Посещений:
МОРФОГЕНЕЗ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ

Процессы и Гены

What drives cell morphogenesis: A look inside the vertebrate photoreceptor
Breandan Kennedy, Jarema Malicki
Developmental Dynamics . Volume 238, Issue 9, pages 2115–2138, September 2009

Vision mediating photoreceptor cells are specialized light-sensitive neurons in the outer layer of the vertebrate retina. The human retina contains approximately 130 million of such photoreceptors, which enable images of the external environment to be captured at high resolution and high sensitivity. Rod and cone photoreceptor subtypes are further specialized for sensing light in low and high illumination, respectively. To enable visual function, these photoreceptors have developed elaborate morphological domains for the detection of light (outer segments), for changing cell shape (inner segments), and for communication with neighboring retinal neurons (synaptic terminals). Furthermore, rod and cone subtypes feature unique morphological variations of these specialized characteristics. Here, we review the major aspects of vertebrate photoreceptor morphology and key genetic mechanisms that drive their formation. These mechanisms are necessary for cell differentiation as well as function. Their defects lead to cell death. Developmental Dynamics 238:2115–2138, 2009. © 2009 Wiley-Liss, Inc.
Сенсорные нейроны часто интегрируются в эпителиальные структуры. В то время как некоторые из них присутствуют на поверхности тела, др. внедрены в эпителий, который выстилает внутренние полости. Напр., слуховые волосковые клетки позвоночных. Хотя локализация в просвете фоторецепторов позвоночных менее очевидна, эти клетки также дифференцируются из стенки эпителия эмбрионального зрительного пузырька. Др. широко распространенным свойством сенсорных клеток является то, что они воспринимают сигналы посредством апикального домена клеточной поверхности. Для облегчения этой функции клетки часто дифференцируют сложные апикальные особенности. Определенные сенсорные нейроны нематод, напр., образуют апикальные выпячивания, которые напоминают ветви деревьев, гребешки или лопаточки (Ward et al.,1975; Perkins et al.,1986). Эти структуры поддерживаются с помощью микротубулярного цитоскелета. В противоположность этому слуховые волосковые клетки позвоночных, также как и фоторецепторы дрозофилы образуют пучки пальцеобразных выпячиваний, поддерживаемых актиновыми филаментами (Hudspeth,1989; Knust,2007).

MORPHOLOGICAL FEATURES OF THE PHOTORECEPTOR CELL


Фоторецепторы позвоночных тесно расположены параллельно др. др. в клеточном слое, который занимает наружную часть сетчатки. Изолированный фоторецептор имеет удлиненную форму и характеристики нескольких морфологически отличающихся регионов. От апикального к базальному концу имеются: наружный сегмент, внутренний сегмент, ядерный регион и синапс (Fig. 1).

Figure 1. Overview of photoreceptor morphology. Left-hand panel shows a photograph of an isolated rod photoreceptor from the rabbit retina. A schematized view of the same cell is shown to the right. Position of the OLM relative to the nucleus varies for different photoreceptor types. Image to the left reprinted with permission (Townes-Anderson et al.,1988). OS, outer segment; CC, connecting cilium; OLM, outer limiting membrane.



The Outer Segment


Уникальной характеристикой морфологии фоторецепторов позвоночных является фоточувствительный наружный сегмент. Против ожидания наружные сегменты палочек и колбочек, локализованные на концах фоторецепторов, дальше всего расположены от света, проходящего через зрачок, размещаются рядом с retinal pigment epithelium (RPE). Наружные сегменты обогащены фототрансдукционными белками, включая чувствительные к свету G-protein coupled receptors (GPCR), состоящие из трансмембранного opsin белка и chromophore 11-cis-retinal (метаболита витамина A). Компартментализация аппарата фототрансдукции в наружном сегменте обеспечивает эффективность в максимализации зрительной чувствительности и обеспечивает локальный контроль над фототрансдукцией. Напр., чувствительность зрения регулируется избирательно перемещающимися компонентами фототрансдукционного каскада: transducin, recoverin, и arrestin между наружным и внутренним сегментами или внутренними сегментами и синаптическими областями (Calvert et al.,2006).
Наружный сегмент формируется как выпячивание апикальной поверхности, которое дифференцируется в обширные построения из фоточувствительных мембран (дисков в палочках и ламелл в колбочках; Steinberg et al.,1980; Arikawa et al.,1992). Его структура поддерживается с помощью набора микротрубочек, которые простираются от базальных тел, расположенных в наиболее апикальной области внутреннего сегмента (Fig. 2D,E). В основании наружного сегмента узкое сужение, окружающее цилиарную аксонему, определяет границу между внутренним и наружным сегментами и обозначается как соединяющая cilium. Это очень активный транспортный маршрут из липидов и белков к новой мембране наружного сегмента. Непрерывный транспорт материала в наружный сегмент необходим для поддержания обновления opsin-нагруженных дисков/ламелл, процесса важного для функции сетчатки, поскольку источающие свет диски/ламеллы постоянно фагоцитируются с помощью RPE с апикальной стороны (Young,1967,1971). Диски/ламеллы структурно подразделяются на дисковые поверхности и дисковые ободки. Поверхности дисков являются крупными плоскими параллельными слоями из дисковых мембран, тогда как дисковые ободки являются искривленными мембранами, которые формируют края дисков.



Figure 2. Photoreceptor outer segments. A: Generalized schematic of photoreceptor morphology; outer segment membranes are colored in blue. B: Scanning electron micrograph (EM) of frog photoreceptors showing intact rods and cones, and rod inner (R) and cones (C), and rod inner segments (RIS) left behind from broken photoreceptors. Reprinted with permission (Peters et al.,1983). C: Transmission EM of a developing Xenopus cone outer segment highlighting distal invaginations occurring between adjacent membranes (white arrows). Reprinted with permission (Eckmiller,1987). D: Schematic of a rod outer segment, showing stacks of disk membranes indented by multiple incisures, and a microtubule scaffold highlighted in red. The connecting cilium axoneme contains an array of microtubule doublets that extend from the inner segment into the outer segment, wherein a separate set of longitudinal microtubules run in the indentations of incisures. These microtubules are located in the cytoplasm between the curved rim of OS disks and the external plasma membrane. Reprinted with permission (Eckmiller,2004). E: Schematic of a cone outer segment showing layers of membranes that are continuous with the rest of the plasma membrane on the ciliary face. Microtubules are highlighted in red. Reprinted with permission (Eckmiller,2004). F: Electron micrograph of a section through the outer segment from a rabbit rod photoreceptor shows membrane folds and closely apposed disks. Reprinted with permission (Townes-Anderson et al.,1988). G: A model of protein-protein interactions thought to maintain the architecture of outer segment membranes. This model also shows membrane disks being added by means of evagination at the base of the outer segment-an alternative to the scenario shown in panel (I). Peripherin/Rds (P/rds) tetramers localize to disk rims. cGMP-gated cation channel (cGGCC), which includes a GARP domain, localizes to the plasma membrane and is thought to interact with peripherin. A cytoplasmic protein (GARP2) has been proposed to bridge adjacent disks by interacting with Peripherin/Rds. Reprinted with permission (Goldberg,2006). H: A detail of disk rim formation according to the open disk "evagination" model. Rim expansion encloses space between adjacent membrane evaginations. Reprinted with permission (Steinberg et al.,1980). I: A "vesicle fusion" model of rod disk formation. Rod opsin carrying vesicles pinch off at the base of the outer segment, and fuse with rod disks. Reprinted with permission (Chuang et al.,2007).

Несмотря на значительное сходство наружные сегменты палочек и колбочек отличаются по форме, структуре и процессу обновления. В самом деле, основа терминологии палочковидных и колбочковидных фоторецепторов возникает благодаря принимаемой палочковидной или колбочковидной форме стеков наружного сегмента, соотв. (Fig. 2D,E). В наружных сегментах палочек некоторых высших позвоночных появляются множественные впадины (indentations) дисковой мембраны и плазматической мембраны вдоль длины наружного сегмента. Эти специализированные впадины известны как вырезки и маркируют места цитоскелетной системы, содержащие продольные микротрубочки, сцепленные с помощью филамент с соседними мембранами (Eckmiller,2000,2004; Fig. 2D). Эти вырезки развиваются из infolds дискового ободка и поверхности и начинают формироваться до завершения ободка (see below). В палочках дисковые мембраны отделены от плазматической мембраны и укладываются в штабели внутри (Fig. 2B,D,F,G), nulf как в колбочках слоя ламелл являются продолжением клеточной мембраны и подвергаются действию внеклеточной среды (Fig. 2C,E).
Механизм, с помощью которого новые диски/ламеллы добавляются к наружным сегментам, недостаточно ясен и, по крайней мере, две модели предложены для объяснения. Согласно evagination модели морфогенез новых дисковых поверхностей и ободков связан с разными ступенями и регионами мембраны (Steinberg et al.,1980). Базальные выпячивания с внутренней стороны цилиарной плазматической мембраны продуцируют зарождающиеся дисковые мембраны, которые экспозируются во внеклеточное пространство, т.наз. открытые диски (Fig. 2G). Затем развиваются дисковые ободки между нижней (базальной) мембраной на имеющемся выпячивании и верхней (апикальной) мембраной соседнего зарождающегося мембранного выпячивания (Fig. 2G). Ободки растут по окружности соседних дисков, так что апикальная и базальная поверхности одиночного выпячивания становятся поверхностями соседних дисков. В противоположность этому, сторонники модели слияния ставят условие, что диски палочек формируются посредством регулируемого слияния опсином-нагруженных мембранозных пузырьков (Obata and Usukura,1992; Chuang et al.,2007; Fig. 2I). В этом сценарии пузырьки концентрируются у основания наружного сегмента, собираются в мембранозные диски. Пузырьки могут возникать посредством эндоцитоза базальной мембраны наружного сегмента и/или поставляются из внутреннего сегмента (Chuang et al.,2007; Fig. 2I). Т.о., слияние пузырьков обеспечивает включение opsin в диски и формирование дисков. Одним из ключевых различий между моделями является отсутствие открытых дисков на базальном конце наружных сегментов палочек в модели слияния. Было предположено, что доказательства обеих моделей могут быть связаны в техническими артефактами (Chuang et al.,2007; Kleinman and Ambati,2008; Yang et al.,2008). Интуитивно, технические артефакты, которые разрушают мембраны наружного сегмента палочек дают "открытые диски", , по-видимому, скорее всего. Однако зарождающиеся мембраны наружного сегмента, которые растут как внеклеточные выпячивания не просто артефакты, поскольку большинство колбочек позвоночных обладают характерной особенностью пространных мембранных ламелл, открытых на nonciliary сторону. В настоящее время неясно, только одна из этих моделей или обе корректно описывают механизмы, которые действуют параллельно в базальной области фоторецепторных клеток.
Какова основа для различий в форме наружных сегментов и структуре у палочек и колбочек? Являются ли они функционально важными? Различия в степени формирования ободков в основном и способность продуцировать базальные мембранные инвагинации, как полагают, объясняют различия в форме и структуре наружных сегментов палочек и колбочек (Eckmiller,1987). В наружных сегментах палочек формирования дисковых ободков инициируется на ciliary стороне и расширяется полностью по окружности соседних мембран, так что они становятся обкусанными как внутренние диски, отделенные от плазматической мембраны (Fig 2F-H). В наружных сегментах колбочек развитие ободков обычно неполное, так что мембранные ламеллы конусов не "не выщипываются", чтобы отделить их от плазматической мембраны и как результат конусные мембраны составляют одно целое с клеточной мембраной и экспозируются во внеклеточную среду (Eckmiller,1987).
Как упоминалось выше, морфогенез наружных сегментов являются динамическим процессом, при этом диски /ламеллы отпадают апикально, а новые добавляются с базальной стороны. Способность наружных сегментов палочек сохранять свою цилиндрическую форму в этом контексте, как полагают, связана с образованием полного ободка (rim), так что вновь сформированные диски расширяются на всю ширину наружного сегмента и становятся изолированными стеками, которые продвигаются апикально, чтобы заместить разрушившиеся диски. Наружные сегменты колбочек также добавляют мембранные складки с базальной стороны, но ширина мембран на кончике конуса значительно меньше, чем в основании. Генерация и сохранение формы конуса, как полагают, обеспечивается за счет уникальных инвагинаций (arrows in Fig. 2C) вдоль наружного сегмента, это ремоделирует мембранные ламеллы, уменьшая их ширину и образуя конусообразное сужение (Eckmiller,1987).
Окружением внутренних и наружных сегментов фоторецепторов является внеклеточный матрикс, обозначаемый как interphotoreceptor matrix сетчатки (IPM; Mieziewska,1996). IPM млекопитающих подразделен на компартменты, специфические для палочек и колбочек, которые могут быть отличены по присутствию peanut agglutinin-связывающих гликоконъюгатов в колбочках и по wheat germ agglutinin (WGA)-связывающим гликоконъюгатам в палочках (Sameshima et al.,1987). Матричные покрытия колбочек являются уникальными доменами IPM, в основном состоящими из chondroitin 6-sulfate proteoglycan. Они, как полагают, обеспечивают прикрепление сетчатки к RPE (Johnson and Hageman,1991).

