Эмбрионы на поздней стадии бластоциста содержат три различающиеся клон-ограниченные субпопуляции (FIG. 1). TE обеспечивает имплантацию и затем расширяется, чтобы сформировать предшественников плаценты - а именно, extraembryonic ectoderm (ExE) и эктоплацентный конус. PE становится разнообразной и дает париетальную энтодерму, которая мигрирует от поверхности ICM и вступает в непосредственный контакт с материнской тканью, и visceral endoderm (VE), которая остается в контакте с эмбрионом и расширяется вдоль поверхности ExE и эпибласта, давая энтодерму висцерального желточного мешка. Наконец, ранний эпибласт сохраняет плюрипотентность и дает как соматические ткани так и зародышевую клеточную линию собственно эмбриона.
Начиная со ст. E5, nodal сигналы индуцируют формирование P-D паттерна в эпибласте. Nodal, который первоначально экспрессируется по всему эпибласту18, активирует свой внутриклеточный эффектор SMAD2 в лежащей поверх VE19. Фосфорилированные SMAD2 комплексы являются ключевым компонентом транскрипционной сети, которая необходима для образования distal VE (DVE), специализированного сигнального центра (FIG. 2). Nodal-SMAD2 сигналы индуцируют экспрессию транскрипционных факторов forkhead box A2 (FoXA2) и LIM homeobox protein 1 (LHX1), которые вместе с SMAD2 управляют продукцией внеклеточных антагонистов передачи сигналов Wnt и nodal20, включая Dickkopf homologue 1 (DKK1), cerberus-like protein 1 (CER1) и left-right determination factor 1 (LEFTY1). DVE ингибирует передачу сигналов nodal и Wnt в покрывающем её эпибласте, она ограничивает активацию генов мишеней наиболее проксимальной областью и она поддерживает передние характеристики клеток дистальной части эпибласта. Функциональная потеря SMAD2 ведет к неспособности индуцировать nodal антагонистов21, и как следствие неослабевающая передача сигналов nodal по всему эпибласту вызывает эктопическую активацию проксимальных генов, включая Wnt3, Brachyury (также известен как T белок) и Fgf8 (REFs 21,22).
Canonical Wnt-β-catenin передача сигналов также необходима для поддержания P-D оси. Потеря adenomatous polyposis coli (APC), негативного регулятора Wnt-β-catenin ведет к конституитивной активации пути и неспособности формировать DVE23. Напротив, DVE индуцируется у β-catenin мутантов, как это выявляется по экспрессии LHX1 и CER1. Однако др. DVE маркеры, такие как HEX, неспособны активироваться24. Пути nodal-SMAD2 и Wnt-β-catenin т.о., активируют дискретные гены мишени в DVE, которые генерируют P-D полярность эпибласта. в
Помимо своей роли в становлении DVE, передача сигналов nodal также регулирует взаимодействия с проксимальной частью ExE19 . Совместно с FGF4, который секретируется эпибластом, nodal поддерживает пул предшественников трофобласта25. В свою очередь, сигналы от ExE ткани, включая BMPs, необходимы для формирования паттерна проксимальной части эпибласта и соседней VE. Физическое удаление внеэмбриональной области у E5.5 эмбрионов приводит к экспансии DVE маркеров на всю VE и к потере экспрессии маркерных генов проксимальной части эпибласта26. Сходным образом, потеря ETS (erythroblast transformation specific) транскрипционных факторов ELF5 или ETS2 приводит к неспособности поддерживать ExE, а мутанты обнаруживают дефекты формирования паттерна эпибласта и VE27,28. Не идентифицированные ингибирующие сигналы от ExE предупреждают активацию DVE маркеров с проксимальной части VE, ограничивая тем самым индукцию DVE дистальным концом26,29 (FIG. 2). Взаимодействия VE с ExE также необходимы для локальной экспрессии GATA4, HNF4A и α-fetoprotein (AFP), которые обычно ограничены проксимальной частью VE29.
Перемещение DVE на переднюю сторону эмбриона устанавливает A-P градиент сигналов nodal и Wnt в эпибласте. Антагонисты, секретируемые с помощью AVE, блокируют передачу сигналов и передают нейроэктодермальные характеристики, тогда как сигналы на проспективную заднюю сторону эмбриона инструктируют клики по принятию мезодермальной и эктодермальной судеб.
