. Независимо от механизма. это исследование наконец-то восстановило долгожданную симметрию между двумя противоположными путями полового развития, продемонстрировав, что конституитивная активация женской части канонического β-catenin пути может полностью сдвигать баланс в пользу женского развития.

Analysis of the Sexual Differentiation Phenotype in the Mutants with Somatic Cell Loss of β-catenin


Предопределение пола у млекопитающих нуждается как в GATA4, так и FOG2 транскрипционных регуляторах и базируется на их непосредственном физическом взаимодействии, чтобы сформировать функциональные семенники (Tevosian et al.,[2002]; Bouma et al.,[2007b]; Manuylov et al.,[2007]). Недавние исследования продемонстрировали, что в гонадном развитии GATA4-FOG2 транскрипционный комплекс действует, чтобы контролировать экспрессию генов также и в яичниках (Manuylov et al.,[2008]); контроль развития гонад с помощью GATA4 и FOG2 белков рассмотрен в др. работах.
Связь между GATA4-FOG2 транскрипционной регуляцией и путем Wnt/β-catenin выявлена в экспериментах с микромассивами, которые определяли профили экспрессии генов в Fog2-нулевых или Gata4ki/ki мутантных XX гонадах на 12.5 dpc. GATA4ki является V217G мутацией, которая специфически деформирует взаимодействие между GATA4 и FOG белками; фенотипы гонад у Fog2 нулевых и Gata4ki/ki мутантных эмбрионов в основном идентичны. Кроме того, анализ микромассивов идентифицировал ген Dkk1в качестве мишени для репрессии с помощью GATA4-FOG2 в развивающихся яичниках; экспрессия Dkk1 драматически увеличивается (в 10-раз) в эмбриональных гонадах с потерей взаимодействия GATA4-FOG2 (Manuylov et al.,[2008]). В настоящее время преобладают данные, определяющие DKK1, секретируемый белок, в основном в контексте антагонизма с канонической передачей сигналов Wnt signaling (rev. Niehrs,[2006]; Kikuchi et al.,[2007]). DKK1, является членом основателем семейства DKK, он является мощным ингибитором передачи сигналов Wnt (Glinka et al.,[1998]), он соединяется с LRP рецепторами (LRP5 или LRP6) с высоким сродством (Chen et al.,[2008]) и предупреждает взаимодействие между WNT лигандами и LRPs (Bafico et al.,[2001]; Mao et al.,[2001]; Semenov et al.,[2001],[2008]). Dkks не обнаружены у беспозвоночных, но мыши и люди имеют множественные Dkk гены с 4 основными членами, идентифицированными у позвоночных (Dkk1-4; Krupnik et al.,[1999]; Monaghan et al.,[1999]). Чувствительность к ингибированию с помощью DKK1в подавляющем числе случаев служит в качестве одного из сильнейших доказательств активности канонического Wnt пути в ткани (напр., Liu et al.,[2007]) и может рассматриваться как характерное свойство канонической передачи сигналов β-catenin signaling.
Обнаружение активности Axin2LacZ в яичниках (Fig. 2), её потеря у Rspo1 нулевых генетических самок и активация гена Dkk1 у GATA4 или FOG2 (GATA4/FOG2) мутантов строго указывает на канонический путь передачи сигналов β-catenin в развивающихся яичниках; , однако это не получило убедительного подтверждения. Наиболее прямым подходом демонстрации вклада передачи сигналов канонического β-catenin является обусловленная внешними условиями эксцизия гена β-catenin в яичниках. Условная делеция, появляющаяся при скрещивании Sf1Cre+;cateninflox/+самцов с β-cateninflox/flox самками, чтобы получить экспериментальных животных с Sf1Cre+;cateninflox/flox генотипом. Потеря β-catenin оказывает драматический эффект на программу экспрессии овариальных генов, с важными регуляторами овариального развития - Fst, Wnt4 и Foxl2 - сильно их подавляя (Manuylov et al.,[2008]). Всё ещё диморфная программа генной экспрессии не полностью eподавляется у β-catenin мутантов; напр., специфичный для самок ген Sprr2d (Beverdam and Koopman,[2006]) экспрессируется как в нормальных, так и в β-catenin XX мутантных гонадах.