The Inner Segment


Внутренний сегмент это домен фоторецептора от соединяющего cilium (разделяющего наружный и внутренний сегменты) до наружной ограничивающей мембраны (Fig. 1, OLM). Он содержит myoid область с выступающим аппаратом Гольджи (также богатой контрактильными мышечными трубочками у некоторых низших позвоночных; Troutt and Burnside,1988) и элипсоидной области, богатой митохондриями, которые помогают восполнять метаболические потребности фоторецепторов (Fig. 3F). OLM сама по себе является важным структурным образованием, которое делит фоторецепторы на апикальный и базальный домены. Хотя т.наз. "мембрана" в действительности состоит из соединительных комплексов между фоторецепторами и соседней Muller глией (Williams et al.,1990). Помимо участия в структурной поддержке, OLM, как полагают, действует как полупроницаемый барьер, предупреждающий диффузию компонентов внеклеточного матрикса, окружающего наружный и внутренний сегменты, а также как барьер для диффузии белков в липидном бислое самой клеточной мембраны фоторецептора (Williams et al.,1990).



Figure 3. Transport into the outer segment. Proteins are synthesized in the cytoplasmic reticulum and from there transported by means of the Golgi apparatus to the periciliary area at the base of the connecting cilium, and subsequently along ciliary microtubules into the outer segment. A: A schematic representation of the photoreceptor cell. Ciliary microtubules are highlighted in blue. The Golgi complex and post-Golgi vesicles are in red. B: Intraflagellar transport (IFT) is thought to translocate proteins into the outer segment along ciliary microtubules. It is mediated by means of so-called IFT particles, protein complexes that consist of several polypeptides. It is not clear whether IFT is involved in the transport of opsins. In addition to IFT particle components, several other IFT-related proteins, such as BBS gene products, are necessary for photoreceptor survival. Nephrocystins (NPHP) are also required for photoreceptor viability. Their relationship to IFT is not clear. C: Rod opsin is transported from the Golgi apparatus to the base of the photoreceptor connecting cilium in vesicles. In one proposed scenario, this transport is driven by dynein, a microtubule-dependant motor. The budding of RTCs (Rhodopsin Transport Carriers) from the trans Golgi network and subsequently their fusion at the base of the connecting cilium appear to require small GTPases Arf4, Rab8, and Rab11, a GTPase effector FIP3, and a GAP factor, ASAP1. Several other proteins are also proposed to participate in these processes (listed in the figure). The representation of RTC budding provided courtesy of D. Deretic. D: Immunolocalization of IFT88 (green) to the base of the connecting cilium in photoreceptors of larval zebrafish (Malicki lab). E: Longitudinal section of a frog rod cut along the axis of the connecting cilium reveals structural details in the periciliary ridge complex. Apical plasmalemma of the inner segment (APM), basal bodies (BB), centriole (C), connecting cilium (CC), disks (D) in the outer segment, lip (L), mitochondria (M), ridge (R), carrier vesicles (V), Reprinted with permission (Peters et al.,1983). F: Ultrastructure of a salamander rod photoreceptor. The outer segment contains stacks of membranous disks. The inner segment consists of a mitochondria-rich ellipsoid and a myoid region containing a Golgi apparatus. The inset in the bottom right corner (magnified at location of asterisk in main panel) shows photoreceptor fins, that interdigitate with microvilli of Muller cells above the external limiting membrane. Reprinted with permission (Townes-Anderson et al.,1985). Inset in top left corner shows scanning electron micrograph of the periciliary ridge complex. Reprinted with permission (Peters et al.,1983). Some aspect of the models presented in this figure should be considered hypothetical.

У низших позвоночных морфология внутреннего сегмента фоторецептора подвергается существенному ремоделированию в длину в ответ на изменения в общей освещенности и циркадные ритмы. В темноте миоидные регионы колбочек и палочек удлиняются и сжимаются, соотв. В результате наружные сегменты палочек оказываются ближе к наружной ограничивющей мембране, а наружные сегменты колбочек ближе к пигментным гранулам RPE (Ali,1971). Обратные "ретиномоторные перемещения" происходят на свету. Помимо ежедневной световой регуляции ретиномоторные перемещения испытывают циркадную регуляцию. Будучи помещенными в постоянную темноту, элонгация и ретракция фоторецепторов происходит в "ожидаемые" включения и выключения света (Pierce and Besharse,1985,1988; Menger et al.,2005). Melatonin является нейромодулятором, секретируемым из шишковидной железы под циркадным контролем, с наивысщей экспрессией во время фазы темноты. В соответствии с этим, melatonin вызывает удлинение колбочек (Pierce and Besharse,1985). Др. нейромодуляторы включают adenosine и γ-aminobutyric acid, которые также индуцируют элонгацию колбочек (Pierce and Besharse,1988; Rey and Burnside,1999), и dopamine, который индуцирует контракцию колбочек (Pierce and Besharse,1985; Dearry et al.,1990). Удлинение миоидной части колбочек является зависимым от микротрубочек, а сокращение зависимым от актина, тогда как элонгация и контракция палочек базируются на актине (Warren and Brunside,1978; O'Connor and Burnside,1981,1982; Burnside et al.,1983). Интересно, что ретиномотрные перемещения, по-видимому, необходимы для функционального созревания фоторецепторов (Hodel et al.,2006). Они, как полагают, размещая оптимально наружные сегменты палочек и колбочек позволяют максимально улавливать свет в scotopic и photopic условиях.
Секвестрация митохондрий в элипсоидном внутреннем сегменте является морфологической адаптацией, предположительно делающей их ближе к хороидальному кровоснабжению, более эффективному источнику кислорода (Stone et al.,2008). Митохондрии также образуют кластеры в окончаниях аксонов у видов с сосудистой сетью внутри сетчатки, это делает их ближе к ретинальному кровоснабжению (Stone et al.,2008).

The Nuclear Region


Ядро располагается между синаптическими окончаниями и внутренним сегментом (Figs. 1, 4). Это крупная органелла, которая занимает существенную часть клеточного объема. У большинства видов ядра палочек и колбочек имеют несколько отличающуюся форму, окрашиваются по-разному на гистологических препаратах и сегрегируют, чтобы создать разные sublaminae наружного ядерного слоя. У мышей и рыбок данио ядра палочек стремятся располагаться базально (vitreally) по сравнению с ядрами колбочек (Carter-Dawson and LaVail,1979; Branchek and Bremiller,1984). Было также отмечено, что ядра фоторецепторов мышей стремятся формировать апикально-базальные столбы (Carter-Dawson and LaVail,1979). Аппарат Golgi располагается апикально по отношению к ядру, тогда как эндоплазматический ретикулём обнаруживается как апикально, так и базально (Mercurio and Holtzman,1982).



Figure 4. The photoreceptor nuclear region. A: A schematic representation of the photoreceptor cell. The nucleus is highlighted in blue. A belt of cell junctions, erroneously called the outer limiting membrane (OLM), subdivides the photoreceptor cell surface into the apical and basolateral domains (highlighted in red). B: Confocal image of the outer limiting membrane in the retina of larval zebrafish. Cell junctions are visualized by phalloidin staining (in green, indicated with an arrowhead). The Crumbs polypeptide is detected by means of antibody staining (in red). It localizes apical to cell junctions. (Malicki lab). C: Electron micrograph of a section through the photoreceptor cell layer in larval zebrafish. Arrowheads indicate cell junctions, the nucleus is indicated with an asterisk. (Malicki lab). D: A schematic representation of the protein complex likely to regulate the formation of cell junctions in the outer limiting membrane. The formation of the apical cell membrane domain of the photoreceptor cell, and the integrity of the junctional complexes in the OLM require the function of Crumbs, a transmembrane protein that features a large extracellular domain and a short cytoplasmic tail. Crumbs cytoplasmic moiety binds a MAGUK protein Stardust/Nagie oko and a FERM-domain protein Mosaic eyes (Moe), which also bind each other. Par6, Par3, and aPKC are also thought to contribute to this protein complex. Crb, Crumbs; Moe, Mosaic eyes; Nok, Nagie oko; Std, Stardust. E: The nucleus is by far the most voluminous organelle in the cytoplasm of the photoreceptor cell. Its position is affected by the activity of a microtubule dependant motor, dynein, and nuclear envelope components that feature a C-terminal KASH domain (Syne family proteins in vertebrates). The KASH domain contains a lipophilic segment thought to span the outer membrane of the nuclear envelope. The cytoplasmic portion of many KASH-domain proteins is exceptionally long (close to 10,000 amino acids in some cases).



The Synapse


Фоторецепторы образуют синапсы с биполярными и горизонтальными клетками outer plexiform layer (OPL) сетчатки. Подобно механосенсорным волосковым клеткам фоторецепторы используют ленточные синапсы (Fig. 5), специализированные морфологические адаптации обычных химических синапсов, чтобы общаться с нижестоящими мишенями (tom Dieck and Brandstatter,2006). Ленточные синапсы это пресинаптические электрон-плотные "пластинки", перпендикулярные плазматической мембране и окруженные большим пулом синаптических пузырьков (Fig. 5B). Они распространяются от синаптически активной зоны в пресинаптическую цитоплазму (Lenzi and von Gersdorff,2001; Sterling and Matthews,2005; tom Dieck and Brandstatter,2006).

Figure 5. The synaptic terminal. A: Schematic of photoreceptor morphology; synaptic terminal is labeled in blue. B: Schematic of a rod photoreceptor synapse. Views of the rod terminal perpendicular (left) and parallel (right) to the face of ribbon. Presynaptically, the ribbon tethers several hundred vesicles (white circles in red ribbon) and the active zone docks ca. 100 vesicles (yellow circles). Postsynaptically, processes of 2 horizontal (h1, h2) and 2 bipolar (b1, b2) cells occupy the invagination. Reprinted with permission (Rao-Mirotznik et al.,1995). C: EM images of the "tetrad" ribbon synapse of a mammalian rod photoreceptor. Ribbon is indicated by an arrowhead and the inset is a confocal image of RIBEYE antibody staining. Reprinted with permission (tom Dieck et al.,2005). D: EM images of the "triad" ribbon synapse of a mammalian cone photoreceptor. Ribbons are indicated by arrowheads and the inset is a confocal image of RIBEYE antibody staining. Reprinted with permission (tom Dieck et al.,2005). E: Confocal image of a tangential section through macaque photoreceptor terminals. Dotted lines outline rod and cone presynaptic terminals immunostained for Bassoon (green), and the 1F subunit of an L-type Ca2C channel (red). The rod terminal typically comprises a single, crescent-shaped ribbon, but can appear as two separate but linked ribbons (arrowheads). The cone terminal contains an array of smaller ribbons that serve separate invaginations. Reprinted with permission (Wassle,2003).