Forming the embryonic germ layers
Приблизительно на ст. E6.0 эмбрионы характеризуются препаттерном региональных различий генной экспрессии. Молекулярный паттерн сопровождается большими изменениями в морфологии, т.к. три эмбриональных зародышевых слоя генерируются во время гаструляции. Эктодерма, мезодерма и definitive endoderm (DE) представлены клетками предшественниками, из которых развиваются все ткани плода. Каковы механизмы, которые приводят к гаструляции и как специфицируются зародышевые слои?
Initiation of primitive streak formation. Хотя молекулярные доказательства формирования A-P оси становятся очевидными примерно на ст. E6.0, мышиные эмбрионы остаются морфологически остаются радиально симметричными вплоть до начала гаструляции. Обширное клеточное перемешивание, как известно, происходит в эпибласте переде гаструляцией43. Напротив, клетки во внеэмбриональных тканях довольно статичны и формируют связанные клональные участки44. Примерно на ст.E6.0, клетки эпибласта начинают конвергировать в направлении заднего проксимального полюса эмбриона, чтобы сформировать первичную полоску45. Эксперименты c химерами установили, что nodal-дефицитные клетки преимущественно вносят вклад в передний компартмент эмбриона46. Сходным образом способность вносить вклад в задние ткани оказывается под угрозой в клетках, которые лишены nodal рецептора ALK4 (также известного как ACVR1B)47. У рыбок данио клетки, которые лишены обоих nodal гомологов cyclops и squint обнаруживают тенденцию к дисперсии скорее, чем к сцеплению48. Активности nodal, по-видимому, управляют поведением клеточной сортировки в проксимальной части эпибласта, которая направляет клетки в направлении места образования первичной полоски.
Возникающая мезодерма формируется, если клетки эпибласта, которые являются входом в первичную полоску, подвергаются epithelial-mesenchymal transition (EMT) и затем появляются, чтобы сформировать новый слой клеток между эпибластом и покрывающим его VE. BMP сигналы от ExE, также как и nodal-SMAD2 и SMAD3 и канонические Wnt сигналы в эпибласте необходимы для индукции мезодермы. Эмбрионы, лишенные BMP receptor BMPR1A49 , nodal50 или его внутриклеточных эффекторов SMAD2 и SMAD3 (REF. 51) неспособны формировать мезодерму и оказываются блокированными перед гаструляцией. WNT3 (REF. 52)
и β-catenin мутанты24, также как и мутанты, которые лишены обоих Wnt корецепторов LRP5 и LRP6 (REF. 53), сходным образом неспособны формировать мезодерму. Напротив, потеря axin 2, негативного регулятора пути Wnt54, или неправильная экспрессия куриного WNT8C55 ведет к индукции эктопической полоски. Потеря обоих nodal антагонистов CER1 and lEFTY1 сходным образом приводит к формированию множественных полосок или увеличенной области первичной полоски22. Высокие уровни сигналов nodal-SMAD2 и SMAD3, которые сфокусированы в проксимальной задней части эпибласта, ближайшей к ExE, инициируют образование первичной полоски. Описаны некоторые регуляторные механизмы, которые устанавливают этот сигнальный градиент (FIG. 2). Во-первых, нерасщепленный
nodal предшественник, который секретируется с помощью эпибласта, активирует экспрессию BMP4 и proprotein convertases SPC4 (также известной как PCSK6 и PACE4) и furin (также известного как PCSK3) в ExE56. Созревание nodal с помощью furin и SPC4 быстро усиливает локальную экспрессию nodal посредством SMAD-FOXH1 ауторегуляторного энхансера, который присутствует в первом интроне гена Nodal57,58 . Во-вторых, nodal-зависимая позитивная регуляция BMP4 в ExE непосредственно активирует WNT3 в клетках задней части эпибласта56 (FIG. 2b). Передача сигналов Wnt в свою очередь поддерживает высокие уровни экспрессии nodal избирательно в задних клетках посредством второго TCF/LEF (T-cell-specific factor/lymphoid enhancer-binding factor)-зависимого 5' Nodal энхансера18,56. В отсутствие WNT3, транскрипция Nodal индуцируется, но не поддерживается. WNT3-мутантные эмбрионы52 обнаруживают множество тяжелых нарушений по сравнению с эмбрионами, которые лишены 5' Nodal энхансера59, это подтверждает, что дополнительные WNT3 мишени необходимы, чтобы способствовать образованию мезодермы. В согласии с этой идеей то, что у Xenopus laevis WNT3a стабилизирует BMP-SMAD1 сигналы60, чтобы способствовать перекрестному общению между путями nodal, BMP и Wnt во время спецификации мезодермы.
