Одним из наиболее поразительных случаев контроля с помощью ubiquitin и SUMO является proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Этот гомотримерный, кольцеобразный белок, который охватывает кольцом ДНК действует как фактор преобразования для DNA polymerases и как подвижная платформа для факторов, которые обеспечивают связанные с репликацией функции ( такие как сборка хроматина или слипание сестринских хроматид)²⁷. Удивительно, PCNA может быть модифицирована по тому же самому консервативному лизиновому остатку (Lys 164) или с помощью monoubiquitylation, Lys-63-сцепленной polyubiquitin цепочки или SUMO (ref. 28) (Fig. 3). И ubiquitylation и SUMOylation PCNA происходят в S фазе, но ubiquitylation специфически происходит, когда ДНК повреждена. Неожиданно, около половины известных генов RAD6 DNA-damage-tolerance пути у дрожжей кодируют энзимы, которые катализируют убиквитилирование PCNA. Среди них, Rad18 и Rad5 являются E3 ubiquitin лигазами RING-finger класса²⁹. Rad6 сам является обычным E2 ubiquitin-conjugating энзимом³⁰, тогда как Ubc13 и Mms2 (последний лишен active-site cysteine остатка) формируют гетеродимерную E2 с уникальным свойством катализа прикрепления Lys-63-сцепленных polyubiquitin цепочек. Rad6 и Rad18 катализируют PCNA monoubiquitylation, тогда как Ubc13/Mms2 и Rad5 необходимы для расширенной модификации с помощью Lys-63-сцепленной polyubiquitin цепи. Две лигазы, Rad18 и Rad5, могут гетеродимеризоваться и обе непосредственно соединяются с PCNA^{28, 29}.

Во время S фазы поврежденная ДНК может вызывать остановку репликационной вилки, это в свою очередь генерирует однонитчатые сегменты ДНК. Они в дальнейшем покрываются с помощью гетеротримерного RPA белка. RPA затем рекрутирует Rad18 на эти сайты³¹ благодаря сродству Rad18 с PCNA и Rad6, моноубиквитилируя PCNA по его Lys 164 остатку²⁸. PCNA monoubiquitylation обеспечивает translesion synthesis (TLS), т.е. синтез ДНК через поврежденное место. TLS катализируется с помощью набора специфических полимераз, которые могут приспосабливаться к различным крупным повреждениям в своих активных участках³². Благодаря этому свойству, TLS polymerases являются склонными к ошибкам и могут также вставлять некорректные нуклеотиды, делая TLS мутагенным. Удивительно, что некоторые TLS polymerases имеют ubiquitin-связывающие мотивы (напр., UBM и UBZ домены), которые позволяют им взаимодействовать более специфически с monoubiquitylated PCNA^{33, 34}. Polyubiquitylation может происходить, если TLS терпит неудачу (вообще-то в зависимости от повреждения) и ведет к связанному с рекомбинацией лишенному ошибок обходу. В точности как этот путь действует и может ли polyubiquitylated PCNA рекрутировать специфический фактор пока неизвестно.

Дрожжевой PCNA также может быть SUMOylated по Lys 164 и в меньшей степени по Lys 127 (ref. 28). Оба лизиновых остатка располагаются на наружном крае кольцеобразной молекулы, вдали от охватываемой ДНК. SUMOylated PCNA специфически рекрутирует Srs2, helicase-подобный энзим, который удаляет recombinase Rad51 с хроматина^{35, 36}. Этот механизм может содействовать репликации путем предупреждения нежелательной рекомбинации между вновь образующимися сестринскрими хроматидами. Отметим, что Srs2 может соединяться с PCNA непосредственно, но благодаря C-терминальному SUMO-interacting domain (SIM), он соединяется с SUMOylated PCNA со значительно более высоким сродством^{35, 36}. Второе место SUMOylation, Lys 127, расположено непосредственно в связывающем кармане для большинства белков, взаимодействующих с PCNA (PIP-box белки)²⁸. Т.о., Lys 127 SUMOylation (и в меньшей степени Lys 164 SUMOylation). по-видимому, предупреждает взаимодействие с белками, которые соединяются с этим карманом посредством своих PIP боксов²⁷. Одни из таких факторов является Eco1, который соединяется с PCNA посредством PIP-box и обеспечивает слипчивость сестринских хроматид в S фазе³⁷. Неожиданно, Eco1 соединение с PCNA предупреждается не только с помощью PCNA SUMOylation, но и также с помощью соединения Ubc9 сPCNA³⁷. Эти находки подтверждают 'reset button' модель. согласно которой соединение Ubc9 с PCNA, сопровождаемое PCNA SUMOylation, может 'сбрасывать' PIP-box белки с PCNA, делая возможным новое присоединение др. PIP-box белков, как только PCNA оказывается de-SUMOylated²⁷.