Fst экспрессия теряется у XX Wnt4 и Rspo1 нулевых мутантов, тогда как в XY гонадах с постоянно активным β-catenin, уровни Fst повышаются. Конституитивно активный β-catenin также достаточен для восстановления развития яичников у Rspo1-нулевых мышей (Chassot et al.,[2008]); хотя экспрессия Fst не была непосредственно изучена в β-catenin яичниках, восстановление указывает на то, что RSPO1 лиганд скорее всего использует β-catenin в регуляции экспрессии Fst. Более того, регуляция Fst промотора с помощью канонической передачи сигналов β-catenin была уже описана в модельной культуре клеток (Miyanaga and Shimasaki,[1993]); мутация предполагаемого TCF сайта связывания (CTTTGAT) в положении -223 до -217 от точка старта транскрипции Fst ведет к устранению реакции WNT3A (Willert et al.,[2002]). Условный нокаут гена β-catenin в гонадах ведет к резкому снижению экспрессии Fst, следовательно, подтверждается существенная потребность в канонической передаче сигналов β-catenin в регуляции Fst in vivo (Manuylov et al.,[2008]).
Делеция β-catenin в яичниках не приводит к активации альтернативного (мужского) пути, что определяется по отсутствию экспрессии мужских регуляторных генов Sox9, Mis/Amh, и Dhh на 13.5 dpc и 18.5 dpc (Manuylov et al.,[2008]). Т.к. модель баланса (Fig. 3) предсказывает, что удаление тяжелого куска с одной чаши весов д. вызывать тот же самый эффект, что и добавление груза на другую, то это до некоторой степени выглядит как сюрприз. Одним из объяснений наблюдаемого отсутствие смены пола исходит из двух генеральных considerations/concerns эксперимента по условным генным делециям: времени и полноты эксцизии Cre. В случае Sf1Cre-индуцированной делеции catenin, эксцизия, как минимум, обширная, если не полная в CRE-позитивных клетках (Manuylov et al.,[2008]); время, однако, наиболее трудный вопрос для экспериментального разрешения. Временной промежуток на шкале благоприятной возможности достижения вершины половой детерминации - полного подавления противоположного пола - путем удаления скорее, чем добавления веса, д. быть очень узким. При делеции гена Sox9 (Chaboissier et al.,[2004]) экспрессия женских маркеров наблюдалась только в случае полного (а не условного таргетинга) XY Sox9 нокаутных гонад в органной культуре, которая увеличивала жизнеспособность выборок за пределы эмбриональной гибели на 11.5 dpc. Анализ XY гонад с CRE-вырезанным Sox9 также подтвердил, что мужская программа не заканчивается достаточно рано; даже когда экспрессия Sox9 была снижена до уровня в яичниках дикого типа, экспрессия Mis и Sox8 всё ещё была более высокой, чем в XX контроле (Chaboissier et al.,[2004]). Отсюда, если авт. (Chaboissier et al.,[2004]) базировались исключительно на своих вызванных условиями нокаутах, то они д. были придти к выводу, что делеция Sox9 у самцов не вызывает активации женской программы. Хотя тяжелое подавление специфичных дл самок генов, наблюдаемое у β-catenin нокаутов (Manuylov et al.,[2008]),трудно понять, происходит ли оно из-за более ранней эксцизии, как дополнительной причины смены пола. К сожалению, сходный эксперимент с удлинением органной культуры оказался невозможным для β-catenin: его нокаут приводил к дефекту в формировании передне-задней оси и мутанты не развивались после 5.5 dpc (Huelsken et al.,[2000]).
Задержка времени эксцизии β-catenin может легко объяснить отсутствие смены пола; однако функция β-catenin, которая отличается от её службы в качестве добвочного веса на чашу детерминации пола может быть др. вносящим вклад фактором. Поскольку Sox9's основная (или только) гонадная функция, по-видимому, ограничена транскрипционным контролем половой дифференцировки, то β-catenin может играть и др. роль (роли) в клетках развивающийся яичников. Драматическое увеличение гибели соматических клеток яичников (но е семенников) при делеции β-catenin (Manuylov et al.,[2008]) несомненно снижает количество клеток предшественников, которые во всем остальном могут быть пригодны для реверсии пола и экспрессии специфических для самцов маркеров.