Cell lineage allocation in the primitive streak. Приблизительно на ст. E6.25 первичная полоска первоначально индуцируется на проксимальном заднем полюсе эпибласта и в течение последующих 36 ч, она удлиняется и расширяется к дистальному концу эмбриона (FIG. 3). Разные мезодермальные клеточные клоны оказываются расположенными в соотв. время и в соотв. месте проникновения через полоску61. Самые ранние, наиболее задние субпопуляции, которые формируют паттерн в ответ на передачу сигналов BMP4 от ExE62, дают внеэмбриональные ткани, включая мезодермальный слой хориона и мезодерму висцерального желточного мешка и кровяные островки. Генетические исследования показывают, что BMP4 и его нижестоящий эффектор SMAD1 необходимы для формирования аллантоиса62,63. латеральной пластинки, параксиальной и кардиальной мезодермы , появляются чуть позже из промежуточного и переднего уровней полоски. Наконец, клетки эпибласта, которые мигрируют через передний кончик первичной полоски (названы APS предшественниками) дают ткань средней линии аксиальной мезодермы, которая представлена prechordal plate (PCP), хордой и узелком, а также линией клеток DE.
Начиная с E6.5, возникающие DE клетки движутся к наружной поверхности эмбриона путем интеркаляции в лежащую поверх VE. Недавнее исследование подвергло сомнению укоренившееся мнение, что клетки DE целиком смещают AVE и большую часть VE во внеэмбриональные области64. Однако real-time imaging исследования показали, что клетки VE оказываются диспергированными, но персистируют вплоть до поздних стадий в тканях кишечной трубки. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы прояснить имеет ли функциональное значение персистирование VE клеток в кишечной ткани и сколь долго они сохраняются. Производные APS, включая передние DE, мезэнтодерму средней линии и узел, все строго экспрессируют антагонистов путей nodal и Wnt , а также BMP антагонисты chordin и noggin, которые действуют совместно, чтобы поддерживать лежащую поверх нейроэктодерму (NE). Тонкая полоска клеток хорды, которая точно находится под вентральной срединной линией нервной пластинки также является важным источником сигналов sonic hedgehog, которые действуют как морфогены и управляют формированием дорсо-вентрального паттерна в развивающейся ЦНС65.
Морфоегез хорды анализировался наблюдением живых клеток66 . Передняя часть хорды формируется за счет агрегации диспергированных клеток вдоль срединной линии, в то время как notochordal пластинка из узла давала тело хорды. Клетки заднего края узелка являются предшественниками задней части хорды. Исследования с помощью real-time imaging маршрутов клеточных перемещений и поведений в комбинации с молекулярным картированием клонов необходимо для получения информации о том, как эти разные производные передней части полоски специфицируются с такой четкостью.
Пространственное разделение мезодермальных и энтодермальных предшественников вдоль анимально-вегетативной оси легко визуализуется у эмбрионов X. laevis. Однако у мышей передняя часть полоски, мезодермальные производные - а именно, головная мезенхима, кардиальная мезенхима и передняя параксиальная мезодерма - и появляющиеся предшественники DE находятся в тесной близи, т.к. они проникают через переднюю часть полоски. Механизмы. которые руководят расхождением этих разные клеточных клонов плохо изучены. Генетические исследования идентифицировали несколько транскрипционных факторов, которые действуют совместно, чтобы сформировать паттерн APS производные и обеспечить спецификацию DE у ранних эмбрионов мышей. Формирование DE нарушщается при потере SMAD2 (REFs 59,67) или SMAD4 (REF. 68), forkhead транскрипционных факторов FoXH1 (REFs 69,70) или FoXA2 (REF. 71) или T-box гена eomesodermin (EoMES) 72 . Эти факторы действуют как компоненты nodal пути (SMAD2 и SMAD4) или рассматриваются как первичные мишени передач сигналов SMAD2 и SMAD4 (FoXH1, FoXA2 и EoMES).
