Wnt белки¹ эо семейство из 19 высоко консервативных секретируемых glycoproteins, которые действуют как лиганды для рецепторами обеспечиваемых сигнальных путей, включая те, что регулируют разнообразные процессы в ходе развития^{2, 3} и у взрослых^{4, 5}. В 1996, 10 членов семейства Frizzled белков были определены как рецепторы для некоторых или всех членов семейства Wnt^{6, 7}. Белки Frizzled содержат 7 трансмембранных доменов и являются рецепторами клеточной поверхности, которые принадлежат филогенетически крупному семейству G protein-coupled receptors (GPCRs)⁸. Как это характерно для GPCRs⁹, Frizzled рецепторы обнаруживаются в гомомерных и гетеромерных комплексах с др. членами семейства Frizzled¹⁰. Недавно было установлено, что некоторые Wnt лиганды активируют рецепторные Tyr киназы ROR2 (Ref. 11) и RYK^12-14, это подтверждает гипотезу, что Wnt белки могут активировать несколько внутриклеточных сигнальных путей.

Наиболее изученным Wnt каскадом сигнальной трансдукции является путь Wnt-β-catenin. Когда этот путь действует в рамках гомеостаза, то он регулирует клеточные судьбы, пролиферацию и само-обновление стволовых и клеток предшественников в течение всей жизни метазоа. Важность пребывания в таких рамках подчеркивается доказательствами связи гиперактивной или гипоактивной передачи сигналов с различными заболеваниями^{15, 16} (Fig. 1). Исследования последних 20 лет выявили молекулярные механизмы, которые обеспечивают этот гомеостатический баланс. В частности, в отсутствие Wnt лигандов формируются комплексы деградации, которые представлены glycogen synthase kinase 3 (GSK3), casein kinase 1α (CK1α), Axin и adenomatous polyposis coli (APC). Этот белковый комплекс способствует фосфорилированию β-catenin, и это ведет к его ubiquitylation c помощью SKP1-cullin 1-F-box (SCFβ-TrCP) E3 лигазы и к его деградации c помощью 26S протеосом¹⁷. Взаимодействие Wnt лигандов с Frizzled рецепторами и Wnt ко-рецепторами снижает плотность lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) или LRP6 активирует Dishevelled цитоплазматические фосфопротеины, которые ингибируют комплекс деградации, блокируя тем самым деградацию β-catenin. β-Catenin затем накапливается в ядре соединяется с белками lymphoid enhancer-binding factor (LEF) и T cell factor (TCF) и действует как транскрипционный коактиватор, чтобы модулировать экспрессию генов мишеней (Fig. 2).

Frizzled рецепторы могут реагировать на Wnt белки в отсутствие LRP5 или LRP6, чтобы активировать независимые от β-catenin или 'non-canonical' пути. У позвоночных эти β-catenin-независимые сигнальные пути контролируют процессы, которые являются несходными, такие как planar cell polarity волосковых клеток улитки¹⁸, convergent extension movements¹⁹, формирование границ тканей²⁰ и формирование дорсо-вентрального паттена²¹ во время гаструляции (Fig. 3). В противоположность β-catenin пути, точные молекулярные детерминанты, лежащие в основе активации разных β-catenin-независимых путей, ещё предстоит определить. Как результат эти пути и процессы, которые ими контролируются, часто спорны, это подчеркивает важность дальнейших исследований механизмов, c помощью которых эти пути функционируют. Существует однако согласие, что β-catenin-независимая передача сигналов Wnt противодействует Wnt-β-catenin пути у позвоночных²². Этот антагонизм физиологически уместен при регенерации тканей⁵ и развитии конечностей²³ и для выживания родоначальников тимоцитов²⁴. Какие Wnt лиганды активирую и какие Frizzled рецепторы при физиологических условиях и могут ли все Frizzled рецепторы быть связанными как с β-catenin-зависимым, так и β-catenin-независимыми путями, остается открытым вопросом.

Исследования этих путей ускорятся, когда мы поймем как эти пути связаны с разными болезнями и мы начнем понимать, как модуляции этих путей м. иметь терапевтическое применение.

G proteins in Wnt signalling

Т.к.топология 7 трансмембранных рецепторов Frizzled напоминает таковую GPCRs, то возникает вопрос являются ли heterotrimeric G proteins, которые являются важными передатчиками GPCR сигналов, необходимыми и для передачи сигналов Wnt. В дополнение к 7 гидрофобным сегментам Frizzled рецепторы обладают и др. общими свойствами с прототипическими GPCRs, такими как предсказуемые места гликозилирования и фосфорилирования для циклической АМФ-зависимой protein kinase (PKA), protein kinase C (PKC) и casein kinase 2 (CK2). Однако рецепторы Frizzled лишены др. характеристик GPCRs, таких как консервативный Asp-Arg-Tyr мотив, который важен для соединения G белка и присутствует во второй внутриклеточной петле некоторых GPCRs. Frizzled рецепторы также лишены хорошо известного мотива Asn-Pro-X-X-Tyr (где X означает любую аминокислоту) на конце 7-го трансмембранного сегмента большинства GPCRs.