Снова фоторецепторные палочки и колбочки обнаруживают отличающиеся структурные вариации ленточных синапсов (Sterling and Matthews,2005; tom Dieck and Brandstatter,2006). Синаптический конец, называется pedicle в колбочках и spherule в палочках. Обычно базальные концы палочек ветвятся на множество мелких окончаний, каждое содержит одиночную ленточку, соседствующую с "tetrad" из двух латеральных AMPA receptor-регулируемых отростков горизонтальных клеток и двух или более центральных mGluR6 receptor-регулируемых дендритов биполярных клеток (Fig. 5C; Sterling and Matthews,2005; tom Dieck and Brandstatter,2006). Колбочки в целом имеют более крупные окончания, содержащие несколько лент и больше сайтов-доков для пузырьков, чем в ленточных синапсах палочек (Fig. 5E). Ленточные синапсы колбочек ассоциируют с "triads", состоящим из двух латеральных AMPA-positive дендритов горизонтальных клеток и одного или боле центральных, mGluR6-positive, дендритов биполярных клеток (Fig. 5D). Окончания колбочек, но не палочек также образуют синапсы с кончиками дополнтельных mGluR1/5/6/7-регулируемых биполярных клеток за счет отличающихся базальных контактов на характерных расстояниях от триад. Ещё дальше от ленточных синапсов наблюдаются ещё более glutamate receptor-позитивные кластеры, которые возникают из отростков горизонтальных клеток. Предполагается, что способность glutamate, высвобождаемого из ленточных синапсов колбочек, соединяться с этими дополнительными клетками делает возможной передачу сигналов высшего порядка (Sterling and Matthews,2005). Функционально структура ленточных синапсов делает возможной более высокие скорости экзоцитоза glutaminergic пузырьков и более точно контролировать высвобождение glutamate, по сравнению с обычными синапсами (Sterling and Matthews,2005; tom Dieck and Brandstatter,2006). Т.о., ленточные синапсы позволяют фоторецепторам (особенно колбочкам) передавать градированные сигналы, тонко-управляемую информацию, связанную с широким кругом интенсивности света в "реальном времени".
В колбочках костистых рыб, но не в палочках количество синаптических полос снижается ночью. Снижение является циркадным, регулируемым с помощью внутриклеточного кальция и совпадает с усилением высвобождения трансмиттера (Vollrath and Spiwoks-Becker,1996). Недавние находки показали, что ленты в палочках млекопитающих также подвергаются достоверным морфологическим трансформациям в ответ на суточные изменения света, хотя эти изменения не циркадные по своей природе (Spiwoks-Becker et al.,2004). В темноте ленточки в палочках крупные и гладкие, но маленькие и "булавовидные " на свету. Эти изменения, как полагают, возникают из обусловленных фототрансдукцией изменениях во внутриклеточном кальции. Т.о., ленточки палочек могут транспортировать меньше пузырьков на свету, чем в темноте как способ адаптации.

Morphogenesis From Progenitor Cells


Поразительные морфологические признаки фоторецепторов позвоночных описаные выше формируются в результате дифференцировки клеток предшественников сетчатки, которые характеризуются очень отличной эпителиальной морфологией. Важным атрибутом дифференцирующихся фоторецепторов является то, что они остаются соединены посредством клеточных соединений с окружающими клетками (Hinds and Hinds,1979; Schmitt and Dowling,1999). Эти клеточные соединения, по-видимому, персистируют в течение всего развития и у взрослых в виде наружной лимитирующей мембраны. Морфологические изменения предшественников фоторецепторов описаны у нескольких видов (Hinds and Hinds,1979; Schmitt and Dowling,1999; Martinez-Navarrete et al.,2008; Stone et al.,2008). У рыбок данио, напр., первоначально короткие внутренние сегменты, содержащие соединительную ресничку на апикальном конце, затем удлиняются в направлении вентрикулярной поверхности. Эти внутренние сегменты также содержат грубый эндоплазматический ретикулём, рибосомы и митохондрии. Постепенно начинают выявляться наружные сегменты и синаптические окончания, хотя синаптические ленточки ещё не образуются (Schmitt and Dowling,1999). Внутренние сегменты увеличиваются и становятся различимыми элипсоидный и миоидный домены. После чего обнаруживаются незакрепленные ленточки в синаптических окончаниях. Наконец, наблюдаются увеличивающиеся наружные сегменты, а также увеличенные синаптические окончания с закрепленными ленточками и инвагинирующими отростками.
Нейрогенез фоторецептров из клеток предшественников в нишах может происходить и у взрослых. У рыб и амфибий ниша ciliary marginal zone (CMZ) добавляет фоторецепторы как часть роста глаз в течение всего взрослого периода, а сетчатка постнатальных кур также содержит мультипотентные родоначальники по краю сетчатки (Wetts et al.,1989; Harris and Perron,1998; Fischer and Reh,2000). Как недавно сообщалось, нейрогенез фоторецепторов палочек и колбочек из родоначальников в сетчатке может также происходить на краю сетчатки у обезьян и человека (Martinez-Navarrete et al.,2008).

MOLECULAR MECHANISMS OF PHOTORECEPTOR MORPHOGENESIS


Сложная морфология, которая характеризует клетки фоторецепторов позвоночных нуждается в сложных механизмах для управления её образованием. Молекулярные моторы играют основную роль в морфогенезе фоторецепторов и также действуют трансмембранные белки, которые обладают определенными характеристиками в доменах клеточной мембраны и обусловливают их замысловатое складкообразование. Большинство. если не все, из них также необходимы для долговременной жизнеспособности клеток.

Membrane Compartmentalization


Компартментализация клеточной мембраны является важным свойством многих клеток (rev. Caudron and Barral,2009). Лучше всего изученным примером является подразделение эпителиальных клеток на апикальный и базолетаральный домены клеточной мембраны. В эпителиях необходимость подразделения мембраны очевидна, т.к. одна область клеточной поверхности обращена во внешнюю среду, тогда как др. во внеклеточное окружение ткани. Ясно, что различные характеристики внешнего и внутреннего окружения диктуют различия в белковом составе. Это особенно наглядно в случае транспортеров, которые облегчают направленное перемещение ионов, малых молекул и белков в и из клетки. Бартером диффузии между двумя этими компартментами является набор клеточных соединений и ассоциированных структур. Он предупреждает перемешивание апикальных и базолатеральных белков.
Подразделение клеточной мембраны на апикальный и базолатеральный домены также присутствует во многих сенсорных клетках, включая волосковые клетки, обонятельные сенсорные нейроны и фоторецепторы позвоночных и насекомых (Hirokawa and Tilney,1982; Hansen and Zeiske,1993; Longley and Ready,1995; Fig. 4B,C). Многочисленные доказательства указывают на то, что генетические основы апико-базальной полярности в эпителиальных слоях и фоторецепторах очень близки.
Одним из ключевых регуляторов апикально-базальной полярности является ген crumbs. Первоначально открытый во время насыщяющего мутагенного скрининга у мух (Jurgens et al.,1984), гены crumbs кодируют трансмембранные белки, которые характеризуются короткой С-терминальной областью в 40 аминокислот и внеклеточным доменом варьирующей длины. Гены crumbs необходимы для собственно образования клеточных соединений, которые определяют границы ежду апикальным и базолатеральным доменами клеточной мембраны (Knust and Bossinger,2002). В то время как потеря функции crumbs вызывает дезинтеграцию клеточных соединений (Grawe et al.,1996), их избыточная экспрессия ведет к массивной экспансии апикального домена клеточной поверхности в эмбриональном эпителии мух (Wodarz et al.,1995). Родственные фенотипы наблюдаются в клетках фоторецепторов мух (Pellikka et al.,2002). Как и у Drosophila, мутации crumbs у позвоночных также затрагивают полярность клеточных мембран. У рыбок данио потеря активности crumbs ведет к драматическому снижению размера апикальной части мембраны фоторецепторных клеток, что определяется по расстоянию между наружной лимитирующей мембраной и наружным сегментом (Omori and Malicki,2006). У мышей мутанты crumbs характеризуются потерей клеточных соединений с наружной лимитирующей мембраной (Mehalow et al.,2003; van de Pavert et al.,2004). В тестах подобного типа избыточная экспрессия crumbs однако не вызывает экспансии апикальной мембраны в фоторецепторах рыбок данио (Omori and Malicki,2006).
Продукт гена crumbs функционирует как компонент большого белкового комплекса. У рыбок данио его С-конец связывает FERM (Four point one, Ezrin, Radixin, Moesin) доменовый белок, кодируемый локусом mosaic eyes (moe) (Hsu et al.,2006). Белок Moe экспрессируется по всей клеточной поверхности фоторецептора и в противоположность crumbs, потеря его функции, как полагают, приводит к экспансии домена апикальной клеточной поверхности, наружного сегмента в частности (Hsu et al.,2006). Учитывая их контрастирующие мутантные фенотипы, Moe, как полагают. действует как негативный регулятор Crumbs. Иных кроме фенотипических наблюдений, прямых доказательств, подтверждающих эту модель, нет. Помимо Moe C-конец Crumbs белков также взаимодействует с MAGUK фактором, кодируемым локусом nagie oko/stardust (pals1 у мышей) и PDZ доменовым белком, Par6 (Hong et al.,2001; Lemmers et al.,2004). Par6, в свою очередь соединяется с Par3 и aPKC, двумя белками, как известно, действующими как регуляторы апикально-базальной полярности в эмбриональном эпителии мух (rev. Shin et al.,2006; Fig. 4D). В сетчатке рыбок данио, Nok (Nagie oko), Par3 и Has/aPKC ко-локализуются с Crumbs апикальнее клеточных соединений наружной лимитирующей мембраны (Fig. 4B; Horne-Badovinac et al.,2001; Wei and Malicki,2002; Wei et al.,2004). Неизвестно, однако, функционируют ли они как регуляторы размера апикальной клеточной поверхности в фоторецепторах позвоночных. В случае nok, напр., хотя мутантные линии и жизнеспособны, но этот вопрос трудно адресовать, поскольку сетчатка у nok мутантных животных дезорганизована из-за более раннего функционирования этого гена в нейроэпителии сетчатки и в RPE (Zou et al.,2008).
Др. важным подразделением клеточной мембраны, которое возможно существует у всех реснитчатых клеток, это то, что определяет компартмент реснички на апикальной поверхности и наз. "ciliary pore" (Rosenbaum and Witman,2002). Т.к. наружные сегменты фоторецепторов являются наиболее выдающимися структурами, производными ресничек, то это подразделение играет критическую роль в функции фоторецептора. Оно гарантирует, напр., то, что opsins не диффундируют из наружного сегмента в остальную часть клеточной мембраны фоторецептора. В отсутствие наружного сегмента, opsins обнаруживаются во всей клеточной мембране и вносят вклад в дегенерацию фоторецепторов (напр., Tsujikawa and Malicki,2004). Природа барьера диффузии из наружного сегмента или др. типов ресничек, неясна, т.к. нет явных структурных аналогов пояска клеточных соединений, видимых с помощью ультраструктурного или гистохимического анализа. Наиболее правдоподобными кандидатами на роль структурных компонентов этого барьера диффузии являются т.наз. преходящие волокна, наблюдаемые в некоторых типах ресничек (Dute and Kung,1978; Perkins et al.,1986; Deane et al.,2001) или элементах из реснитчатого ожерелья (Gilula and Satir,1972). Молекулярные компоненты этих структур ресничек, однако, почти неизвестны.

Transport Mechanisms


Наружный сегмент является одной из наиболее обширных частей фоторецептора позвоночных, но она лишена рибосом и поэтому не синтезирует собственных белков. Следовательно, все белки наружного сегмента доставляются из тела клетки. Это безусловно является трудной задачей, поскольку только opsin присутствует примерно в 1 биллионе копий в наружном сегменте и постоянно восполняется (Pugh and Lamb,2000). Т.к. его отсутствие ведет к неспособности образования наружного сегмента, то палочки opsin не только трансмембранный рецептор, но и также важный структурный компонент (Lem et al.,1999). Это может быть одной из причин, почему количество opsin в наружном сегменте тщательно регулируется: уменьшение содержания opsin наполовину ведет к дегенерации фоторецептора, как и избыточная экспрессия опсина (Olsson et al.,1992; Lem et al.,1999). Opsin является наиболее многочисленным белком наружного сегмента и поэтому привлекает наибольшее внимание при анализе ранспорта белков в фоторецепторах.
Путешествие белков из Golgi в мембраны наружного сегмента состоит из двух частей, которые связаны с двумя компартментами апикальной мембраны. Первая часть транспортного маршрута переносит белки из Golgi к основанию, соединенному с ресничкой (Fig. 3C). Транспорт осуществляется в направлении минус концов микротрубочек и, по-видимому, обеспечивается, по крайней мере частично, dynein, на минус-конец нацеленным зависимым от микротрубочек мотором (Tai et al.,1999). Вторая часть транспорта осуществляется внутри компартмента реснички (Fig. 3B), который, как обсуждалось выше, ограничивается с помощью специализированной области апикальной клеточной мембраны. Этот транспорт осуществляется в направлении плюс концов микротрубочек и управляется, по крайней мере частично, с помощью kinesins.