Градированные nodal сигналы, как было показано, управляют расположением клонов в APS.
Генетические манипуляции, которые снижают уровни nodal или SMAD2-SMAD3, приводет к прогрессивной потере производных APS. Наивысшие уровни активированных SMAD2-SMAD3-SMAD4 комплексов необходимы для спецификации DE и PCP, тогда как образование узелка нуждается в промежуточных уровнях59,68. Распределение параксиальной и латеральной пластинки мезодермы нуждается в более низких порогах сигналов nodal, которые не зависят от SMAD4 (REFs 51,68). Сходным образом, во время гаструляции у X. laevis, зависимые от дозы nodal-activin сигналы генерируют зависимые от концентрации домены экспрессии brachyury и goosecoid (Gsc), которые маркируют всю мезодерму или специфически мезоэнтодерму, соотв.73. Низкие уровни nodal-activin достаточны для индукции экспрессии brachyury посредством его сайтов связывания промотора с высоким сродством. Brachyury активирует Xvent2 (также известный как Xom, X. laevis гомеобоксный ген, которые обеспечивает ранние эффекты BMP4, которые опосредуют репрессию экспрессии Gsc . Однако повышенные уровни nodal-activin подавляют Xvent2 и одновременно активируют Gsc, который в свою очередь репрессирует brachyury. Эти регуляторные петли обратной связи ведут к возникновению доменов взаимоисключающей и пространственно ограниченной экспрессии nodal-activin зависимым от концентрации способом74.
Транскрипционные сети, которые управляют расположением клонов DE, широко законсервированы у позвоночных, но по тонким деталям возможны отличия. У X. laevis матерински экспрессируемый T-box ген vegt активирует nodal сигналы, которые необходимы для формирования мезодермы и энтодермы. Гомолог VegT отсутствует в геноме млекопитающих, но продукт др. T-box гена, EoMES, действует ниже nodal, чтобы регулировать образование энтодермы72. Дополнительные факторы, включая членов семейств SRy box (SoX), GATA и MIX/BIX-type гомеобоксных генов, как известно, играют критическую роль в формировании DE и широко законсервированы75. Коституитивная экспрессия SoX17 управляет дифференцировкой человеческих ES клеток преимущественно в DE76, тогда как мышиный SoX17 не нужен для ранней спецификации DE, а скорее функционирует позднее, способствуя выживанию энтодермы77. У X. laevis, Sox17 является непосредственной мишенью Smad2 и VegT транскрипционного комплекса78, но транскрипционная иерархия у мышей всё ещё остается плохо изученной.
In vitro протоколы дифференцировки в комбинации с линиями ES клеток с репортерными кассетами, которые были нокаутированы по специфическим локусам, и с потерей функции мутантные клеточные линии были использованы для изучения расхождения клонов и установления онтогенетического потенциала1. Системы клеточных культур д. облегчитть выделение промежуточных типов клеток, которые существуют лишь временно у эмбрионов, и могут предоставить удобный инструмент для изучения сигнальных путей, которые регулируют решения по клеточным судьбам. Высокие дозы activin воспроизводят передачу сигналов nodal и способствуют дифференцировке DE79,80. Неожиданно, Brachyury, который ранее рассматривался как bona fide мезодермальный маркер, был использован для идентификации DE предшественников в протоколах дифференцировки ES клеток79. Более того, SoX17, который был использован в качестве DE маркера, ассоциирует (клеточно неавтономным образом) с развитием клона кардиомиоцитов in vitro81. Это согласуется с тесным клональным взаимоотношением между кардиальной мезодермой и предшественниками DE у эмбрионов. передача сигналов Wnt может влиять на этот выбор клеточных судеб, т.к. определяемая условиями потеря β-catenin в мезодермальных клетках нарушает распределение клонов в DE и вместо этого способствует развитию кардиальной езодермы82.