Хотя β-catenin-независимая передача сигналов Frizzled оказывается связанной с гетеротримерными G белками²⁵, отсутствие ранее подтверждающих генетических данных на Drosophila melanogaster привело многих к подозрению, что гетеротримерные G белки участвуют в передаче сигналов Wnt-β-catenin. Однако сегодня большой массив доказательств подтверждает роль G белков как в β-catenin-зависимой, так и β-catenin-независимой передаче сигналов Wnt.

Roles in β-catenin-dependent signalling. Malbon с коллегами предоставили первые доказательства связи передачи сигналов G белков с Wnt-β-catenin путём²⁶. В клетках F9 тератокарциномы активация β-catenin-зависимой транскрипции ведет к индукции судьбы primitive endoderm. Поскольку эффекты Wnt на клеточные судьбы блокируются c помощью ингибиторов из Gαi и Gαo субтипов G белков, таких как pertussis toxin и антисмысловые олигонуклеотиды, то считалось, что гетеротримерные G белки необходимы для передачи сигналов Wnt-β-catenin²⁶. недавно появились биохимические доказательства, что Frizzled рецепторы предварительно сцеплены с Gαo²⁷. В течение 5 мин после активации Frizzled, GSK3β ; быстро отсоединяется от Axin, и этот процесс коррелирует со снижением взаимодействия Gαo с Frizzled. В самом деле, при нокдауне субъединиц гетеротримерного G белка Gαo и Gαq с использованием small interfering RNA (siRNA), исследователи обнаружили, что модуляция взаимодействия между GSK3β и Axin, и возникающая в результате стабилизация β-catenin, зависят от G белков.

Широко распространенное мнение, что Frizzled рейепторы передают сигналы независимым от G белков образом, в основном базировалось на отсутствии генетических доказательств у D. melanogaster, модельного организма, в котором большинство компонентов основных путей идентифицировано. Функциональное перекрывание 6 D. melanogaster Gα субъединиц или плейотропные роли этих белков в сигнальных активностях некоторых GPCRs мух возможно препятствовали демонстрации генетического взаимодействия между G белками и Frizzled. Решая этот вопрос, Katanaev с коллегами²⁸ предоставили генетические доказательства, что гетеротримерные G белки обеспечивают сигнальную трансдукцию, которая инициируется c помощью Wnt гомолога Wingless (WG) мух, как в β-catenin, так и planar cell polarity путях. В частности, в глазах мух избыточная экспрессия Frizzled ведет к аберрантной интеграции сигналов планарной клеточной полярности, которые управляют формированием ommatidia. Экспрессия pertussis toxin супрессирует эффект избыточной экспрессии Frizzled. Это было воспринято как доказательство, что Gαo, единственный чувствительный к pertussis toxin G белок у D. melanogaster, активируется ниже Frizzled.

В согласии с потребностью в Gαo в передаче сигналов WG, hypomorphic clones из Gαo были получены в крыльях мух и было показано, что они обладают пониженной экспрессией генов мишеней для WG. Это было подтверждено c помощью экспериментов по избыточной функции, в которых Gαo избыточно экспрессировался в крыльях мух, что приводило к повышению уровней генов мишеней для WG. Элегантная демонстрация, что мутантный Gαo, предпочитающий активированное GTP-связанное состояние, может индуцировать экспрессию генов мишене1 для WG, но др. мутации, которые способствуют неактивному GDP-связанному состоянию не могут этого, указывая тем самым, что WG индуцирует обмен нуклеотидами на Gαo и что это является ключевым событием активации передачи сигналов. Это согласуется с данными, показавшими, что потеря экспрессии генов мишеней для WG в клонах Frizzled может быть восстановлена c помощью мутации αobulletGTP , но не c помощью дикого типа Gαo, указывая тем самым, что Frizzled рецепторы, подобно обычным GPCRs, действуют как guanine nucleotide-exchange factors (GEFs), чтобы катализировать замену GDP на GTP на G белках. Это необходимо для активации Wnt пути.

Более того, epistasis experiments на D. melanogaster выявили, что активация избыточности функции WG генов мишеней c помощью Gαo супрессирована в клетках, который содержат мутантный Armadillo (Arm; гомолог β-catenin у мух) или Dishevelled, или в клетках с избыточной экспрессией Shaggy (Sgg; гомологом GSK3 у мух). Эти результаты ставят активность Gαo выше Dishevelled, который, как полагали, является ближайшим белком, активируемым вследствие активации Frizzled. Если G белки являются непосредственными передатчиками активности Frizzled, то др. β-catenin-независимые процессы, которые контролируются c помощью Frizzled, такие как планарная клеточная полярность, также д. нуждаться в активности Gαo. В самом деле плоскостная полярность крыла мух нарушается в клонах с потерей или избыт ком функции Gαo²⁸. эти фенотипы напоминают потерю и избыточность функции передачи сигналов рецепторов Frizzled.