Поскольку Lys 164 в PCNA является мишенью для ubiquitin и SUMO, эти два модификатора конкурируют за субстрат. Удивительно, Ubc9 также физически взаимодействует с Rad18 и Rad5 (ref. 28), указывая тем самым, что энзимы являются частью ubiquitin-SUMO распределительного щита и что PCNA ubiquitylation и SUMOylation могут действовать вместе во время репликации. Теоретически возможно, хотя и довольно спекулятивно, что индивидуальные субъединицы гомотримерного белка могут быть модифицированы разными модификаторами, чтобы регулировать события ступенчатообразно²⁷.

В случаях, описанных выше, ubiquitin и SUMO может или привлекать белок (TLS polymerases, Srs2) или отталкивать фактор связывания (Eco1). Примером того, как SUMO может непосредственно влиять на свой субстрат служит путь base-excision-repair (BER) . BER избирательно устраняя повреждения ДНК, которые возникают обычно в её основаниях путём alkylation, oxidation или deamination. Повреждение распознается с помощью glycosylases, которые вырезают поврежденное основание, в результате возникает пустое abasic site (apurinic или apyrimidinic, AP). Фосфоэфирная связь 5' AP сайта затем выщепляется с помощью AP-endonucleases (APE), и пробел заполняется с помощью синтеза и ligation ДНК. Thymine-DNA glycosylase (TDG) гидролизует N-glycosidic мостики thymine или uracil, если несовместимы с guanine³⁸. Модификация TDG с помощью SUMO-1 или SUMO-3 вызывает диссоциацию энзима от продукта AP сайта, это приводит к эффективному ферментативному обороту (turnover)³⁹. Контролируемая диссоциация TDG от субстрата, по-видимому, необходима для правильно связи эксцизии основания с активностью APE, редуцируя воздействия потенциально вредного AP сайта. Данные по кристаллической структуре центрального домена энзима, конъюгирующего с SUMO, показали, что конъюгированный SUMO взаимодействует с элементом, связывающим SUMO в энзиме. Это внутримолекулярное взаимодействие, по-видимому, ведет к выпячиванию спирали, которое может в свою очередь мешать соединению с ДНК⁴⁰.

Репарация double-strand breaks (DSBs) представляет др. пример пути SUMOylation, который может влиять на функцию белка и может кооперировать с ubiquitylation. DSBs вызываются в основном с помощью экзогенных агентов, таких как γ-облучение или определенные химические соединения, но они также появляются случайно во время несовершенной репликации. Они также активно индуцируются специфическими процессами, такими как мейоз, рекомбинация иммуноглобулиновых генов, и переключение типов спаривания у дрожжей. Основными путями репарации DSB являются homologous recombination (HR) и non-homologous end-joining (NHEJ). HR начинается с рекрутирования MRN complex (MRX у дрожжей) на место разрыва; комплекс затем соединяет разорванные концы вместе и обеспечивает вырезание нити ДНК, формируя однонитчатую ДНК в разрыве. Однонитчатая ДНК затем быстро покрывается и защищается с помощью гетеротримерного RPA комплекса. Важным медиатором рекомбинации является Rad52 (а у людей также BRCA2). Этот колесовидный гомо-олигомерный белок устраняет RPA из хроматина и замещает его рекомбиназой Rad51, формируя нуклеопротеиновые филаменты. Rad51 наконец катализирует рекомбинацию между гомологичными последовательностями⁴¹.

Rad52 SUMOylated, когда возникает DSB, и стимулируется с помощью MRX комплекса⁴². Интересно, что Rad52 SUMOylation затрагивает значительные количества HR субстратов, а мутантные Rad52 белки, лишенные сайтов SUMOylation деградируют быстрее с помощью ubiquitin-proteasome пути в этих условиях. Т.к. Rad52 является стабильным в отсутствие DSBs, то это указывает на то, что только рекомбинацией привлекаемые Rad52 белки склонны к ubiquitin-зависимой деградации⁴². SUMOylation может дать приют от ускоренной деградации, вообще-то за счет секвестрации белка в фокусах репарации.

Нежелательная рекомбинация между гомологичными последовательностями, такими как повторы ДНК, кодирующими ribosomal RNA (rDNA), является особым вызовом для HR. В случае rDNA, это, по-видимому, сопровождается частично ограничением активности HR внутри ядрышка, где rDNA обычно располагается. Если DSBs возникают в rDNA локусе, то они репарируются вне ядрышка, а внутри нуклеоплазмы, на что указывает образование внеядрышковых фокусов репарации⁴³. В самом деле, ядрышки, по-видимому, являются динамическими, т.к. ДНК часто выходит и снова вступает в ядрышко. В отсутствие Rad52 SUMOylation, происходит гипер-рекомбинация внутри кластера rDNA, сопровождаемая появлением extragenomic rDNA circles (ERCs)⁴³. Предупреждает ли Rad52 SUMOylation активно продуктивную сборку HR белков в ядрышке, или оно останавливает репаративные комплексы в нуклеоплазме, пока открытый вопрос.