EMT and cell migration at the primitive streak. EMT, которая позволяет возникающей мезодерме отсоединяться и мигрировать прочь от первичной полоски, осуществляется за счет потери эпителиальных слипчивых соединений, потери ассоциации с базальной мембраной и перестройки архитектуры цитоскелета (reviewed in REF. 83). Подавление экспрессии E-cadherin необходимо для разрушения слипчивых соединений. Как транскрипты, так и белок E-cadherin быстро теряются, как только клетки вступают в первичную полоску (FIG. 4). Транскрипция подавляется с помощью FGF сигналов посредством FGFR1, это индуцирует экспрессию транскрипционного zinc-finger репрессора snail, который соединяется непосредственно с E-box последовательностями в E-cadherin промоторе84,85.
Мутации потери функции FGF8, FGFR1 и snail нарушают EMT в разной степени. FGF8-дефицитные клетки эпибласта проникают в первичную полоску, но неспособны к миграции, это блокирует образование клонов клеток мезодермы и DE86. Потеря FGFR1 также нарушает гаструляцию, приводя к экспансии первичной полоски87,88. Snail-мутантные эмбрионы формируют появляющуюся мезодерму, но эти клетки сохраняют эпителиальную морфологию и неспособны эффективно негативно регулировать экспрессию E-cadherin89.
Передача сигналов MAPK также играет важную роль в регуляции EMT во время гаструляции. Эмбрионы, которые лишены p38-interacting protein (p38IP; также известного как FAM48A), который, как полагают, контролирует активность p38 MAPK, также характеризуются нарушенной деградацией белка E-cadherin90. p38IP действует на пост-трансляционном уровне, при этом FGF-зависимая активации snail остается интактной90 . Возникающий в результате фенотип менее тяжелый и мезодерма формируется с пониженной эффективностью, обусловливая задержку элонгации оси и дефектный морфогенез. MAPK kinase kinase
kinase 4 (MAP4K4) действует выше p38 (REF. 91), а функциональная потеря сходным образом вызывает бедность производных мезодермы.
EoMES является критическим для EMT и миграции мезодермальных клеток72,92. Генетические доказательства указывают на то, что это мишень для nodal72. У эмбрионов, лишенных EoMES, клетки эпибласта индуцируются корректно (как показывает экспрессия появляющихся мезодермальных маркеров, включая brachyury и WnT3) , но накапливаются на задней стороне эпибласта и образуют утолщенную первичную полоску, неспособную к расслоению. E-cadherin транскрипты и белок подавляются неэффективно, но экспрессия FGF8 и его мишеней snail и TBX6 остается незатронутой72. остается неясным функционирует ли EoMES независимо или действует вместе с snail, чтобы репрессировать экспрессию E-cadherin. Basic helix-loop-helix транскрипционные факторы mesoderm posterior 1 (MESP1) и MESP2 ммогут выполнять дополнительные роли по контролю EMT в полоске93,94, но их способность регулировать экспрессию E-cadherinне была изучена.
MESP1 также регулирует спецификацию кардиальных предшественников, которые обнаруживают интересную связь между спецификацией клеточных судеб и регуляцией морфогенеза, связанны с одним и тем же транскрипционным фактором95,96.
Как мезодермальный, так и DE клеточные клоны запрограммированы к исполнению сбожного набора миграторных поведений. Сигналы наведения изучались активно у эмбрионов рыбок данио и лягушек. Взаимодействия, которые мезодерма, экспрессирующая stromal-derived factor 1 (SDF1), и энтодерма. экспрессирующая соотв. цитокиновый рецептор C-X-C-chemokine receptor 4 (CXCR4), необходимы для миграции энтодермы у рыб
97,98. Но потеря SDF1 или CXCR4 не оказывает заметного воздействия на развитие мышей. Сходным образом, нарушение Wnt-обеспечиваемого неканонического пути планарной клеточной полярности у рыбок данио и лягушек вмешивается в движения конвергенции и расширения, которые необходимы для удлинения эмбриона
99. Путь планарной клеточной полярности у эмбрионов кур регулирует ранние перемещения клеток примитивной энтодермы перед прохождением через полоску
100. Напротив гены планарной клеточной полярности мышей, как было установлено, не являются критическими для тканевого морфогенеза во время гаструляции
101. Сигналы TGFβ непосредственно регулируют свойства клеточной адгезии и управляют сборкой плотных соединений посредством фосфорилирования partitioning-defective 6 (PAR6) и occludin
102,103 и управляют EMT в многочисленных онтогенетических контекстах, таких как вычленение нервного гребня с помощью BMP сигналов и образования кардиальных клапанов с помощью TGFβ
83. Передача сигналов TGFβ также контролирует ранний разрыв базальной мембраны в опухолевых клетках
83. Трансмембранный белок fibronectin leu-rich repeat Flrt3 и малая GTPase Rnd1 были недавно идентифицированы в качестве мишеней для nodal у X. laevis. Ко-экспрессия Flrt3 и Rnd1 в уменьшающихся до нормальных размеров клетках маргинальной зоны способствует локальному подавлению E-cadherin. которое вызывает клеточную интернализацию и миграцию вдоль внутренней поверхности полости бластоцеля
104. У мышей FlRT3 преимущественно локализуется в VE и DE
105. FlRT3 не является существенным для EMT во время гаструляции, но необходим для DE миграции и закрытия вентральной срединной линии
105.