Roles in β-catenin-independent signalling. Изучение β-catenin-независимых Wnt путей у рыбок данио дало первые доказательства связи Frizzled рецепторов с передачей сигналов G белков^{25, 29}. Эти эксперименты показали, что столкновение с функцией G белков блокирует изменения притока Ca²⁺, которое происходитв ответ на Wnt5a или frizzled 2 у эмбрионов рыбок данио²⁵. Последующие исследования показали, что Wnt5A активация Ca²⁺-регулируемых белков Ca²⁺/calmodulin-зависимой protein kinase II (CaMKII), PKC и nuclear factor of activated T cells (NFAT) в разных системах зависит от G белков^30-37.

У эмбрионов позвоночных активация Wnt лиганда при β-catenin-независимой передаче сигналов затрагивает клеточные движения при конвергентном вытягивании (convergent extension), которое необходимо во время gastrulation для собственно элонгации вдоль передне-задней оси тела. Наиболее заметны у рыбок данио аллели двух Wnt генов, pipetail (ppt; также известный как wnt5b)³⁸ и silberblick (slb; также известный как wnt11)¹⁹, вызывающие дефекты движений конвергентного удлинения, которые возникают в результате неправильных перемещений мезодермальных клеток у эмбрионов во время гаструляции. У эмбрионов Xenopus laevis инъекции РНК, которая кодирует доминантно-негативную форму Wnt11 в дорсальной маргинальной зоне, ключевой зоне эмбриона, участвующей в организации оси, также вызывают дефекты движений конвергентного удлинения³⁹. Когда дорсальная маргинальная зона изолирована хирургически и культивируется in vitro, то так наз. Keller эксплант всё ещё подвергается движениям конвергентного удлинения, которые приводят к элонгации экспланта. Интересно, что frizzled 7 и β γ-субъединицы гетеротримерных G белков необходимы для этого процесса⁴⁰.

В свете недавней находки, что эти β γ-субъединицы присутствуют в одном и том же белковом комплексе как Dishevelled белки в клетках позвоночных⁴¹, можно предположить, что они высвобождаются вследствие активации G белка c помощью Frizzled рецепторов и что они регулируют Dishevelled. Если это имеет достаточные основания, то передача сигналов Frizzled может напоминать передачу сигналов c помощью рецепторов pheromone у дрожжей, у которых большинство клеточных функиций является результатом активации эффекторов c помощью β γ-субъединиц G белков, а не c помощью α-субъединицы⁴². Однако некоторые сообщения описывают модуляцию вторичных мессенджеров c помощью α-субъединиц^{43, 44} при β-catenin-независимой передаче сигналов Frizzled. Интересно, может ли передача сигналов c помощью рецепторов Smoothened (Smo) семейства (которые являются гомологами Frizzled рецепторов) в пути Hedgehog также использовать гетеротримерные G белки, пока это спорно^{45, 46}. Генетические доказательства, полученные на D. melanogaster недавно, были посвящены этому вопросу⁴⁷. В случае Smo, классическое ингибирование продукции цАМФ, обеспечиваемое c помощью Gαi белка, наблюдалось в ответ на активацию пути Hedgehog.

Signalling by Frizzled-LRP complexes

Одним из наименее понятных аспектов передачи сигналов Wnt, это как активация Frizzled-LRP5 или Frizzed-LRP6 рецепторных комплексов ведет к ингибированию аппарата деградации β-catenin. Хотя большинство исследователей согласны, что это нуждается в активации Dishevelled фосфопротеинов, но как Dishevelled активируются и как это противодействует действию комплексов деградации β-cateninслабо изученным. Мы знаем, однако, что следствием событий, которые инициируются c помощью Wnt белков, являются изменения во взаимодействии между Frizzled рецепторами и LRP5 или LRP6 ко-рецепторами, в рекрутировании Dishevelled и Axin на Frizzled-содержащие и LRP5- или LRP6-содержащие signalosomes (или агрегаты), и в активации цитоплазматической передачи сигналов.

Lateral signalling between Frizzled and LRPs. Хотя Frizzled рецепторы, по-видимому, достаточны для связывания Wnt, генетические эксперименты на D. melanogaster и мышах показали, что полная функциональная передача сигналов Wnt нуждается в функции Arrow у D. melanogaster⁴⁸ и LRP5 или LRP6 у позвоночных⁴⁹. Последующие биохимические эксперименты показали, что помимо Frizzled рецепторов, Wnt лиганды соединяются с N-концом LRP рецепторов и могут индуцировать или стбилизировать образование Frizzled-LRP-Wnt трехсоставных комплексов⁴⁹. Биохимические и генетические эпистатические эксперименты помещают активность LRP5 и Arrow ниже Wnt, но выше цитоплазматических компонентов Dishevelled и β-catenin, это согласуется с функционированием LRP5 и Arrow на плазматической мембране. Итак, эти данные строго указывают на то, что Frizzled и LRP рецепторы формируют сигнальные комплексы, которые ведут к стабилизации β-catenin.