Transport From the Golgi to the Apical Membrane


Палочки опсина и, по-видимому, большинство др. белков наружного сегмента, транспортируются из эндоплазматического ретикулема в Golgi, и из него к основанию наружного сегмента фоторецептора. Этот процесс может быть подразделен на 3 стадии: отпочкование пузырьков, переносчиков опсина, транслокация пузырьков и, наконец, их слияние с клеточной мембраной вблизи связующей реснички (connecting cilium). Несомненно каждая из этих ступеней использует сложный молекулярный аппарат и наше понимание его сложностей рудиментарно в лучшем случае. Некоторые из игроков начинают объявляться, об этом ниже.

Budding of opsin carrier vesicles.


44 C-терминальных аминокислоты палочки опсина необходимы и достаточны для его корректного транспорта в наружный сегмент (Tam et al.,2000; Perkins et al.,2002). Учитывая эту функцию, не удивительно, что эта пептидная область родопсина, по-видимому, взаимодействует с несколькими белками (Tai et al.,1999; Deretic et al.,2005; Chuang et al.,2007; Mazelova et al.,2009). Одним из его взаимодействующих партнеров является малая GTPase, Arf4, которая располагается в базальной части внутреннего сегмента фоторецептора, в области, занимаемой также аппаратом Golgi (Deretic et al.,2005). GTP-связанные Arfs, как полагают, стимулируют отпочкование пузырьков благодаря рекрутированию покровных белков (Nie et al.,2003; Nie and Randazzo,2006). Соответственно, блокирование антителами функции Arf4 ингибирует образование родопсин переносящих пузырьков при анализе экстрактов сетчатки (Deretic et al.,2005). В том же исследовании помехи функции конца самого опсина дают сходный фенотип (Deretic et al.,1998). Эти результаты указывают на то, что взаимодействие Arf4 с С-терминальной последовательностью opsin необходимо для отпочкования транспортных пузырьков, переносчиков опсина. Ясно, что Arf4 не может быть единственным элементом молекулярного каскада, который регулирует отпочкование пузырьков. В самом деле, недавние исследования подтвердили, что Arf4 формирует комплекс с Arf GAP, ASAP1; др. малой GTPase, Rab11; и с Arf и Rab11 эффектором, FIP3 (Mazelova et al.,2009; Fig. 3C).

Vesicle transport.


Будучи сформированными, опсин-содержащие пузырьки транслоцируются в направлении основания наружного сегмента. Этот процесс первоначально был установлен с помощью микроскопии и радиоактивного мечения (Young and Droz,1968; Hall et al.,1969; Papermaster et al.,1985,1986). Поскольку микротрубочки внутреннего сегмента фоторецепторов направлены в направлении апикальной поверхности (Troutt and Burnside,1988), то dynein является прекрасным кандидатом на роль мотора, который управляет этим процессом. В самом деле, эта идея подтверждается наблюдением, что opsin-переносящие пузырьки транслоцируются вдоль микротрубочек в in vitro исследовании. Интересно, что этот процесс, по-видимому, обеспечивается за счёт прямого связующего взаимодействия между С-концом полипептида опсина и одной из легких цепей dynein (Tai et al.,1999). Учитывая громадные количества опсина, транспортируемого в наружный сегмент, и ужасные последствия нарушения доставки opsin (см. "morphogenesis and disease"), следует ожидать дублирования этого транспортного механизма. Альтернативные механизмы взаимодействия opsin-переносящих пузырьков с моторными комплексами, однако пока не задокументированы.
Коме opsins, перенос белков в область наружного сегмента изучен плохо. Следует ожидать, что все белки, связанные в наружным сегментом могут обладать общим наводящим на цель сигналом. Однако это, по-видимому, не так. C-терминальный пептид, который целенаправленно доставляет Peripherin/Rds в мембраны наружного сегмента, по-видимому, не связан с направляющей последовательностью (Tam et al.,2004). Это отсутствие очевидных наводящих на цель мотивов согласуется с недавней идеей, что для многих белков наружный сегмент является "default" местом предназначения доставки в фоторецепторе и должны существовать белки, которые располагаются вне наружного сегмента, которые необходимы для соотв. механизмов доставки (Baker et al.,2008).

Fusion of vesicles with the target membrane.


Оказавшись у основания соединительной реснички, пузырьки переносчики опсина, по-видимому, сливаются с клеточной мембраной в специализированной апикальной области, которая состоит из нескольких мембранных складок (гребней), отходящих радиально от апикальной части реснички, наз. periciliary ridge complex (Peters et al.,1983; Fig. 3E, and 3F inset). Примечательно, что, по крайней мере, у амфибий 9 мембранных складок окружает соединительную ресничку, указывая тем самым, что эта структура связана с архитектурой реснички, которую характеризуют 9 пар микротрубочек. Несколько микроскопических техник было использовано, чтобы продемонстрировать, что опсин переносящие пузырьки сливаются с мембранами перицилиарного комплекса гребней (Papermaster et al.,1985,1986). На молекулярном уровне одним из наиболее хорошо охарактеризованных генетических регуляторов этого процесса является Rab8. Он располагается вблизи соединительной реснички и её базального тельца (Deretic et al.,1995), а избыточная экспрессия его доминантно-негативной формы приводит к накоплению пузырьков у основания соединительной реснички и к быстрой дегенерации фоторецептора. Этот поразительный фенотип указывает на то, что Rab8 играет ключевую роль в слиянии пузырьков, переносящих опсин, с клеточной мембраной (Moritz et al.,2001).
Роль Rab8 в образовании наружного сегмента согласуется с недавними находками, что малая GTPase является важным регулятором образования ресничек. Rab8 располагается в мембране реснички клеток культвируемого RPE, и взаимодействует как с белковым комплексом BBS (Bardet-Biedl syndrome) , так и IFT (intraflagellar transport) частицами (Nachury et al.,2007; Omori et al.,2008). Эти взаимодействия обеспечиваются посредством их предполагаемых эффекторов Rabin8 и Rabaptin5. Если Rabin8 связывает BBS1 (Nachury et al.,2007), то Rabaptin5 соединяется с белком Elipsa, который в свою очередь строго ассоциирует с IFT20 (Omori et al.,2008; Follit et al.,2009). Пути Rab8 эффекторов, по-видимому, вносят вклад в морфогенез наружного сегмента, поскольку мутации BBS1 и Elipsa приводят к потере фоторецепторов (Doerre and Malicki,2002; Mykytyn et al.,2002). Фактически у мутантов elipsa наружные сегменты фоторецепторов полностью отсутствуют. Это может быть связано, однако, с предполагаемой функцией Elipsa в сборке частиц IFT , а не с его связывающими взаимодействиями с Rab8 комплексом (see below).
Учитывая участие Rab8 в слиянии пузырьков в основании соединительной реснички фоторецептора, можно предположить, что вообще-то этот процесс может быть смоделирован после экзоцитоза у дрожжей, который обеспечивается т. наз. exocyst комплексом (Jahn et al.,2003). Экзоцист, фактически, локализуется в ресничках MDCK клеток (Rogers et al.,2004) и одна из ключевых, инициальных ступеней его сборки у дрожжей использует малую GTPase, Sec4p, гомолог Rab8 (Ang et al.,2003). подобно Sec4p, GTP-связанная Rab8 д. таким образом инициировать слияние пузырьков в основании соединяющей реснички. Др. малая GTPase, которая как предполагают, выполняет функцию Sec4p у многоклеточных эукариот это Rab11 (Beronja et al.,2005). Подобно Rab8 в глазах позвоночных, снижение активности Rab11 в фоторецепторах мух ведет к накоплению опсиновых пузырьков в цитоплазме (Satoh et al.,2005). Rab11 ассоциирует с post Golgi пузырьками в сетчатке лягушек, но его функция в основном ассоциирует с отпочкованием пузырьков, а не с их слиянием (Deretic et al.,1996).
Сходство между экзоцитозом у дрожжей и целенаправленной доставкой пузырьков в фоторецепторных клетках может быть распространено и на мух. У дрожжей путь образования экзоциста это GTP-связанный Sec4p ассоциирует с Sec15p (Guo et al.,1999). Родственное соединяющее взаимодействие может происходить между Rab11 и Sec15 в фоторецепторах мух, поскольку Sec15 мутантные фоторецепторные клетки обнаруживают аномальное распределение Rab11 и дают более короткие рабдомеры (Wu et al.,2005). Кстати, роль Sec15 в фоторецепторах позвоночных пока не подтверждена. Помимо гомологов компонентов комплекса экзоциста, Ezrin, Moesin и Rac1 являются кандидатами на роль регуляторов слияния опсиновых пузырьков с перицилиарной мембраной фоторецептров. Они локализуются совместно с Rab8 вблизи соединительной реснички и устраняются из этой области одновременно с блокадой слияния опсиновых пузырьков (Deretic et al.,2004).

Transport Within the Ciliary Compartment


Оказавшись у основания соединяющей реснички белки наружного сегмента транспортируются вдоль аксонемы реснички в наружный сегмент фоторецептора (Fig. 3B). Хотя номенклатура показывает, что наружный сегмент и соединяющая ресничка являются разными вещами, весь наружный сегмент может рассматриваться как ресничка, характеризующаяся сильно расширенной и собранной в складки мембраной.

The motors.


По сравнению с внутренним сегментом, направление микротрубочек в наружном сегменте обратное (Troutt and Burnside,1988), и соотв. апикально направленный зависимый от микротрубочек транспорт opsins в наружном сегменте нуждается в моторах, направлнных на плюс конец. В самом деле, kinesins играют критическую роль в транспорте опсинов и др. белков в наружном сегменте. У условно Kif3a нокаутных мышей, Opsin, Arrestin и Peripherin неправильно локализуются во внутреннем сегменте (Marszalek et al.,2000).В противоположность этому локализация ?-transducin не изменена.
Обычная локализация transducin у Kif3a мутантов является курьёзным наблюдением, которое может быть объяснено присутствием др. параллельного механизма транспорта, вообще-то управляемого др. kinesin. Множественные kinesins действуют, фактически, кооперативно при формировании ресничек нематод (rev. Blacque et al.,2008). В т. наз. amphidial каналах Caenorhabditis elegans, два kinesins управляют формированием ресничек: гетеротримерный кинезин, Kif3; и гомодимерный, OSM-3. Функция этих двух моторов частично перекрывается: поскольку потеря функции только Kif3 не вызывает фенотипических отклонений, а отсутствие OSM-3 затрагивает только дистальный сегмент ресничек, дефицит обоих моторов вызывает полное отсутствие аксонемы реснички (Snow et al.,2004; Ou et al.,2005; Pan et al.,2006). Т.о., поскольку одного OSM-3 достаточно для формирования дистальной части amphidial ресничек, то оба мотора действуют, перекрываясь в проксимальной части. Интересно, что эти генетически отличающиеся механизмы коррелируют со структурными свойствами amphidial ресничек: в то время как проксимальная часть этих ресничек содержит микротрубочки дублеты, OSM-3-зависимая дистальная часть обладает одиночными микротрубочками (Ward et al.,1975; Snow et al.,2004).
Исследования на нематодах подсказали тест с Kif17, гомологом у позвоночных OSM-3 kinesin нематод, относительно его роли в формировании наружного сегмента фоторецепторов. В самом деле, антисмысловой нокдаун Kif17 у рыбок данио приводит к потере наружного сегмента (Insinna et al.,2008). Этот фенотип кажется более тяжелым по сравнению с ассоциированным дефектом Kif3a у мышей: наружные сегменты в основном отсутствуют у личинок рыбок данио вследствие morpholino нокдауна (Insinna et al.,2008). Т.о., два kinesins функционируют одинаково в amphidial ресничках нематод и в фоторецепторных клетках позвоночных. Более того, подобно ресничкам нематод микротрубочки фоторецепторных клеток позвоночных формируют дублеты в основании наружного сегмента и одиночные микротрубочки в дистальном регионе (Cohen,1965; Yacob et al.,1977). Несмотря на это генетическое и структурное сходство, вряд ли нематодная модель приложима к фоторецепторным клеткам позвоночных. В противоположность amphidial ресничкам нематод, kinesins, по-видимому, не функционируют, перекрываясь в базальной части наружного сегмента (Insinna et al.,2008). Это не является неожиданным, т.к. даже у C. elegans разные классы ресничек нуждаются в отличающихся вкладах гомодимерных и гетеротримерных кинезинов: эти моторы являются полностью перекрывающимися в построении только субнабора ресничек amphidial канала (Evans et al.,2006; Mukhopadhyay et al.,2007). Относительные вклады гомодимрных и гетеротримерных кинезинов в формирование наружного сегмента необходимо исследовать в будущем.