NE - the default state of epiblast differentiation?
Клетки эпибласта, которые неспособны мигрировать через первичную полоску, дают NE и в конечном итоге центральную нервную систему61. Многочисленные доказательства показывают, что NE представляет собой исходное (default) состояние дифференцировки эпибласта. Потеря или BMPR1A рецептора106 или nodal107 приводит к преждевременной нейрональной дифференцировке и к преждевременной потере плюрипотентности в эпибласте. Комбинированная активность антагонистов CER1 и lEFTY1 необходима для поддержания NE предшественников на передней стороне эпибласта. Потеря или CER1 или lEFTY1 не способна нарушить спецификацию NE, но у двойных мутантных эмбрионов обнаруживается экспансия мезодермы за счет NE22. Устойчивая экспрессия антагонистов в передней части DE ткани и в мезэнтодерме срединной линии во время гаструляции сохраняет лежащую поверх нейроэктодерму. Эмбрионы, лишенные APS предшественников дают характерное укорочение передней части ЦНС51,59. Сходные фенотипы наблюдаются у мутантных эмбрионов, которые специфически лишены Wnt ингибитора DKK1 (REFs 108,109), или обоих известных BMP ингибиторов chordin и noggin110. Недавние эксперименты подтвердили, что дополнительные сигналы ретиноевой кислоты, активируемые с помощью SMAD-FoXH1 комплексов в передней части DE столь же необходимы для поддержания и формирования паттерна передней NE111.
Arkadia, RInG-доменовая E3 ubiquitin лигаза существенна для преобразования максимума nodal сигналов, это необходимо для спецификации APS предшественников у мышей112 и спецификации мезэнтодермы у лягушек113. Arkadia убиквитилирует фосфорилированные SMAD2-SMAD3 комплексы и служит для купирования активации транскрипции с последующей SMAD2-SMAD3 деградацией посредством proteasome114. Сходным образом, BMP рецепторные SMADs 1, 5 и 8 также негативно регулируются с помощью убиквитилирования115, а у X. laevis Smad4 ubiquitin лигаза ectodermin регулирует переключение клеточных судеб между эктодермой и мезодермой116.
Сеграгация клона зародышевых клеток у низших организмов, сегрегация клонов соматических клеток в противовес клонам зародышевых клеток контролируется с помощью расщепления материнских детерминант, которые глобально репрессируют транскрипцию117. Напротив, у эмбрионов млекопитающих ранние клетки эпибласта являются все компетентными к принятию судьбы или соматических или зародышевых клеток (PGCs), они специфицируются в ответ на внешние сигналы, совпадающие с формированием паттерна оси на стадии гаструляции118 . Проспективные зародышевые клетки селектируются из соматических соседей с помощью зависимых от дозы сигналов BMP, которые исходят из EXE119. Потеря BMP4 предупреждает образование PGCs119. Сходным образом потеря экспрессии BMP8B и BMP2 в клонах EXE и VE, соотв. также количественно влияет на формирование PGC118. BMP лиганды, которые передают сигналы посредством рецепторов клеточной поверхности в клетках проксимальных частей эпибласта, активируют SMAD1 и SMAD5 эффекторы. И SMAD1 и SMAD5 гомозиготные нулевые эмбрионы неспособны формировать зародышевые клетки63,120 . Спецификация PGC также поставлена под угрозу у SMAD1 и SMAD5 двойных гетерозигот121, это указывает на то, что эти регуляторы транскрипции действуют кооперативно. Условная инактивация co-Smad, SMAD4 в эпибласте блокирует спецификацию PGC, но не способна нарушить образование или формирование паттерна ранней мезодермы68, это указывает на то, что существует избирательная потребность в SMAD4 при передаче сигналов BMP. Итак, эти исследования показывают, что зависимые от дозы сигналы BMP-SMAD заставляют немногие клетки эпибласта принимать судьбу зародышевых клеток (FIG. 5).