Recruitment of Axin to LRP co-receptors. Предположение, что Axin соединяется с С-терминальным доменом LRP5 ко-рецептора и что Wnt белки возможно способствуют этому взаимодействию, показывает как передача сигналов Wnt инициируется в цитоплазме⁵⁰. Наглядно fluorescent resonance energy transfer (FRET) установил, что пул молекул Axin рекрутируется на LRP5 хвосты в течение 4-х мин. после активации Frizzled рецепторов. Рекрутирование Axin хотя и важно для передачи сигналов но недостаточно для максимальной сигнальной эффективности, это указывает на то, что возможно необходимы др. белки или процессы. Возможно, что стабильность Axin, как и в случае β-catenin, регулируется c помощью передачи сигналов Wnt^{51, 52}, но не все исследования подтверждают это мнение.

Механистически рекрутирование Axin на LRP ко-рецептор обеспечивается c помощью 5 Pro-Pro-Ser-Pro повторов, которые присутствуют в цитоплазматических доменах LRP5 и LRP6 (Ref. 53). Этот домен достаточен для активации пути передачи сигналов Wnt, как показано c помощью анализа мутаций в этих повторах и c помощью транспозиции одиночного Pro-Pro-Ser-Pro мотива с LRP5 ко-рецептора на рецептор низкой плотности липопротеина, это не обеспечивало передачи сигналов Wnt. Мотив Pro-Pro-Ser-Pro обеспечивает активность по передаче сигналов Wnt к химерному рецептору в подходе по удвоению оси у X. laevis и в LEF и TCF luciferase reporter опытах в культуре клеток⁵³. Мутационный анализ всех пяти Pro-Pro-Ser-Pro мотивов в полной длины LRP6 ко-рецепторе показал, что, по крайней мере, эти мотивы необходимы для полной индукции β-catenin⁵⁴. Кластеры остатков Ser и Thr, которые содержат Pro-Pro-Ser-Pro мотивы в своей сердцевине, фосфорилируются Wnt-зависимым способом и предоставляют места установки для связывания Axin⁵³. Это указывает на то, что в нормальном клеточном контексте рекрутирование Axin на LRP5 или LRP6 ко-рецептор нуждается в высоком сродстве связывания, возможно предоставляемым за счет стимулированного Wnt фосфорилирования в LRP доменов Pro-Pro-Ser-Pro. Эти находки подтверждают также существование киназ и возможно фосфатаз, которые регулируют Wnt-зависимое фосфорилирование C-терминальных концов LRP5 или LRP6 ко-рецепторов.

В подтверждение этого мнения, CK1γ ⁵⁵ и GSK3β ⁵⁶ были идентифицированы как киназы, которые участвуют в фосфорилировании LRP5 и LRP6 ко-рецепторов. GSK3β фосфорилирует LRP5 или LRP6 ко-рецептор зависимым от Wnt способом. В клетках D. melanogaster и позвоночных закрепленная на мембране CK1γ протеин киназа также функционирует на уровне LRP5 or LRP6 ко-рецепторов⁵⁵. Места фосфорилирования c помощью CK1γ выше и ниже мотиов Pro-Pro-Ser-Pro важны для максимальной сигнальной активности LRP5 и LRP6 ко-рецепторов. Одним из важных отличий и кажущимся нерешенным вопросом в эти х двух исследованиях является динамика фосфорилирования Ser остатков в этих доменах. Zhen et al.⁵⁶ полагают, что GSK3β фосфорилирует эти мотивы Wnt-зависимым способом, тогда как Davidson et al.⁵⁵ показали, что этот сайт конституитивно фосфорилируется и что состояние фосфорилирования не изменяется в ответ на стимуляцию Wnt.

Тем не менее это исследование подтвердило рабочую модель, согласно которой GSK3β- и CK1γ-зависимое фосфорилирование в LRP5 или LRP6 C-терминальном домене создает сигнал высокого сродства для рекрутирования Axin (Fig. 4). Поскольку Axin, как полагают, присутствует в клетках на очень низких уровнях, его секвестрация c помощью LRP5 или LRP6 д. конкурировать с его функцией в комплексе деградации β-catenin, активируя тем самым ядерные функции β-catenin. Эти исследования также выявили позитивную функцию для GSK3β в Wnt сигнальной трансдукции, роль котрая была замаскирована сильной негативной регуляторной ролью, которую GSK3β выполняет в комплексе деградации β-catenin.