The intraflagellar particle.


Кинезины ресничек транслоцируют комплекс белков. известный как частицы intraflagellar transport (IFT) (Fig. 3B, D), которые сегодня рассматриваются как состоящие приблизительно из 15-20 полипептидов (rev. Pedersen and Rosenbaum,2008). IFT белки являются первостепенными для образования ресничек, включая и образование наружного сегмента фоторецепторов. У гипоморфных мутантов мышей по гену Ift88/polaris наружные сегменты фоторецепторов дезорганизованы, а у мутантных рыбок данио ift88/oval они полностью отсутствуют, хотя некоторые подобные стекам мембран наружного сегмента формируются на боковых поверхностях клеток (Tsujikawa and Malicki,2004). Сходным образом у мутантов рыбок данио по локусам elipsa и fleer как кодирующие с IFT частицами ассоциированные белки, так и наружные сегменты полностью отсутствуют (Doerre and Malicki,2002). Хотя можно предположить, что все компоненты IFT частиц участвуют в равной степени в сборке и функционировании честиц, но это, по-видимому, не так. В противоположность oval, elipsa и fleer , мутантные curly рыбки данио, нулевые по функции ift57, дифференцируют короткие наружные сегменты (Krock and Perkins,2008). Т.о., oval и curly локусы, по-видимому, играют в чем то отличающиеся роли, по крайней мере, в наружном сегменте фоторецепторов, но и др. ресничках также. Эти различия могут быть связаны со структурой частиц IFT, это пока плохо изученная тема.
Однако, взаимодействуют ли с IFT частицами кинезиновые моторы? Т.к. Kif3b соединяется с Ift20 в дрожжевом двух-гибридном исследовании (Baker et al.,2003), то кажется вполне вероятным, что гетеротримерный кинезин взаимодействует с IFT частицами путем соединения с их компонентом Ift20. Роль Ift20 , по-видимому, не столь проста. У мутантов рыбок данио ift57/curly Ift20 больше не ко-преципитируется с др. IFT белками и что интересно гетеротримерный кинезин, по-видимому, соединяется с IFT частицами более сильно (Krock and Perkins,2008). Эти эксперименты, по-видимому, указывают на то, что Ift20 не обязателен для связывания кинезина и что напротив может функционировать как негативный регулятор этого процесса. Таким образом остается неизвестным какой белок IFT обеспечивает связывание частиц с Kif3. Взаимодействия IFT частиц с Kif17 ещё менее очевидно.
Хорошее понимание межбелковых взаимодействий в IFT частицах может помочь изучению его взаимодействий с др. белковыми комплексами. В некоторых исследованиях предприняты попытки определить, как IFT белки физически взаимодействуют др. с др. (Baker et al.,2003; Lucker et al.,2005; Omori et al.,2008). Напр., IFT57 и IFT20, по-видимому, соединяются др. с др. , также как IFT74 и IFT81. Как связываются партнеры из большинства др. IFT белков остается неизвестным.

The cargo.


Обычно считают, что основной функцией IFT частиц является обеспечение транспорта полипептидов в ресничке. Вообще-то лучшим примером этого является транспорт радиальных спиц в кончики жгутиков Chlamydomonas flagella (Qin et al.,2004; Pan and Snell,2005). Помимо цитоскелетных белков IFT , как полагают, также поддерживает транспорт ассоциированных с мембранами белков, таких как TRP каналы (Qin et al.,2005). Естественно, в контексте фоторецепторов важно знать нуждается ли транспорт opsin в IFT. Хотя можно предполагать, что внедренные в мембраны опсины взаимодействуют с белками IFT частиц, биохимические доказательства, подтверждающие эту модель, не столь однозначны. C-терминальные 40 аминокислот опсина взаимодействуют, однако с SARA (Smad Anchor for Receptor Activation), белком первоначально идентифицированным как компонент сигнального пути transforming growth factor-β (Tsukazaki et al.,1998). Интересно, что в фоторецепторах SARA локализуется в везикулярных структурах, обнаруживаемых вдоль аксонемы реснички, преимущественно в основании наружного сегмента (Chuang et al.,2007). Столкновение с SARA функцией ведет к накоплению пузырьков в этой области, поразительный фенотип, который иногда возникает в результате разрыва всего наружного сегмента (Chuang et al.,2007). SARA соединяется с Syntaxin 3 и это, как полагают, способствует слиянию opsin-содержащих пузырьков в основании наружного сегмента, процесса, как полагают, обеспечивающего формирования дисков наружного сегмента (Fig. 2I). Как указывалось ранее, это мнение противоречит предыдущей модели, указывающей на то, что диски палочек формируются за счет эвагинации мембраны, сопровождаемой ограждением внеклеточного пространства между соседними выпячиваниями с помощью билатерально растущей мембраны краев дисков (Tokuyasu and Yamada,1959; Steinberg et al.,1980). Как SARA-позитивные пузырьки образуются и играют ли роль IFT в из перемещении остается неизвестным.

Other ciliary proteins.


Многие и др. гены, по-видимому, участвуют в транспорте белков в соединяющей ресничке фоторецепторов. Некоторые из них определенно необходимы для формирования наружного сегмента, т.к. в их отсутствие наружные сегменты не образуются вообще. В этих случаях мутантные фенотипы вызывают дезорганизацию наружных сегментов или дегенерацию фоторецепторов без видимых аномалий в морфологии фоторецепторов. Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator (RPGR) и его партнер по связыванию RPGR-interacting protein (RPGRIP), напр., составляют пару белков, которые могут участвовать в транспорте в ресничке фоторецепторов (Meindl et al.,1996; Roepman et al.,2000). Доказательства этого базируются на наблюдении, что продукт гена RPGR ко-иммунопреципитируется с IFT88 (Khanna et al.,2005). Два белка, по-видимому, функционально родственны, т.к. локализация RPGR в соединяюще ресничке требует присутствия RPGRIP, а нокаут любого из белков вызывает дезорганизацию наружного сегмента (Zhao et al.,2003). Др. группа белков, которая может участвовать в цилиарном транспорте в фоторецепторах, это кодируемые локусами Bardet-Biedl syndrome (BBS). В ресничках нематод BBS белки транслоцируются со скоростью, характерной для IFT частиц, а реснички BBS мутантных нематод более коротки по сравнению с нормой (Blacque et al.,2004). У мышей, мутантных по генам BBS, opsins располагаются неправильно, фенотип, который может быть связан с дефектами цилиарного транспорта (Nishimura et al.,2004; Abd-El-Barr et al.,2007; Davis et al.,2007).
Nephrocystins ещё одна группа белков, которые могут участвовать в цилиарном транспорте. Два nephrocystins, которые были пока исследованы у нематод располагаются в основании реснички и функционируют, перекрываясь с B9 доменовыми белками: двойные по nephrocystins и B9 генам мутанты обнаруживают укорочение ресничек (Williams et al.,2008). Кроме того, уровни определенных компонентов аппарата IFT, по-видимому, снижены в ресничках C. elegans nephrocystin мутантов и нарушена также скорость транслокации IFT52 (Jauregui et al.,2008). Эти наблюдения открывают возможность, что NPHP гены регулируют IFT , по крайней мере, в некоторых типах ресничек. В фоторецепторах позвоночных nephrocystin 5 строго экспрессируется во всем наружном сегменте, тогда как nephrocystin 1 располагается вблизи базального тельца (Otto et al.,2005; Fliegauf et al.,2006). Интересно, что NPHP6, также известный как CEP290, необходим для локализации Rab8 в первичной ресничке (Kim et al.,2008; Tsang et al.,2008). Принимая во внимание, что Rab8, как полагают, функционирует в доставке пузырьков, содержащих opsin, к основанию наружного сегмента (see above), очевидно, что Nephrocystins могут участвовать во множественных молекулярных событиях, чтобы сформировать и поддерживать структуру фоторецепторов.
Наконец, ценным замечанием является то, что избыточные количества opsin накапливаются вблизи базального тельца и в соединительной ресничке линий мышей, которые несут мутации в гене myosin VIIa (Myo7a) (Liu et al.,1999). Это привело к идее, что Myo7a может также вносить вклад в транспорт опсина. Хотя это может быть и так, но его вклад скорее всего относительно мал, т.к. фоторецепторы Myo7a мутантных мышей обнаруживают нормальную или почти нормальную долю выживших (Liu et al.,1999).

Outer Segment Architecture


Трудно быть не впечатленным регулярным параллельным расположением сотен мембранных складок в наружном сегменте фоторецепторов и удивиться, какой механизм отливает их в форму с такой изысканной точностью клеточного аппарата.

Rhodopsin and disk biogenesis.


Хотя обычно считают в качестве единственного белка фототрансдукции rhodopsin, но он также является необходимым структурным белком, поскольку наружные сегменты полностью неспособны развиваться у нокаутных по rhodopsin мышей (Humphries et al.,1997; Lem et al.,1999). Rhodopsin экспрессируется в зрелых дисках и окружающей плазматической мембране и поэтому можно предположить, что он играет простую структурную роль в поддержании наружных сегментов. Однако rhodopsin экспрессируется также в зарождающихся дисках, а неспособность наружных сегментов формироваться у нокаутных по rhodopsin мышей указывает на неожиданную роль для rhodopsin в биогенезе наружных сегментов. Эти находки цитируются как подтверждение модели "fusion" образования наружных сегментов, обеспечиваемого opsin-нагруженными пузырьками (Chuang et al.,2007).

Rim proteins.