Наконец, наше понимание взаимодействия между двумя противоположными путями всё ещё неполное и ограничено битвой полов в поединке между SOX9 и β-catenin (Fig. 3) и может быть поспешным. В последнее время исследования раннего развития гонад у генетически модифицированных мышей базируются в основном на гибридизации in situ (или иммунофлюоресценции) , чтобы продемонстрировать отсутствие или присутствие экспрессии специфических генов/белков. Также заключения в отношении смены пола (особенно в случаях эмбриональной летальности, которая мешает анализу взрослых фенотипов) часто базируются на проверке ограниченного количества генов для обеих программ; в конце концов. наше знание о специфичной для самок экспрессии генов в раннем развитии совершенно новые. Благодаря анализу последних публикаций видно использование quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reactions (qRT-PCRs) и более обширного списка маркеров для описания гонадных фенотипов; эта часть работы выявляет сложную смесь (скорее, чем взаимоисключающее доминирование) специфичной для самок и специфичной для самцов экспрессии в гонадах, когда женская программа нарушена. Пока почти что верно, что (ранняя) Sox9 экспрессия необходима для полного выполнения мужской программы и образования тяжей в семенниках, экспрессия некоторых специфичных для самцов генов происходит в гонадах в отсутствие Sox9, особенно, если нарушена противоположная женская программа. Определенно, специфичные для самцов гены активируются у Rspo1 XX мутантов в отсутствие обнаружимой ранней экспрессии Sox9 (Chassot et al.,[2008]; Tomizuka et al.,[2008]). Следовательно, ничего удивительного в том, что у β-catenin XX мутантов некоторые гены, обычно ассоциированные с развитием мужского пола, активируются (напр., Inha and Cyp11a1), тогда как Sox9 нет (Manuylov et al.,[2008]). Сходным образом специфичная для самок экспрессия сохраняется у β-catenin мутантов (напр., Sprr2d), указывая тем самым, что из-за тяжелых нарушений женская программа подавлена не полностью (Manuylov et al.,[2008]). Остается установить, могут ли эти отклонения от нормы в экспрессии генов отражать многообразие в популяции соматических клеток в ранних яичниках (Yao et al.,[2004]; Kocer et al.,[2008]).
Итак, β-catenin необходим для нормального развития яичников. Важно, что дифференцировке семенников в отсутствие β-catenin протекает внешне нормально (Manuylov et al.,[2008]); недавняя работа также подтвердила, что экспрессия клетками Сертоли β-catenin несущественна для нормального развития семенников (Chang et al.,[2008]).

FUTURE DIRECTIONS


These new exciting developments incontrovertibly point to a central role for the canonical β-catenin pathway in ovarian development; however, new questions understandably arise. Currently, our knowledge of this intricate pathway in its ovarian adaptation remains rudimentary and the relevant ligands (Wnts) and their receptors remain to be identified. Wnt4 has been connected to β-catenin function in the ovary (Mizusaki et al.,[2003]) and Wnt4 was proved capable to act in the canonical manner (e.g., Park et al.,[2007]); however, in the absence of Wnt4, β-catenin signaling is only partially ablated (Chassot et al.,[2008]). RSPO1 is certainly essential for active canonical β-catenin signaling in the ovary; nevertheless, recent data suggest that RSPO proteins require (rather than replace) Wnt ligands (Kim et al.,[2008]). On the receiving side, identifying a relevant Fz receptor will likely prove itself difficult (given a large number of these receptors and their redundancy); however, a better characterization of the ovarian phenotype in Lrp6 mouse mutants is undoubtedly on the way. LRP6 null mutation was originally recovered in a screen for recessive lethal phenotypes in mice caused by gene trap insertions in cell-surface proteins (Pinson et al.,[2000]); the embryos homozygous for the insertion in Lrp6 die at birth with a variety of severe developmental abnormalities including a truncation of the axial skeleton, limb defects, microphthalmia and, most pertinently, a malformation of the female urogenital system.
As described above, β-catenin is not a DNA binding protein and normally relies on the TCF/LEF transcription factors to activate gene expression; some of the prospective gene targets for this complex in the ovary have been uncovered (see above) and more, undoubtedly, are on the way. While best understood, TCF/LEF are not the only known DNA binding protein partners for β-catenin, and other transcription factors (e.g., PITX2 or PROP1; Kioussi et al.,[2002]; Olson et al.,[2006]; Amen et al.,[2008]) can tether it to DNA; although these pathway require β-catenin they are not, strictly speaking, canonical. Of interest, no gonadal abnormalities for TCF/LEF-deficient animals have been reported.
Another area of immediate interest is the input of the canonical β-catenin signaling pathway into the antagonism between the male and female developmental programs. Both Sox9 and Sry can interfere with β-catenin signaling, although the molecular mechanism of this inhibition remains to be understood (Bernard et al.,[2008]). Similarly, constitutively active ectopic β-catenin can down-regulate SOX9 protein expression in the XY gonad which makes it tempting to speculate that it may function in this same manner in the normal female environment to oppose male development (Maatouk et al.,[2008]). Ultimately, provided the regulation of the β-catenin pathway is conserved in human ovarian development, this new knowledge should aid in understanding and potentially treating diseases such as gonadal dysgenesis or premature ovarian failure.
Сайт создан в системе uCoz