Dishevelled in Wnt-mediated phosphorylation of LRPs. Dishevelled является точкой молекулярного ветвления, в которой передача сигналов Frizzled соединяется или в β-catenin-зависимым или β-catenin-независимым путями. В соответствии с этим epistasis эксперименты показали, что белки Dishevelled являются своего рода первыми белками, активируемыми c помощью Wnt на цитоплазматической стороне плазматической мембраны⁵⁷. В Wnt-β-catenin пути, Dishevelled может инактивировать комплексы деградации β-catenin посредством своей ассоциации с Axin^{58, 59}. Dishevelled может также участвовать в Wnt-обеспечиваемом фосфорилировании LRP5 или LRP6 ко-рецепторов⁶⁰ (Fig. 4). Нокдаун Dishevelled с использованием siRNA у D. melanogaster⁶¹ блокирует Wnt-зависимое фосфорилирование LRP6. Сходные результаты были получены на клетках мышей, в которых все три гена Dishevelled нокаутированы с использованием siRNAs⁶¹ и на клетках, полученных от Dsh1 и Dsh2 двойных нокаутных мышей, у которых экспрессия Dsh3 послана в нокдаун с использованием малых шпилечных РНК⁶⁰. Одна из гипотез заключается в том, что в ответ на Wnt лиганды, Dishevelled рекрутируется на Frizzled рецепторы и способствует совместному рекрутированию Axin-GSK3β комплекса, ступени, которая может быть важной для достижения максимального фосфорилирования LRP6 c помощью GSK3β (Fig. 4).

итак, эти результаты указывают на то, что Dishevelled, Axin и GSK3β необхолдимы для Wnt-обеспечиваемого фосфорилирования LRP6. Поскольку Axin ассоциирован с фосфорилированным хвостом LRP6, то эта модель совместима с петлей позитивной регуляции, которая необходима для амплификации сигнала и возможно необходима для устойчивой активации пути в условиях постоянного присутствия внеклеточного Wnt (Fig. 4).

Wnt-induced formation of LRP6 signalosomes. Потребность в белках Dishevelled для Wnt-зависимого фосфорилирования LRP5 или LRP6, описанная выше, указывает на то, что Dishevelled функционируют выше LRP5 и LRP6 в β-catenin пути, а не ниже, как предполагалось, исходя из фенотипов с избыточной их функцией. Как же Dishevelled и др. белки пути способствуют фосфорилированию LRP5 или LRP6, индуцируя тем самым рекрутирование? Real-time imaging эксперименты на клетках, экспрессирующих разные green fluorescent белки, которые имеют разные длины волн возбуждения, слитые с LRP6 ко-рецептором и с Axin, предоставили новую информацию об этом процессе⁶¹. В состоянии покоя Axin располагается в виде точечных структур в клетках, тогда как LRP6 униформно распределен по всей плазматической мембране. В течение 15 мин после стимуляции Wnt белками, LRP6 агрегирует в ассоциированные с мембраной кластеры, которые колокализуются с Axin. Using animal caps из эмбрионов X. laevis и клетки млекопитающих, Bilic et al.⁶¹ далее показали, что эти Wnt-индуцированные сигналосомы содержат фосфорилированные LRP6, Dishevelled и др. ближайшие члены пути Wnt, такие как Frizzled рецепторы и GSK3β . Интересно, что белки Dishevelled, как было показано ранее формируют динамические агрегаты⁶² и рекрутируются на плазматическую мембрану вследствие экспозиции Wnt возможно благодаря прямому взаимодействию с Frizzled рецепторами⁶³.

Т.о., уместна модель, согласно которой Wnt способствует формированию Frizzled-LRP5 или Dishevelled-LRP6 агрегатов и дальнейшему рекрутированию GSK3β и CK1γ для фосфорилирования доменов Pro-Pro-Ser-Pro в LRP6 и LRP5, это создает высокой плотности платформы для рекрутирования Axin. Остается множество вопросов об этой модели сигналосом. Напр., всё ещё неясно, как сигналосомы транслируют количественные различия в уровнях внеклеточных Wnt белков в пропорциональные уровни внутриклеточного β-catenin. Регулируется ли это c помощью степени фосфорилирования LRP5 или LRP6 и c помощью количеств Axin, которые рекрутируются в сигналосомы? Контролируется ли это c помощью регуляции активностей GSK3β и CK1γ киназ в сигналосомах? Находят ли специфические протеин фосфатазы фосфорилированные LRP5 или LRP6, чтобы деактивировать передачу сигналов? Как Axin высвобождается из комплекса деградации и рекрутируется на LRP5 или LRP6? Наконец, насколько динамичной является сборка и разборка сигналосом и как это регулируется?

Non-Frizzled receptors for Wnt

До недавнего времени большинство известных эффектов передачи сигналов Wnt относили к активации Frizzled рецепторов. Идентификация Wnt-связывающего богатого Cys домена в Ror2 (Ref. 64) и модуля Wnt-ингибирующего фактора в Ryk⁶⁵ открывает интригующую возможность, что Wnt могут передаваться посредством этих non-Frizzled рецепторов. В ряде исследований было установлено, что эти рецепторы являются и в самом деле настоящими (bona fide) рецепторами для Wnt лигандов и что они негативно и позитивно регулируют разные аспекты передачи сигналов Wnt, чтобы модулировать разные биологические процессы (Fig. 5).