Peripherin/Rds и Rom-1 являются tetraspanin или белками сверхсемейства transmembrane 4, необходимых для морфогенеза нормальных дисков (reviewed by Goldberg,2006). В противоположность Opsin, Periperin/rds и Rom-1 специфически располагаются на краях дисков зрелых палочек (Fig. 2G; Arikawa et al.,1992; Bascom et al.,1992). Periperin/rds экспрессируется также в соседней ресничке по краям зарождающихся дисков палочек (Arikawa et al.,1992). Нокаут periperin выявляет дифференциальную потребность в палочках и колбочках. Учитывая преимущества обогащения колбочек у Nrl нокаутных мышей дифференцировка фоторецепторов колбочек была изучена у peripherin/rds:nrl двойных нокаутных мышей (Farjo et al.,2006). У этих животных наружные сегменты колбочек развиваются и сохраняют зрительную функцию (Farjo et al.,2006). Они, однако, увеличены и морфологически дезорганизованы. Эти структурные аномалии, как было предположено, является результатом нарушения образования складок из эвагинирующих ламелл (Farjo et al.,2006). Напротив, наружные сегменты палочек неспособны формироваться полностью у periperin/rds мутантов (Sanyal and Jansen,1981; Jansen and Sanyal,1984). Эти фенотипические отличия между палочками и колбочками могут отражать разные паттерны расположения: в колбочках Peripherin/Rds располагаются по краям наружного сегмента в областях, соседствующих с соединительной ресничкой, тогда как в палочках он присутствует вокруг краёв всех дисков. Потеря peripherin/Rds также предупреждает образование оболочек внеклеточного матрикса колбочек из покрывающего колбочки наружного сегмента (Farjo et al.,2006). Это указывает на то, что Peripherin/Rds закрепляет как наружные сегменты колбочек, так и их внеклеточное окружение. Т.о., эти исследования выявили важную потребность в гене periperin/rds в биогенезе наружных сегментов палочек и более умеренную роль в структурной организации колбочек.
Rom-1 и Peripherin/Rds являются гомологами белков, которые формируют гетеро-олигомеры (Goldberg and Molday,1996; Loewen and Molday,2000; Loewen et al.,2001). Нокаут Rom-1 приводит к увеличению дисков и дезорганизации наружных сегментов палочек, напоминающих фенотип, описанный для потери Peripherin/Rds в наружных сегментах колбочек (Clarke et al.,2000). Менее тяжелый фенотип наблюдается в палочках Rom-1 нулевых мутантов поскольку Peripherin/rds нулевые мутанты могут возникать благодаря способности peripherin формировать гомотетрамеры, которые, по-видимому, могут компенсировать отсутствие Rom-1. Упомянутые выше комплексы Rom-1 и Peripherin/Rds, как полагают, формируют также искривленные края дисков за счет олигомеризации вокруг краёв дисков или поперек соседних мембран (Loewen and Molday,2000; Boesze-Battaglia et al.,2002).

Base outer segment proteins.


Prominin 1 и Protocadherin 21 обладают иным интригующим субклеточным распределением: оба они локализуются в основании наружного сегмента. Они также дают сходные мутантные фенотипы, указывая тем самым, что обладают сходными функциями в морфогенезе наружных сегментов. Prominin 1 является трансмембранным гликопротеином и ультраструктрный анализ трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму prominin-1 выявляет избыточный рост и неправильную ориентмцию мембран дисков (Yang et al.,2008). Protocadherin 21 является специфичным для фоторецепторов cadherin, располагающимся на зарождающихся дисках наружного сегмента на краях противоположных соединяющей ресничке. Его локализация, т.о., комплементарна таковой для Peripherin/Rds (Rattner et al.,2001). Нокаут гена protocadherin 21 ведет к очень крупным размерам дисков наружных сегментов (Rattner et al.,2001). Сходный фенотип избыточного роста дисков происходит вследствие деполимеризации актиновых филамент с помощью cytochalasin D (Williams et al.,1988; Vaughan and Fisher,1989) и вызывает избыточный рост немногих зарождающихся дисков скорее, по сравнению с нормальным ростом большинства.
Несколько наблюдений указывают на то, что Prominin 1 и Protocadherin 21 образуют функциональный комплекс. Во-первых, в соответствии с их сходной локализацией и фенотипами морфогенеза дисков, Prominin 1, как было установлено, с помощью исследований по физическому связыванию взаимодействует с Protocadherin 21 и Actin (Yang et al.,2008). Более того, экспрессия мутантного Prominin 1 снижает уровни расщепленного Protocadherin 21, обычно наблюдаемого во время морфогенеза дисков и снижает взаимодействие с actin. Наконец, экспрессия мутантного Prominin 1 приводит к неправильной локализации как дикого типа Prominin 1 , так и Protocadherin по всему фоторецептору, тогда как Rom-1 и компонент cGMP-управляемого канала обнаруживают нормальную локализацию (Yang et al.,2008). Какова же функция комплекса Prominin/Protocadherin? Т.к. Prominin 1 ассоциирует с разными выпячиваниями мембран, то было предположено, что это вызывает искривления формирующихся дисков и связывает соседние диски во время морфогенеза наружного сегмента за счёт цис- и транс-димеризации их доменов лейциновых застежек, соотв. (Jaszai et al.,2007). Недавняя идентификация физических взаимодействий Prominin 1 и Protocadherin 21 указывает на то, что гетеродимерные комплексы могут также регулировать собственно выравнивание зарождающихся дисков (Yang et al.,2008). Наконец, Prominin 1 может также действовать в кооперации с белком внеклеточного матрикса Spacemaker. Prominin и Spacemaker у дрозофилы взаимодействуют на кончиках микроворсинок рабдомеров, чтобы удерживать рабдомеры соседних фоторецепторов в отдалении один от др. (Zelhof et al.,2006).

Plasma membrane proteins.


В противовес Peripherin/Rds и Rom-1, которые располагаются по краям дисков, cGMP-управляемый канал и Na/Ca-K exchanger располагаются на плазматической мембране наружного сегмента (Fig. 2G). ?-субъединица cGMP-gated канала характеризуется N-терминальной glutamic acid- и proline-rich областью, обозначаемой как GARP (glutamic acid rich protein). Кроме того, обнаружены два цитоплазматических GARPs в наружных сегментах. Все три белка, по-видимому, возникают как продукты альтернативного сплайсинга одного гена (Colville and Molday,1996). GARPs располагаются по краям дисков и и вырезок в палочках, но не обнаруживаются в наружном сегменте колбочек (Colville and Molday,1996). Поскольку фоторецепторные GARPs связывают Peripherin/Rds (Poetsch et al.,2001), то было предположено, что их растворимые формы соединяют мостиками молекулы Peripherin/Rds, обнаруживаемые в соседних дисках наружного сегмента (Fig. 2G). Кроме того, cGMP-управляемый канал GARP может связывать мостиками плазматическую мембрану с Peripherin-2 олигомерами в мембранах краёв дисков (Poetsch et al.,2001). Эти результаты указывают на то, что GARPs обеспечивают морфогенез фоторецепторов, обеспечивая адгезивные взаимодействия между дисками наружных сегментов и между краями дисков с плазматической мембраной.

Organelle Distribution


Во многих клетках органеллы распределяются неслучайно в цитоплазме (rev. Chen and Chan,2006; Bornens,2008). В скелетно-мышечных клетках, напр., кластер из нескольких митохондрий накапливается ниже нейромышечного соединения (Grady et al.,2005). Сходным образом в нейронах митохондрии обнаруживаются боле часто в нервных окончаниях (Palay,1956). Органеллы фоторецепторных клеток также четко распределяются определенным образом: базальнее соединительной реснички цитоплазма фоторецептора занята плотными кластерами митохондрий (Fig. 3F). Эта часть клетки обозначается как элипсоидная. Аппарат Гольджи располагается базальнее митохондрий и апикальнее клеточного ядра (Fig. 1), и, наконец, синаптический аппарат всегда занимает самую базальную часть фоторецепторных клеток (Rodieck,1973).
Клеточное ядро значительно массивнее органелл фоторецептора и его расположение является критическим для морфологии всей клетки, а также для правильной организации клеточных слоев фоторецепторов (Fig. 4). Механизм позиционирования ядра активно анализировался в фоторецепторных клетках Drosophila. Изучение этой модели выявило, что dynein и kinesin моторные комплексы регулируют положение ядра путем оттягивания ядра в противоположных направлениях, в направлении апикального конца клетки и аксона, соотв. (Fan and Ready,1997; Whited et al.,2004). В соотв. с этими наблюдениями, мутации в кофакторе dynein, полипептиде DLis-1, также вызывают тяжелые смещения ядер фоторецепторов в базальную часть у мух (Swan et al.,1999). Помимо генов, которые кодируют компоненты моторных комплексов, активность некоторых др. генов, включая Bic-D, klarsicht, misshapen, disabled и lamin, как известно, влияет на положение ядра в клетках фоторецепторов у мух (Mosley-Bishop et al.,1999; Swan et al.,1999; Patterson et al.,2004; Houalla et al.,2005; Pramatarova et al.,2006). Два из этих генов, klarsicht и laminin, кодируют белки, ассоциированные с ядерной оболочкой. Характерным для белка Klarsicht является домен KASH: C-терминальный регион, содержащий одиночную трансмембранную гидрофобную последовательность и короткий цитоплазматический хвост приблизительно в 10-35 аминокислот (Starr and Fischer,2005). Он локализуется в ядерной оболочке и содержит обширный внеклеточный домен примерно в 2000 аминокислот. Домен KASH белков в целом участвует в позиционировании ядра в нескольких модельных системах (Starr and Han,2002; Grady et al.,2005).
Недавние эксперименты выявили, что механизмы, регулирующие положение ядра очень сходны в фоторецепторах насекомых и позвоночных (Fig. 4E). Информация получена при анализе мутантных mikre oko (mok) рыбок данио. Т.к. mokm632 мутантные фоторецепторы быстро дегенерируют (Doerre and Malicki,2001), поэтому анализ положения ядер в мутантных клетках осуществлялся на генетически мозаичной сетчатке. Было установлено, что ядра в фоторецепторах mok мутантов сильно смещены в направлении синаптического конца, иак что в наиболее крайних случаях оно локализовалось в OPL, и, по-видимому, мешало синаптической дифференцировке (Tsujikawa et al.,2007). Локус mikre oko кодирует субъединицу p150 (Dynactin 1) комплекса dynactin и является гомологом гена glued мух, иакже участвует в локализации ядер фоторецепторов (Fan and Ready,1997). Интересно, что мутанты p150 у рыбок данио и мух обнаруживают сходные С-терминальные укорочения полипептидов (Tsujikawa et al.,2007).
Сходства между фоторецепторами мух и рыб распространяются и далее. Влияние их на др. компонент Dynactin комплекса, кодируемого локусом p50 (dynactin 2) , также как и на белок Lis1, вызывает смещение к основанию ядер также у рыбок данио (Tsujikawa et al.,2007). Более того, в фоторецепторах мух и рыбок данио, позиционирования ядра обеспечивается с помощью KASH-доменовых белков, локализующихся в ядерной облочке (Fig. 4E). Эти исследования подтверждают присутствие механизма, в котором участвуют зависимые от микротрубочек мотор(ы), которые взаимодействуют с белками, закрепленными на ядерной оболочке (Tsujikawa et al.,2007).
Современная модель позиционирования ядра не лишена недостатков. Белки KASH характеризуются коротким С -концом и чрезвычайно крупной N-терминальной областью, в некоторых случаях в несколько тысяч аминокислот (rev. Wilhelmsen et al.,2006). Т.к. С-терминальная область, как известно, взаимодействует с белками Sun (rev. Worman and Gundersen,2006), а N-конец преимущественно взаимодействует непосредственно или косвенно с моторными комплексами. Отсутствие молекулярных механизмов, которые могли бы обеспечить это взаимодействие остаётся наиболее существенным недостатком этой модели.
В противоположность ядру механизмы, которые регулируют распределение др. органелл в фоторецепторах, в частности митохондрий и аппарата Гольджи, почти неизвестны. В клетках тканевых культур позиционирование Golgi также регулируется с помощью зависимых от микротрубочек моторов, dynein в частности (Harada et al.,1998; Smith et al.,2000). В то время как позиционирование Golgi в фоторецепторах не было исследовано у мутантов mok рыбок данио, мутантные Kif3a мыши обнаруживали нормальное расположение аппарата Гольджи, это говорит против участия этого специфического мотора в позиционировании Golgi (Marszalek et al.,2000). Сходным образом, пока нет доказательств участия зависимых от микротрубочек моторов в позиционировании митохондрий, хотя некоторые из этих органелл могут быть неправильно расположены у мутантов mok (Marszalek et al.,2000; Tsujikawa et al.,2007). У многих видов митохондрии формируют плотные кластеры в самой апикальной области внутреннего сегмента (Fig. 3F). Необходимо исследовать, что обеспечивает их адгезию др. с др. и каков механизм позиционирования кластеров митохондрий в специфических регионах клеток.