PGCs специфически экспрессируют высокие уровни активности эндогенной alkaline phosphatase. Эта субпопуляция клеток впервые становится различимой на ст. E7.5 в виде дискретного кластера из 30-40 клеток в основании зарождающегося аллантоиса. локальная индукция и позиционирование PGCs зависит от реципрокных сигнальных стимулов, которые появляются между эпибластом и внеэмбриональными тканями. Эти сигналы действуют также для установления инициальной A-P полярности. Высокие уровни BMP сигналов в проспективной задней стороне эмбриона возникают в результате экспрессии антагонистов с помощью AVE (CER1 и lEFTY1) в комбинации с усилением экспрессии BMP4, которая локализуется в задней части EXE за счет nodal-WnT3-BMP4 feed-forward петли (FIG. 2; see above). Эти градиенты передачи A-P сигналов действуют кооперативно, а максимальные уровни фосфорилированных SMAD комплексов избирательно активируют гены мишени, специфичные для зародышевых клеток в задней проксимальной части эпибласта. PGCs были индуцированы в ткани эпибласта, которые ко-культивировали EXE и проксимальными частями ткани VE. Сходным образом удаление VE ингибирует образование PGC122,123. У SMAD2-дефицитных эмбрионов, лишенных A-P полярности, PGCs образуются в случайных участках из-за униформности высоких уровней передачи сигналов BMP от лежащей поверх EXE67.
По ходу гаструляции PGCs оказываются локализованными в энтодерме задней кишки, это облегчает возвращение клеток к месту назначения, в генитальный гребень. Семейство interferon-induced transmembrane proteins (IFITMs) участвует как в формировании кластера PGC, так и в локализации их в энтодерме кишки124. IFITM3 (известный также как fragilis) активируется в задней части эпибласта перед гаструляцией во время спецификации PGC и со временем оказывается ограниченным PGCs. IFITM1, который первоначально ко-экспрессируется с IFITM3 в PGCs, становится локализованным в задней мезодерме. Эксперименты с избыточной экспрессией и с siRnA-нокдауном показали, что IFITM1, , по-видимому, отталкивает зародышевые клетки от мезодермы, тогда как IFITM3 спаособствует их вступлению в заднюю кишку124. Однако IFITM белки необязательны для развития зародышевых клеток, т.к. животные, несущие делецию кластера Ifitm генов полностью фертильны125 . Др. механизмы преимущественно обеспечивают локализацию PGC в отсутствие экспрессии Ifitm. Сходным образом, stella (также известный как DPPA3) избирательно экспрессируется в зародышевых клетках126, но не существенен для развития зародышевых клеток. Вместо этого stella является матерински необходимым для развития ооцитов127.
BLIMP1 и PRDM14 необходимы для программирования PGCs. Важным признаком PGC клона является его способность подвергаться упорядоченному и значительному эпигенетическому репрограммированию 118,128. Когда пул предшественников расширяется и мигрирует, то PGCs обнаруживают потерю метилирования ДНК и модификации H3K9me2 гистона и постепенно приобретают высокие уровни H3K27me3 гистоновой метки, которые указывают на плюрипотентное состояние. Экспрессия соматических генов, таких как Hoxa1 и Hoxb1, репрессируется, тогда как транскрипционные факторы плюрипотентности, включая oCT3/4, nanog и SoX2, реактивируются.