Репарация DSBs в клетках млекопитающих связана с геном BRCA1, который мутанте у некоторых пациентов с раком груди. BRCA1 кодирует E3 ubiquitin лигазу⁴⁴. Др. E3 лигаза, RNF8, также была картирована на поврежденных сайтах. RNF8 имеет N-терминальный FHA домен, который в ответ на повреждение ДНК соединяется с фосфорилированной областью MDC1. Это в свою очередь связывает фосфорилированную H2AX, хорошо известную хроматиновую метку повреждения ДНК. Накопление RNF8 на повреждениях ДНК приводит к рекрутированию 53BP1 и BRCA1, вызывая экстенсивное убиквитилирование белков в месте повреждения^45-47. Известными мишенями RNF8 являются H2A и его вариант H2AX^{45, 47}, из которых первый, как было установлено ранее, является субстратом для индуцированной УФЛ ubiquitylation⁴⁸. RNF8 действует совместно с E2 энзимом UBC13, который также действует в свободной от ошибок ветви пути RAD6. В самом деле, в UBC13-дефицитных клетках кур, BRCA1 не накапливается в поврежденных сайтах и не происходит H2AX ubiquitylation после облучения⁴⁹.

Белок RAP80, который содержит UIM, необходим для накопления BRCA1 в местах повреждений^50-52. В истощенных по UBC13 и RNF8 клетках, RAP80 накопление не происходит⁴⁵.Т.к. UBC13 участвует в катализе Lys-63-сцепленных polyubiquitin цепочек и т.к. RAP80 обнаруживает предпочтение к данному типу модификаций, то очень вероятно, что ubiquitin выполняет не-протеолитическую роль в этом пути. Неясно, соединяется ли RAP80 непосредственно с (poly)ubiquitylated H2A, модифицированным вариантом гистона, или с неидентифицированной ещё RNF8 мишенью (Fig. 4). В дополнение к облегчению рекрутирования нижестоящих факторов, ubiquitylation гистона может затрагивать структуру хроматина, возможно приводя к репарации или повреждению передачи сигналов.

Сходное накопление ubiquitin наблюдается в местах NER (refs 48, 53). Подобно фосфорилироанию H2AX⁵⁴, H2A ubiquitylation также зависит от повреждений ДНК⁴⁸. Однако неясно, могут ли разные типы повреждений ДНК приводить к сходной DDR реакции.

Ubiquitylation и SUMOylation являются временными и обратимыми модификациями, и энзимы. который удаляют модификаторы выполняют важную регуляторную роль. Напр., deubiquitylation, наблюдаемое на пути к анемии Фанкони, которое обеспечивает устранение поперечных сшивок между нитями ДНК. Повреждение такого типа высоко токсично и нуждается в комбинации HR, NER и TLS путей. Дефицит одного из известных 13 FA генов приводит к гиперчувствительности к crosslinkers ДНК. Большинство из идентифицированных Fanconi anaemia белков составляют одиночную крупнуюмультисубъединичную E3 ubiquitin лигазу, а два др., FANCD2 и FANCI, являются соотв. субстратами, которые перемещаются на хроматин, если ubiquitylated^55-57. Функция этих белков на хроматине и на последующих ступенях, пока неизвестна.

Деубиквитилирование энзима USP1 действует как на FANCD2, так и на FANCI, а также на PCNA^57-59. Потеря активности USP1 ведет к убиквитилированию этих белков, даже если нет повреждений ДНК^57-59. Клетки кур, в которых ген, кодирующий USP1, нокаутирован, обнаруживают гиперчувствительность к crosslinkers ДНК, признак анемии Фанкони⁶⁰, указывая тем самым, что deubiquitylation FANCD2 и FANCI является критической для репарации. USP1 содержит внутренний домен, связанный с с концом ubiquitin, который способствует ауторасщеплению⁵⁸. Однако , т.к. расщепляющий энзим всё ещё протеолитически активен⁶¹, преобразованный не-расщепляющий вариант может частично служить дополнением USP1-дефицитным клеткам⁶⁰, роль USP1 ауторасщепления неясна. Тем не менее, т.к. и ubiquitylation и deubiquitylation FANCD2 и FANCI, по-видимому, является критическим для нормальной репарации поперечных сшивок ДНК, то очень возможно, что разные уровни регуляции являются важными для наведения и координации репарирующих энзимовв местах повреждений.

Future studies will no doubt reveal further links between ubiquitylation and SUMOylation and human diseases, including DNA-repair disorders. Both types of modification function in two general ways: as an adhesive or a repellent. The various surfaces of the two modifiers provide binding sites for protein–protein interactions, but their bulkiness can block other interactions. Several interactions of ubiquitin or SUMO with cognate binding proteins are relatively weak. Moreover, sometimes binding occurs even in the absence of modification, but the attached modifiers greatly strengthen the associations. It therefore seems plausible that protein assemblies may be firmly held in place by additive weak interactions between several modifiers and several modifier-binding modules present on different proteins of the assembly. As a result, the assembly of complexes is less efficient when there is no damage; that is, when proteins are unmodified (Fig. 5). In this model, disassembly is initiated by deubiquitylation and deSUMOylation enzymes or, alternatively, by the repellent activities of the modifiers. Because many nuclear functions take place within large protein assemblies, it will be interesting to see whether key functions of the two modifiers are perhaps to define nuclear territories, to assemble or disassemble nuclear activities, or to provide directionality to a pathway by a stepwise organization of protein complexes that should function one after the other.