Synapse Formation


Синаптический аппарат является наиболее базальной характеристикой фоторецепторных клеток позвоночных (Figs. 1, 5). В ходе развития синаптические ленточки возникают из предшествующих электрон-плотных сфер в окончаниях фоторецепторов, которые меняют свою форму, чтобы сформировать незакрепленные пластинко-подобные ленточки и, наконец, созревают в ленточные синапсы (Fig. 5; Regus-Leidig et al.,2009). Сферы предшественники транспортируют белки клеточного матрикса, включая Bassoon, Piccolo, RIBEYE и RIM1 в места, где созревают обосновавшиеся ленточные синапсы (Regus-Leidig et al.,2009).
Молекулярные составляющие, определяющие ленточные синапсы становятся яснее. Поскольку ленточные синапсы являются морфологическими адаптациями обычных химических синапсов, поэтому они включают стандартные компоненты обычных синапсов вместе со специализированными белками ленточных синапсов. Кроме того, генетические и биохимические исследования содержат несколько охарактеризованных факторов, участвующих в межклеточных и с ECM контактах, в Ca2+-обеспечиваемом экзоцитозе и внутриклеточном транспорте, которые необходимы для собственно морфогенеза и функции окончаний фоторецепторов, ленточных синапсов в частности.

Ribbon proteins.


Компонентами собственно лент являются RIBEYE, Kif3a, RIM, Piccolo, Bassoon и ERC/CAST (Lenzi and von Gersdorff,2001; Sterling and Matthews,2005; tom Dieck et al.,2005; tom Dieck and Brandstatter,2006). RIBEYE является мультидоменовым белком, альтернативно транскрибируемым с локуса Ctbp2 (Schmitz et al.,2000). Нокаут RIBEYE за счёт элиминации всего локуса Ctbp2 не информативен из-за ранней летальности (Hildebrand and Soriano,2002). Однако нокдаун ribeye у рыбок данио приводит к дефектам зрения и укорочению лент фоторецепторов (Wan et al.,2005). В соответствии с этим доказательством структурной роли, взаимодействие связывания RIBEYE с Munc119 и Bassoon указывает на его каркасную функцию (tom Dieck et al.,2005; Alpadi et al.,2008). Munc119 является ассоциированным с лентами белком, важным для химической трансмиссии в синапсах. Нонсенс мутация в Munc119, которая устраняет его prenyl-связывающий домен, вызывает изменения ERG и дегенерацию фоторецепторов у мышей (Kobayashi et al.,2000). Присутствие этого домена указывает на то, что Munc119 участвует в доставке внутриклеточных мембран и белков. Munc119, как недавно было установлено, также физически взаимодействует с calmodulin-подобным, связывающим кальций белком, CaBP4 (Alpadi et al.,2008; Haeseleer,2008). Т.о., RIBEYE-Munc119-CaBP4 взаимодействия создают предположительно сигнальный комплекс, который связывает уровни внутриклеточного кальция и ассоциированных с лентами синаптических пузырьков. Как подчеркивалось выше, RIBEYE также связывается с Bassoon, белком клеточного матрикса, располагающегося в основании синаптических лент фоторецептора (tom Dieck et al.,2005). У нулевых мутантов Bassoon большинство лент свободно плавают в цитоплазме, а синаптическая передача ослаблена (Dick et al.,2003). Bassoon, также связывает ERC2/CAST1 в ленточных синапсах, это указывает на то, что он функционирует как промежуточный белок, закрепляющий ленты на пресинаптических мембранах (tom Dieck et al.,2005).

Vesicle and SNARE proteins.


Большинство белков, локализованных в пузырьках обычных синапсов (напр., synaptotagmin, synaptophysin, SV2 и Rab3a) присутствует также в пузырьках из ленточных синапсов (Lenzi and von Gersdorff,2001). Исключениями являются synapsins, которые закрепляют пузырьки на цитоскелете обычного синаптического аппарата, но отсутствуют в ленточных синапсах. Эти различия могут просто отражать ленточную структуру, которая выполняет ту же самую функцию закрепления, что и synapsins, или альтернативно уникальная необходимось в ленточных синапсах для накопления больших пулов готовых к высвобождению синаптических пузырьков, это в свою очередь вызывает необходимость с разных механизмах прикрепления (tom Dieck and Brandstatter,2006). Белки стержневого SNARE-комплекса synaptobrevin, syntaxin и SNAP-25, также присутствуют на ленточных синапсах, обеспечивая слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной.

Regulators of calcium-dependent neurotransmitter release.


На синаптических окончаниях glutamate высвобождается в качестве нейротрансмиттера за счёт кальций-зависимого экзоцитоза. Кальций проникает в синаптические окончания посредством voltage-зависимых каналов и запускает слияние glutamate-нагруженных пузырьков с пресинаптическим терминалом и высвобождение их нейротрансмиттеров в синаптическую щель. Мутации молекулярных компонентов, обеспечивающих кальций-зависимый экзоцитоз glutamate, ассоциируют с дефектами структурной функции ленточных синапсов. L-типа voltage-dependent calcium channel (VDCC) и его регулятор, CaBP4, оба располагаются на ленточных синапсах. Мыши, несущие нулевые мутации в ?1F-субъединице VDCC, обнаруживают дезорганизованные синаптические структуры и эктопические синаптические выпячивания горизонтальных и биполярных клеток в наружном ядерном слое (Mansergh et al.,2005; Chang et al.,2006a; Bayley and Morgans,2007). Соотв. нокаут VDCC ?2 субъединицы также вызывает истончение OPL, существенную потерю ленточных синапсов и аномальные ERG β-волны (Ball et al.,2002). Активность кальциевых каналов регулируется с помощью CaBP4, специфичного для фоторецепторов члена семейства calmodulin-подобных calcium-связывающих белков (Haeseleer et al.,2004). Cabp4 нулевые мутанты также имеют тонкий OPL, уменьшенные количества фоторецепторных окончаний и синаптических полос и снижение ERG α- и β-волн (Haeseleer et al.,2004). Как упоминалось выше, CaBP4 связывает Munc119, формируя потенциальную связь между регуляцией внутриклеточного кальция и экзоцитозом ленточных синапсов. Эти находки демонстрируют, что функция VDCC необходима для собственно установления и/или поддержания ленточных синапсов фоторецепторов.
RIM1 является Rab3-взаимодействующим белком, предположительно действует на поздних ступенях экзоцитоза. Он взаимодействует с Munc13-1, ERC2/CAST1 и VDCC, все они регулируют активацию синаптических пузырьков и высвобождение нейротрансмиттеров в пресинаптическую активную зону (tom Dieck and Brandstatter,2006). Munc13-1 присутствует только в компартменте активной зоны ленточных синапсов фоторецепторов, где он, скорее всего, заранее готовит пузырьки в высвобождению совместно с VDCC и ERC2/CAST1 (tom Dieck et al.,2005; tom Dieck and Brandstatter,2006).
После высвобождения нейротрансмиттеров обнаруживается уникальная потребность в synaptophysin, интегральном белке синаптических пузырьков, для формирования и рециклинга синаптических пузырьков на фоторецепторных синапсах. В большинстве синапсов нокаут synaptophysin не вызывает структурных дефектов. В фоторецепторах, однако, которые, по-видимому, лишены компенсаторного белка, нокаут synaptophysin приводит к существенной редукции количества синаптических пузырьков (Spiwoks-Becker et al.,2001).
Т.к. сигнальные механизмы, которые связаны с VDCCs, чтобы высвобождать синаптические пузырьки, более известны, то становится ясно, что компоненты кальций-зависимого высвобождения нейротрансмиттеров часто ассоциированы с развитием морфологии ленточных синапсов, и их дефекты вызывают болезни человека (see below).

Molecular motors.


Myosin Va является базирующимся на актине молекулярным мотором, участвующим в транспорте органелл и пузырьков (Tyska and Mooseker,2003). В сетчатке Myosin Va располагается преимущественно в синаптических окончаниях фоторецепторов. Разрушение мышиного Myosin Va у dilute летальных мутантов ведет к аномальным ERGs, в особенности к редукции амплитуд β-волн (Libby et al.,2004). Хотя ленты из мутантных фоторецепторов соотв. локализованы, но они часто присутствуют в аномальных "club-like" формах и лишены синаптических пузырьков, напоминая изменения в структуре лент, наблюдаемые на свету (Libby et al.,2004). Эти данные указывают на то, что миозин Va участвует в становлении или поддержании структуры ленточных синапсов.
Как упоминалось выше, зависимый от микротрубочек мотор, Kif3a, также является компонентом лент. Было предположено, что Kif3a перемещает синаптические пузырьки вдоль лент к месту высвобождения. Зависимый от условий нокаут Kif3a в фоторецепторах мыши, однако, не вызывает очевидных синаптических аномалий, хотя транспорт в наружный сегмент нарушен (Marszalek et al.,2000). Ультраструктура ленточных синапсов у мутантов Kif3a не была исследована достаточно.

Extracellular matrix.


Внеклеточный матрикс (ECM), окружающий окончания фоторецепторов, предоставляет подтверждение образования и функционирования ленточных синапсов. Критическим компонента синаптического ECM фоторецепторов является Pikachurin, dystroglycan связывающий белок, который располагается в синаптической щели ленточных синапсов (Sato et al.,2008). У нулевых pikachurin мышей дендриты биполярных клеток неспособны инвагинировать в ленточные синапсы. тогда как клеточные отростки горизонтальных клеток не затронуты (Sato et al.,2008). Аномальная морфология ленточных синапсов ассоциирована с дефектами физиологии сетчатки. Pikachurin связывает Dystroglycan, компонент Dystrophin-glycoprotein complex (DGC), который связывает внеклеточный матрикс с внутриклеточным цитоскелетом (Drenckhahn et al.,1996). В соответствии с этим, Dystrophin также локализуется в окончаниях палочек и колбочек (Drenckhahn et al.,1996). Более того, нокаут laminin ?2, ещё одного компонента внеклеточного матриква, вызывает ультраструктурные и физиологические дефекты, сходные с теми, что наблюдаются у pikachurin и dystrophin мутантов (Libby et al.,1999). Это согласуется с наблюдениями, что Dystrophins взаимодействует с Laminins посредством Dystroglycan комплекса (Talts et al.,1999). Итак, эти наблюдения указывают на то, что Dystrophin, Dystroglycan, Pikachurin и Laminin функционирует в сети. которая контролирует целостность фоторецепторных синапсов.

Endocytosis.


Т.к. ленточные синапсы обнаруживают достоверно более высокие скорости везикулярного экзоцитоза, чем обычные синапсы, то ожидается, что они характеризуют компенсаторные эндоцитотические механизмы. Недавно, мутации в эндоцитотическом белке, Synaptojanin, были ассоциированы с нарушенной архитектурой лент у мутантов nrc рыбок данио (Van Epps et al.,2004). Подобно bassoon нулевым мутантам, nrc животные обнаруживают аномальную ERG и плавающие ленточки (Van Epps et al.,2004). Кроме того, синаптические пузырьки уменьшены в количестве и аномально распределены внутри плотного цитоскелетного матрикса синаптических окончаний. Synaptojanin 1 является polyphosphoinositide phosphatase, участвующей в эндоцитозе (Van Epps et al.,2004). Пониженные количества синаптических пузырьков и эндосом, скорее всего, отражают усиленную полимеризацию актина и дефекты в эндтоцитотическом высвобождении покрытых clathrin пузырьков, ассоциированных с нарушением PI(4,5)P2 гидролиза. Функция synaptojanin в закреплении ленточных синапсов может отражать прямую потребность в метаболизме phosphoinositide или косвенный эффект, вторичный по отношению к дефектами полимеризации актина или эндоцитоза. В общем эти находки выявляют новую связь между метаболизмом phosphoinositide и морфологией лент.

Photoreceptor Morphogenesis and Disease


Удивительно, как много попыток было проделано для изучения сложных особенностей, характеризующих форфологию фоторецепторов. Необходим анализ молекулярных механизмов, которые формообразуют такие эзотерические структуры, как комплекс periciliary гребней или вырезок дисков палочек. Становится ясным, что множество механизмов, как упоминалось выше, участвуют в возникновении эффектов, которые ведут к дегенерации фоторецепторов и последующей слепоте человека. Написаны многочисленные обзоры по дегенерации фоторецепторов и ё причинах (напр., Hartong et al.,2006; Adams et al.,2007; den Hollander et al.,2008; Hildebrandt et al.,2009; Saihan et al.,2009), здесь мы только очертим наиболее очевидные взаимоотношения между специфическими морфогенетическими механизмами и потерей фоторецепторов (табл. 1).