Эксперименты по транскрипционному профилированию одиночных клеток предоставили информацию о программе ранних зародышевых клеток126,129,130. Два члена семейства PRDM zinc finger репрессоров транскрипции BlIMP1 (также известного как PRDM1) и PRDM14 необходимы для спецификации PGC131-133. Начало их экспрессии в эпибласте нуждается в передаче сигналов BMP-SMAD и строго локализовано в возникающих PGCs131,133. Эксперименты по картированию судеб показали, что BlIMP1-позитивыне клетки клон-ограничены, чтобы стать PGCs131. Потеря гена Blimp1 или Prdm14 остро нарушает инициальную спецификацию PGC и те немногие PGCs, которые образуются, быстро теряются. PRDM14 исключительно необходим для спецификации зародышевых клеток, т.к. Prdm14-нулевые мыши обоих полов жизнеспособны, но стерильны. Напротив,, Blimp1 был клонирован как мастер регулятор развития B клеток и выполняет множественные специфичные для каждого типа клеток роли в эмбрионе и у взрослых. Blimp1-нулевые эмбрионы погибают в середине беременности из-за недостаточности плаценты132. Стратегия условной инактивации выявляет важность функций BlIMP1 для формирования паттерна зачатков передних конечностей, глотки, сердца и сенсорных вибрис развивающегося эмбриона134 и для жировых желез135 и для кожи136 взрослых.
Контролируются ли те же самые транскрипционные мишени обоими этим ключевыми регуляторами? BlIMP1 необходим для подавления экспрессии Hox генов
131, тогда как потеря PRDM14 ведет как к неспособности реактивировать гены плюрипотентности, так и к дефектам эпигенетического репрограммирования по всему геному, это ассоциирует с повышенной экспрессией GlP1 (также известного как euchromatic histone methyltransferase 1 (EHMT1)) и со сдвигом соотношения H3K9me2 и H3K27me3 (REF. 133). дНК связывающая специфичность BlIMP1 активно изучалась
137. В В клетках BlIMP1 непосредственно блокирует транскрипцию на промоторах генов мишеней, таких как Myc, который необходим для хода клеточного цикла, и глобально перенаправляет паттерны экспрессии за счет silencing транскрипционных факторов, таких как paired box 5 (PAX5), class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) и interferon regulatory factor 4 (IRF4), все они необходимы для поддержания качественных характеристик В клеток
138. В PGCs, BlIMP1 формирует комплексы с Arg methyltransferase PRMT5, чтобы избирательно регулировать эпигенетическое репрограммирование
139. Напротив, партнерство PRDM14 и специфичность сайтов связывания не описаны. Важно для будущего описать общие и расходящиеся роли этих близко родственных транскрипционных факторов в расположении зародышевых клеток и замалчивания прирожденной соматической программы.
Conclusions and future perspectives
Studies of vertebrate development have uncovered complex tissue interactions that coordinate early embryonic patterning and cell fate allocation. In mice, the extraembryonic tissues are instrumental in setting up the basic body plan and for the initiation of developmental hallmarks, such as axis determination and primitive streak formation. Gene targeting in mice has provided an invaluable strategy to identify and study the main signalling molecules, their pathways and the transcriptional regulators that mediate tissue crosstalk.
However, it is poorly understood how the plethora of signals in the developing embryo is conclusively interpreted on the subcellular level. The molecular analysis of embryonic signalling is often grossly limited by size and heterogeneity of embryonic tissues that do not allow for biochemical analysis. Considerable progress has been made over the past few years in the generation of cell lines
that represent embryonic progenitor cells140–143, and in the development of specific ES-cell differentiation protocols that to some degree mimic embryonic cell differentiation1. The availability of genetically modified ES cells that carry targeted deletions, reporter cassettes or transgenic overexpression constructs will grant useful tools to analyse the regulatory networks that guide development. It will also be particularly interesting to see the degree to which epigenetic control mechanisms, such as histone modifications, DnA methylation and non-coding RnAs, contribute to developmental gene regulation.
The process of embryonic morphogenesis includes rapid changes in cell behaviour through changes in cell shapes, migration, proliferation and apoptosis. Classic studies were mostly unable to reflect these dynamics. Recent advances in imaging techniques now offer possibilities to visualize development on a single-cell resolution in living embryos. Using gene-specific promoters that drive the expression of fluorescent markers, or recombinases to permanently label cell progeny, precise correlations of marker gene expression and cell fate can be made. Therefore, these techniques will be instrumental in defining the characteristics of progenitor cells during development — for example, the various progenitor cells in the primitive streak region. Defining the signals and intracellular mediators that are responsible for the propagation and differentiation of progenitor cell populations will be of key importance in the efforts to promote directed differentiation of cells for scientific or therapeutic purposes.
Сайт создан в системе
uCoz