ROR2 transduces Wnt signals. Hikasa et al.¹¹ идентифицировали ROR2 при поиске генов, которые дифференциально регулируются специфичным для дорсального организатора homeodomain protein LIM homeobox protein 1 (LIM1; также известным как LHX1) в плюрипотентных X. laevis анимальных шапочках. Эксперименты по избыточной экспрессии показали, что Ror2 ингибирует клеточные движения для конвергентного удлинения дорсальной мезодермы и нейроэктодермы, процесса, который регулируется не-каноническими Wnt путями. разные Wnt белки взаимодействуют с Cys-богатым эктодоменомRor2. Интересно, что две мутации Ror2, которые блокируют киназную активность, также эффективно нарушают движения конвергентного удлинения, это указывает на то, что каталитическая активность киназного домена может быть несущественной для этой Wnt-зависимой функции ROR2.

Функциональное взаимодействие между CAM-1 (у Caenorhabditis elegans гомологом Ror белков) и членом семейства Wnt EGL-20 (Ref. 66) предоставляет генетические доказательтсва, что эта сигнальная система законсервирована в ходе эволюции. интересно, что CAM-1, без цитоплазматического домена, может полностью устранять дефекты миграции, наблюдаемые у cam-1 мутантов, это указывает на то, что Tyr киназная активность гомолога Ror белка может быть несущественной в этом контексте.

Дополнительные доказательства связи Ror2 с передачей сигналов Wnt получены в исследованиях на мышах, у которых паттерны экспрессии и фенотипы потери функции Ror2 сходны с таковыми у мутантов Wnt5a⁶⁷. Эта функциональная связь подтверждается в экспериментах in vitro, показывая, что Wnt5a взаимодействует с Ror2 и что эти два белка синергично активируют JUN N-terminal kinase (JNK) в культивируемых клетках⁶⁸. Работа с X. laevis далее охарактеризовала Wnt5a-Ror2-JNK пруть⁶⁹. У X. laevis, Wnt5a и Ror2 активируют JNK путь и регулируют экспрессию paraxial protocadherin (papc), гена, который координирует полярность клеток во время морфогенетических движений⁷⁰. Нокдаун WNT5A, ROR2 или JNK фенокопирует дефекты клеточного поведения, которые ассоциируют со снижением функции PAPC. Напротив, Wnt5a увеличивает активность JNK и ведет к усилению экспрессии papc Jun- и activating transcription factor 2 (ATF2)-зависимым образом. Следовательно, Tyr киназная активность Ror2 важна для усиления экспрессии papc c помощью Wnt5a

Представленные выше исследования демонстрируют роль Ror2 в β-catenin-независимой передаче сигналов. Как обсуждалось выше, установлена роль для не-канонических Wnt лигандов, которая заключается в противодействии передаче β-catenin сигналов. Были предложены разные механизмы, чтобы объяснить, как не-каноническая передача сигналов Wnt может осуществлять это действие^{23, 71, 72}, но отсутствует консенсус. В согласии с ролью Ror2 в противодействии передачи β-catenin сигналов, способность Wnt5a блокировать Wnt3a-зависимую активацию β-catenin передачи сигналов значительно усиливается в HEK293 клетках человека, которые стабильно экспрессируют мышиный Ror2 (Ref. 73). В подтверждение этому, Wnt5a оказывает незначительный эффект на WNT3A активацию β-catenin-зависимого luciferase репортера в L клеточной линии мышей, в которой уровни транскриптов Ror2 были в 700 раз ниже, чем в клетках HEK293. Если Ror2 избыточно экспрессировался в L клетках, то Wnt5a сильнро ингибировал Wnt3a-обусловленную активацию того же самого репортера. Важно в этом контексте, что Ror2-TM (конструкция, которая содержит только внеклеточный и трансмембранные домены Ror2) ингибирует способность дикого типа Ror2 усиливать передачу сигналов Wnt5a, это указывает на то, что соединение Wnt5a с Ror2 , по-видимому, задействувет цитоплазматический сигнальный каскад⁷³.

В исследовании Mikels et al.⁷³, передача сигналов Wnt5a посредством β-catenin-независимого пути изменялась на β-catenin-зависимый путь путем избыточной экспрессии frizzled 4 и LRP5, и этот эффект возвращался за счет избыточной экспрессии Ror2. В этом примере репертуар и уровни экспрессии рецепторов для Wnt и Wnt лигандов в данной клетке скорее, чем специфичность комбинации Wnt-рецептор, может управлять специфичностью сигнальных событий. Это интересная концепция, которая заслуживает дальнейшей проверки, особенно в отношении эндогенной экспрессии рецепторов и Wnt белков. Зависимая от клеточного контекста модуляция передачи сигналов Wnt^{74, 75} также, по-видимому, важна для детерминации будет ли активирован β-catenin-зависимый или β-catenin-независимый путь. Поэтому необходима осторожность при заключении, что определенные Wnt или Frizzled белки активируют специфические пути⁷⁶.