Table 1. Photoreceptor Morphogenesis and Human Disease

 
Process                         Gene affected                        Disease                             References
Membrane polarity        CRB1             Leber congenital amurosis    (den Hollander et al.,2001)
                                                            Retinitis pigmentosa        (den Hollander et al.,1999,2004)
Transport in the IS    Rod opsina          Autosomal dominant retinitis pigmentosa       (Bessant et al.,1999)
                                   Peripherin/Rdsa            Macular dystrophy        (Nichols et al.,1993)
Transport in the
OS/ciliogenesis                   RP1             Retinitis pigmentosa        (Pierce et al.,1999)
                                          RPGR             Retinitis pigmentosa        (Meindl et al.,1996)
                                        RPGRIP             Leber Congenital Amurosis        (rev Koenekoop,2005)
                                       BBS loci             Bardet Biedl syndrome        (rev. Katsanis,2004)
                                     NPHP loci             Senior Locken syndrome        (O'Toole et al.,2006; rev. Hildebrandt, Zhou,2007)
Membrane architecture
 in the OS                   Rod opsin             Retinitis pigmentosa        (Rosenfeld et al.,1992; Kumaramanickavel et al.,1994)
                           Peripherin/Rds        Retinitis pigmentosa   (Farrar et al.,1991; Kajiwara et al.,1991; rev. Goldberg,2006)
                                      ROM-1              Retinitis pigmentosa        (Kajiwara et al.,1994)
                                     Prominin             Macular degeneration        (Yang et al.,2008)
                                   Spacemaker           Retinitis pigmentosa        (Collin et al.,2008)
Synapse formation
and maintenance        Cacna1f   Congenital stationary night blindness  (Strom et al.,1998)
                                      Munc119             Cone rod dystrophy        (Kobayashi et al.,2000)
                                      RIM1               Cone rod dystrophy        (Johnson et al.,2003; Michaelides et al.,2005)
                                   Dystrophin        Visual dysfunction  associated
                                                       with Duchenne muscular dystrophy   (Lenk et al.,1996)


a  These defects involve amino acid sequences that mediate transport to the outer segment.
Как упоминалось выше, когда изучались животные модели, гены crumbs регулируют размер апикальной поверхности фоторецепторов,как и в эпителиальных клетках (Wodarz et al.,1995; Pellikka et al.,2002; Omori and Malicki,2006). В соотв. с их анализом, мутации в одном из трех паралогов crumbs у человека, CRB1, также вызывают аномалии фоторецепторов: носители дефектов CRB1 обнаруживают несколько форм как retinitis pigmentosa , так и Leber Congenital Amaurosis (LCA; den Hollander et al.,1999,2001,2004). Необходимо отметить, однако, гены crumbs позвоночных выполняют несколько функций в сетчатке, не све ограничены фоторецепторными клетками. У рыбок данио мутанты oko meduzy (ome), которые затрагивают ген crb2a, вся сетчатка дезорганизована, скорее всего, в результате дефектов нейроэпителиальной полярности и RPE (Omori and Malicki,2006). Также у рыбок данио уменьшение размера апикальной мембраны фоторецепторов вызывается нокдауном crb2b, а не crb1 (Omori and Malicki,2006). Фенотип crb1 не выявлен у рыбок данио столь хорошо и поэтому остается возможность, что дефекты CRB1 у человека не связаны с регуляцией размера апикальной клеточной мембраны, а с функцией CRB1 в Muller глие или нейроэпителии глаза. Согласуется с этим возможность, что мутации CRB1 в сетчатке, по крайней мере, у некоторых носителей вызывают аномальное образование слоёв (Jacobson et al.,2003).
Дефекты внутриклеточного транспорта являются частой причиной потери фоторецепторов. Цитоплазматической хвост rod opsin, который направляет его в наружный сегмент, часто мутирован при аутосомно доминантном пигментном ретините. Интересно, что большинство из этих мутаций затрагивают 5 аминокислот, расположенных на самом С-конце полипептида. Эта мутационная горячая точка коррелирует с VXPX мотивом, существенным для доставки opsin (rev. Deretic,2006). Важность аминокислот С-конца подчеркивается также наблюдением, что мутации в этой области ведут к более тяжелым симптомам болезни по сравнению с дефектами в др. регионах rod opsin полипептида (Bessant et al.,1999; Berson et al.,2002).
Дефекты генов. связанных с ресничками являются одной из главных причин наследственной потери фоторецепторов. Дефекты фоторецепторов обнаруживающиеся в нарушениях ресничек могут быть обусловлены аберрантным транспортом в соединительной ресничке или структурными аномалиями наружного сегмента. Эти две возможности могут быть выявлены до некоторой степени при использовании животных моделей (Gao et al.,2002; Chang et al.,2006b; Abd-El-Barr et al.,2007; Davis et al.,2007). Поскольку реснички присутствуют повсеместно в тканях позвоночных, то многие дефекты, связанные с ресничками фоторецепторов являются синдромальными, т.е. вызывают аномалии и в др. органах. Потеря фоторецепторов обнаруживается в ассоциации с нарушениями почек, дефектами головного мозга и менее часто с ожирением. полидактилией и некоторыми др. патологиями. Наиболее распространенными формами синдромальной потери фоторецепторов. связанной с ресничками, являются Bardet-Biedl syndrome (BBS) и nephronoptisis (NPHP). Jeune, Mekel-Grueber, Alstrom, также как и др. синдромы менее частые, связанные с ресничками синдромы (rev. Adams et al.,2007). Не все формы, связанные с ресничкой фоторецепторов синдромальные. Мутации RP1 и RPGR , напр., продуцируют в основном несиндромальные патологии (Vervoort and Wright,2002; Schwartz et al.,2003).
Многие выпячивания и складки клеточной мембраны фоторецепторов нуждаются в специализированных молекулярных механизмах как для своего формирования, так и поддержания. Как упоминалось выше, два tetraspanins, Peripherin и ROM1, как полагают, облегчают образование складок мембраны наружного сегмента (rev. Goldberg,2006). Обнаружено, что оба ответственны за retinitis pigmentosa (Farrar et al.,1991; Kajiwara et al.,1991,1994). Недавно мутации в prominin 1 и ортологе у человека гена spacemaker дрозофилы оказались связанными с врожденной макулярной дегенерацией (Collin et al.,2008; Yang et al.,2008). Др. группа генов, которая может быть ассоциирована с образованием складок клеточной мембраны фоторецепторов, это та, что дает дефекты при синдроме Usher. Многие из них характеризуются трансмембранными доменами, а некоторые др., скорее всего, функционируют как каркасные факторы (Williams,2008; Saihan et al.,2009). Белок USH2A локализуется вокруг реснички (periciliary), но не в мембране реснички, указывая тем самым на роль в формировании periciliary комплекса гребней или родственных структур (Liu et al.,2007).
Наконец, т.к. синапсы фоторецепторов характеризуются многими врожденными морфологическими особенностями, не удивительно, что дефекты некоторых аспектов синаптической архитектуры приводят к потере клеток и слепоте. Миссенс мутации в dystroglycan связывающем домен в dystrophin, компоненте внеклеточного матрикса, как сообщалось, ассоциируют с ослаблением функции зрения (Lenk et al.,1996; Schmitz and Drenckhahn,1997). Эта патология может быть связана с разрывом pikachurin-dystroglycan взаимодействий в ленточных синапсах (Sato et al.,2008). Сходным образом мутации в двух белках, как полагают, участвующие в высвобождении синаптических пузырьков, Munc119 и RIM1, обнаруживаются при дистрофии колбочек-палочек (Kobayashi et al.,2000; Johnson et al.,2003; Michaelides et al.,2005). Наконец, мутации в Cacna1f, гене, кодирующем -субъединицу VDCC вызывают врожденную стационарную ночную слепоту у людей (Bech-Hansen et al.,1998; Strom et al.,1998).
Ценным замечанием является то, что генетические дефекты у человека не были обнаружены при некоторых механизмах, как известно, участвующих в потере фоторецепторов у животных моделе. Мутации IFT генов, напр., вызывают потери фоторецепторов у мышей и рыбок данио (Pazour et al.,2002; Tsujikawa and Malicki,2004; Sukumaran and Perkins,2009). В противоположность этому дефекты в гомологах этих генов человека редко описываются и хотя некоторые пациенты с синдромом Jeune обнаруживают мутацию в гене IFT80, аномалии сетчатки, по-видимому, отсутствуют у этих индивидов (Beales et al.,2007). Сходным образом мутанты с отсутствием dynactin в популяции пациентов до некоторой степени неожиданны, учитывая, что группа гипоморфных p150 мутаций дает фенотипы в основном ограниченные сетчаткой у мух и рыбок данио. Наблюдается и противоположное: мышиные мутанты по гену Usher человека не приводят к дегенерации фоторецепторов (Saihan et al.,2009). Эти наблюдения указывают на то, существуют существенные различия между животными моделями и человеком в отношении механизмов, которые регулируют морфогенез фоторецепторов.

CLOSING REMARKS


As the preceding sections of this article reveal, a wealth of information is available about quite a few aspects of photoreceptor morphogenesis. Despite that, unanswered questions abound in almost every area of photoreceptor differentiation. Some of these are quite fundamental. For example, how are opsins transported along the connecting cilium and into the outer segment? Does this process involve the IFT particle and if so does opsin bind any of the IFT proteins directly? We seem to have some information about how opsin may be added to outer segment disks, but what regulates the size of disks so that they stack parallel to each other in such a precise way is not clear. Several protein–protein interactions have been proposed to mediate adhesion between outer segment membranes but it is not obvious whether these account for all features of outer segment architecture.
The mechanism that mediates the delivery of opsins and other transmembrane proteins to the periciliary membrane is also far from being fully understood. As Rab8 alone is unlikely to mediate the fusion of opsin carrier vesicles with the target membrane, one would like to know what other proteins facilitate this event. Remarkably, once proteins are delivered to the basal body area, they do not diffuse to the rest of the inner segment membrane. The nature of the barrier that accounts for the absence of such diffusion is not known. The mechanisms that mediate organelle distribution in cell's cytoplasm are also incompletely understood. The nature of the interaction between nuclear envelope proteins and microtubule-dependent motors remains an obvious missing piece of the nuclear positioning mechanism. Finally, it is not clear what molecular processes mediate the formation of complex membrane incavitations in the photoreceptor synapse.
Answers to these questions will have to be generated through multiple parallel approaches, including biochemical tests, analysis of cell-free tissue extracts, tissue culture studies, and finally the use of animal models. These approaches are not without challenges, as photoreceptors cannot be maintained in tissue culture for prolonged periods of time, tissue extracts do not necessarily reflect in vivo conditions, and genetic studies in animal models are limited by the redundancy and pleiotropy of gene function. The latter problem is particularly acute when studying the molecular bases of ubiquitous processes, intracellular transport, or exocytosis for example, in a highly differentiated cell such as the photoreceptor. These obstacles did not, however, stop progress in the past and will not do so in the future.
Human genetic studies have been one of the most productive routes of discovery for loci involved in photoreceptor differentiation. Progress in this area has been remarkably accelerated by advances in mapping and sequencing technologies. As sequencing costs are decreasing at a breathtaking rate, human genetics will continue to be a very exciting field. Unfortunately, discovery of a disease gene does not usually contribute a lot to the understanding of its function on a cellular or molecular level; hence, the uses of animal models and biochemical approaches are of paramount importance. Human genetic studies are also biased toward loci that do not function in embryogenesis, a possible reason why IFT or dynein mutations have not been reported to cause blindness in the human population. In this regard, animal models complement human genetics very well. The mouse, Xenopus, and zebrafish are animal models that have contributed the most to the studies of the photoreceptor cell. Each of these has unique advantages, such as the ability to generate conditional knockouts in the mouse or perform genetic screens in zebrafish. It is thus to be expected that they will be fruitfully used in parallel to each other in future studies. As problems to be solved abound, we expect many exciting advances in the future.
Сайт создан в системе uCoz