RYK transduces Wnt signals. Белок Ryk является атипичным Tyr киназным рецептором с дивергентным киназным доменом, который как полагают стер (obliterate) свою киназную активность⁷⁷. D. melanogaster Ryk гомолог Derailed (Drl) является guidance рецептором, который экспрессируется в ростовых конусах и аксонах commissural neurons, и необходим для ведения их по мере их роста поперек срединной линии в ЦНС, чтобы соединить обе половинки организма. Доступны два основных маршрута миграции: передняя и задняя комиссуры. Drl необходим для выбора переднего маршрута, поскольку аксоны неустойчиво пересекают заднюю комиссуру у drl мутантных мух. Поскольку Drl специфически экспрессируется на нейронах, выбирающих передний маршрут, было предсказано, что Drl действует как рецептор для репеллентных сигналов, присутствующих в задней комиссуре⁷⁸. Важно, что неправильная экспрессия Drl на нейронах, которые, как известно идут в направлении заднего маршрута перенаправляет их по переднему пути. Используя подход с неправильной экспрессией , Yoshikawa et al.¹² провели генетический скрининг супрессоров, чтобы идентифицировать мутации, при которых аксоны переключаются обратно на задние комиссуры у мутантов с избыточной экспрессиией DRL. Неожиданно, wnt5a оказался единственным геном, который будучи мутантен доминантно супрессирует фенотип неправильной экспрессии Drl и переключает выбор комиссур.

Мутации с потерей функции показали, что WNT5A участвует в наведении аксонов. Drl физически ассоциирует с Wnt5A и действует Frizzled- и Dishevelled-независимым образом, это указывает на то, что он трансдуцирует сигналы посредством своего собственного сигнального каскада. Интересно, что избыточная экспрессия Drl, у которого отсутствует C-терминальный домен, неспособна направлять неправильно аксоны по переднему пути, указывая тем самым, что даже с предположительно dead киназным доменом, Drl может участвовать в пути цитоплазматической передачи сигналов, возможно благодаря рекрутированию Src семейства Tyr киназ⁷⁹.

У C. elegans Ryk гомолог LIN-18 взаимодействует с Wnt гомологом MOM-2 и действует совместно с Frizzled и Wnt гомологами LIN-17 и LIN-44, соотв., при спецификации судеб клеток во время развития вульвы¹⁴. И снова полагают. что Ryk гомолог не действует как Wnt ко-рецептор в этом контексте. В самом деле lin-17 и lin-18 двойные мутанты обнаруживают более строгий фенотип, чем одиночные мутации, это указывает на то, что они действуют независимо и не в одном и том же сигнальном каскаде.

В клетках HEK293T Ryk физически взаимодействует с Wnt1 и Wnt3a13. Избыток и потеря функции RYK в этих клетках показывает, что Ryk необходим для Wnt-обеспечиваемой активации β-catenin-TCF luciferase репортера. Здесь механизм передачи сигналов Ryk по-видимому, отличается от такового у D. melanogaster и C. elegans. В самом деле, ко-иммунопреципитация указывает на то, что Wnt, Frizzled и Ryk белки формируют трехсоставной комплекс. Более того, Dishevelled белки ко-иммунопреципитируют с Ryk в клетках позвоночных, в результате взаимодействия, которое, по-видимому, происходит между PDZ доменом Dishevelled и C-терминальным хвостом Ryk, который содержит последовательности PDZ лиганда. Т.о., Ryk и физически и функционально сцеплен с компонентами пути Wnt.

Механизмы передачи сигналов Ryk становятся яснее и более неожиданными. Недавние исследования по иммунолокализации показали, что существует связь между ядерной локализацией Ryk и дифференцировкой нейронов⁸⁰. Дальнейшие эксперименты показали, что Ryk расщепляется по своему трансмембранному региону. частично с помощью gamma-secretase и/или presenilin, в результате высвобождается C-терминальный протеолитический фрагмент, который может транслоцироваться в ядро. Интересно, что Wnt3a способствует ядерной транслокации внутриклеточного домена RYK скорее, чем влияет на это расщепление. Механизмы, с помощью которых Wnt3A могут индуцировать ядерную транслокацию внутриклеточного домена Ryk и как отщепившийся фрагмент запускает транскрипционный аппарат, чтобы регулировать дифференцировку нейронов еще неизвестны. Эта роль передачи сигналов Wnt3A-Ryk в дифференцировке кортикальных нейронов контрастирует с хорошо охарактеризованной ролью передачи сигналов Wnt-β-catenin в контроле обновления нейральных предшественников^{81, 82}. Скоординрованность интеграции и регуляции этих двух Wnt путей может быть критической для нейрального развития.

Primary cilia in Wnt signalling

первичные реснички являются неподвижными, базирующимися на микротрубочках органеллами, которые выступают из плазматической мембраны почти каждой эукариотической клетки и воспринимают внеклеточные молекулы и механические силы⁸³. Важность этих структур выясняется при дефектах в сборке ресничек или функции, которая ведет к бесплодию⁸⁴, реверсии расположения органов (situs inversus), образованию множественных пальцев (polydactyly), поликистозной болезни почек (PKD)^85-87 и Bardet-Biedl syndrome (BBS)⁸⁸. Участие первичных ресничек в путях сигнальной трансдукции становится всё яснее, особенно в отношении пути Hedgehog⁸⁹.

Первым намёком, что реснички важны для передачи сигналов Wnt получены в результате наблюдений, что почки от inversin нокаутных мышей имеют фенотип, которые напоминает таковой у мышей с нарушением передачи сигналов Wnt-β-catenin ⁹⁰. Inversin мутантный при nephronophthisis (аутосмно рецессивное кистозная болезнь почек) и локализованный в первичных ресничках и basal bodies⁹¹. Функционально, inversin, по-видимому, действует как негативный регулятор передачи сигналов Wnt-β-catenin на уровне Dishevelled⁹⁰, v может функционировать как молекулярный переключатель, который контролирует баланс между канонической и неканонической передачей сигналов во время морфогенеза почечных канальцев. В этом процессе передача сигналов β-catenin регулирует клеточную пролиферацию, тогда как неканоническая передача сигналов модулирует корректную ориентацию и элонгацию клеток во время образования канальцев.

Интересно, что некоторые Bbs белки, которые локализуются в первичных ресничках и базальных тельцах⁸⁸ кооперируют с неканонической передачей Wnt сигналов при планарной клеточной полярности⁹² и тканевом морфогенезе. Более того, Bbs1 и Bbs6 взаимодействуют генетически и функционально с vang-like protein 2 (VANGL2) у мышей и рыбок данио⁹². Поскольку Vangl2 функционирует в β-catenin-независимых, Frizzled-обусловленных процессах у позвоночных и на путях планарной клеточной полярности у D. melanogaster, то имеющиеся доказательства указывают на то, что BBS играют роль в β-catenin-независимой передаче Frizzled сигналов. Белки Bbs необходимы для собственно движений конвергентного вытягивания во время гаструляции у рыбок данио, это снова указывает на то, что Bbs белки и неканонические Wnt белки участвуют в сходных процессах⁹³. Важно, что потеря функции Bbs белков ведет к незначительному увеличению базовой Wnt-β-catenin передачи сигналов и к заметному потенциированию Wnt-стимулируемой реакции⁹³.

Дальнейшие исследования показали постоянное накопление β-catenin и Dishevelled в клетках после нокдауна Bbs белков или специфичного для аксонем kinesin motor protein Kif3A93. Сходная роль ресничек описана в негативно регулируемой Wnt-β-catenin передаче сигналов у эмбрионов мышей⁹⁴ и в исследованиях гена irrc6 (который кодирует seahorse белок) у рыбок данио⁹⁵. Seahorse участвует во многих процессах в ресничках у рыбок данио, таких как установление лево-правосторонней асимметрии и в предупреждении почечных кист . Деплеция этого белка у эмбрионов рыбок данио ведет к эктопической активации Wnt-β-catenin пути и к легким дефектам гаструляции, это указывает на то, что он может ограничивать передачу сигналов β-catenin и является важным для неканонической передачи сигналов. Недавно было установлено непосредственное участие Dishevelled белков в биологии ресничек путем регуляции апикального закрепления базальных телец в клетках с множественными ресничками⁹⁶. Итак, эти и др. исследования указывают на то, что базальные тельца и реснички предпочтительны и необходимы для β-catenin-независимой ветви передачи сигналов Wnt, тогда как они негативно влияют на Wnt-β-catenin-зависимую ветвь передачи сигналов (Fig. 6).

Conclusion and perspectives

Members of the Frizzled family of receptors, as well as the receptor Tyr kinases Ror2 and Ryk, function to transduce secreted Wnt signals and thereby activate β-catenin-dependent and β-catenin-independent signalling pathways. Given that specific Wnt or Frizzled proteins can lead to activation of either pathway, it is increasingly clear that the cellular context of the receptors strongly influences the signalling outcome.

With the use of genome-wide functional screens, such as siRNA97, 98, 99, and the use of mass spectrometry for the identification of protein complexes41, 100 together with the ability to integrate data from these independent screening platforms98, we can now identify both conserved core components of signalling pathways as well as cell- and context-dependent modifiers. Such studies are expanding our understanding of the balance between activation of β-catenin-dependent and β-catenin-independent Wnt pathways, as well as identifying new disease links and new challenges for the field. In terms of furthering our understanding of Wnt signalling networks, a major challenge is to complete genome-wide siRNA screens and to integrate these results with protein interaction networks for several cell types, with and without stimulation by ligands, to begin to understand how Wnt signalling is altered by context-dependent modifiers. A related challenge is to identify how Wnt signalling integrates with other signalling pathways, including the Notch and fibroblast growth factor pathways, to form signalling networks, and how these regulate both transcriptional and non-transcriptional responses. Whereas advanced proteomic and high-throughput screening techniques, and the bioinformatics tools needed to extract useful information from the large data sets, are quickly becoming indispensable tools for all signal transduction research, another challenge is to establish protein interactions and localization in real time during signalling.

Proximal events in Wnt signal transductionStephane Angers & Randall T. Moon Nature Reviews Molecular Cell Biology, vol. 10/№7, P. 468-477 | doi:10.1038/nrm2717 Article

Proximal events in Wnt signal transduction
Stephane Angers & Randall T. Moon
Nature Reviews Molecular Cell Biology, vol. 10/№7, P. 468-477 | doi:10.1038/nrm2717 Article