В этом году ученые получили клетки кожи от пациентов, страдающих различными болезнями и репрограммировали их в стволовые клетки. Трансформированые клетки росли и делились в лаборатории, предоставляя исследователям новый инструмент для изучения клеточных процессов, которые лежат в основе забеолеваний пациентов. Это достижение такж может быть важной ступенью на длинном пути лечения болезней собственными клетками пациента.

Искусный генетический трюк впервые разработан на мышах и описан два года назад, в нем ученые стирали онтогенетическую клеточную "память", заставля их возвращаться к их первоночальному эмбриональному состоянию и затем снова выращивали в нечто иное. В 2008, исследователи достигли следующего рубежа в клеточном репрограммировании. В элегантном исследовании на на живых мышах они заставляли клетки делать скачок непосредственно из одной зрелой клетки в др. — пренебрегая обычным правилом, что развитие клеток происходит по пути с односторонним движением. Этот и др. успехи в преобразовании клеток позволили определить успехи в этой процветающей области клеточного перепрограммирования как Прорыв Года.

Прорыв этого года не стер из нашей памяти крупный скандал, который разразился 3 года назад, после того как ученые Южной Кореи обманно объявили об использовании переноса ядер соматических клеток — техники, использованной для клонирования овечки Долли — чтобы генерировать стволовые клетки от пациентов, страдающих типа 1 диабетом, повреждениями спинного мозга и врожденными иммунными болезнями. Этот обман сильно затормозил исследования; специфичные для пациента стволовые клетки стали казаться очень отдаленной перспективой.

Новые разработки базируются на двух предыдущих крупных достижениях. 10 лет тому назад ученые из Wisconsin заявили, что они культивировали human embryonic stem (hES) клетки — клетки с потенциалом формировать любой тип клеток тела. Этот признак, известный как плюрипотентность, открыл миру новые возможности в биологии развития и медицинских исследованиях, но они отягощены багажом: для выделения клеток эмбрион обычно разрушается, поэтому исследователи вели жесткие споры о биоэтике. Во многих странах, включая США, политические решения ограничивали исследования ученых с hES клетками. В 2006 японские исследователи сообщили, что они нашли возможный способ обойти практические и этические вопросы, связанные с hES клетками. Путем введения только 4-х генов клетки хвоста мыши росли в лабораторных чашках и могли продуцировать клетки, которые выглядели и действовали подобно ES клеткам. Они назвали эти клетки induced pluripotent stem (iPS) клетками. Это было признано прорывом 2007. Та же самая группа и две др. в США расширили технику репрограммирования клеток человека. Их результаты открыли шлюз для новых исследований.

Breakthrough Online For an expanded version of this section, with references, links, and multimedia, see www. sciencemag.org/btoy2008.

Почти декаду биологи стволовых клеток искли пути получения линий долгоживущих клеток от пациентов, страдающих трудными для изучения болезнями. (Большинство взрослых клеток не выживает в культуральных условиях лаборатории, поэтому получение интересующих клеток непосредственно от пациентов казадось невозможным). В этом году две группы достигли этой цели. Одна группа получила линии iPS клеток из клеток кожи 82-летней женщины, страдающей amyotrophic lateral sclerosis (Lou Gehrig's disease), дегенеративным заболеванием, которое затрагивает двигательные нейроны, вызывая постепенный паралич. Ученые затем заставили клетки формировать нейроны и глию, клетки наиболее повреждаемые при данной болезни (photos, p. 1767).

Лишь неделей позже др. группа сообщила о получении специфичных для пациентов iPS клеточных линий для 10 разных заболеваний (see table), среди них muscular dystrophy, type 1 diabetes и синдром Дауна. Многие из этих заболеваний трудно или невозможно изучать на животных моделях; репрограммированные клетки дали ученым новый инструмент для изучения молекулярных основ болезней. Эти достижения могут также оказаться полезными для скрининга потенциальных лекарств. В конечном итоге такая техника может позволить ученым корректировать генетические дефекты в лабораторных чашках и затем лечить пациентов изх собственными репарированными клетками.

Др. работа, опубликованная в этом году, подтверждает, что репрограммирование заставляет сходить с основной дороги, но не возвращает назад к эмбриональному состоянию, а может заставлять клетки принимать непосредственно новую зрелую судьбу. Американские исследователи, работающие на мышах. репрограммировали зрелые панкреатические клетки, наз. экзокринныыми клетками в β клетки, клетки поджелудочной железы, которые продуцируют инсулин и разрушаются при диабете типа 1. Группа инъецировала коктейль из из трех вирусов в панкреас взрослых мышей. Вирусы первоначально инфицировали экзокринные клетки и каждая несла разные гены. играющие рольв развитии β клеток. В течение нескольких дней обработанные мыши формировали инсулин-продуцирующие клетки, которые выглядели и действовали подобно bona fide β клеткам.

Результаты оказались неожиданными, т.к. в живых созданиях специализированные клетки почти никогда не изменяют своего курса, не меняются из мышечных, напр.. в легочные клетки. Такое прямое репрограммирование, однако, может быть более простым и надежным. чем использование плюрипотентных клеток для лечения некоторых болезней. Эта техника может также позволить ученым ускорить продукцию в лабораториях определенных типов клеток, используя определенные факторы для изменения одного типа культивируемых клеток непосредственно в др.

Хотя исследователи достигли впечатляющего прогресса в 2008, необходимы еще несколько прорывов прежде чем клеточное репрограммирование даст урожай в виде первой излеченной болезни. Чтобы репрограммирование было достаточно надежным для использования в клеточной терапии, исследователи д. найти эффективный, реальный способ запускать его. Они также хотят понять в точности, как это работает. Хотя десятки лабораторий используют технику, но что происходит внутри репрограммирруемой клетки остается тайной и комбинация вероятностей событий, по-видимому, предопределяет, какие редкие клетки в конце концов окажутся репрограммированными. Ведущая теория полагает, что некоторые из репрограммирующих факторов в первую очередь помогают сделаться более разговорчивой ДНК в ядрах клеток, это позволяет им легче реактивировать отключенные гены. Затем др. факторы помогают запустить каскад белковых сиганлов. которые придают клетке её новые характерные особенности (see the Review by Gurdon and Melton on p. 1811).

Оригинальное репрограммирование базируется на вирусах, чтобы внести гены репрограммирования в геном инфицируемых клеток, непрерывно изменяя ДНК. Ученые меняют этот подход по ряду причин. Во-первых, внесенная ДНК д.прервать экспрессиию существующих генов — напр., тех, что защищают от рака, приводя к тому, что клетки легко формируют опухоли. И хотя вставленные гены, по-видимому, выключаются, когда репрограммирование заканчивается, это позволяет собственным генам в клетке начинать действовать, ученые обеспокоены, что введенные гены могут быть реактивированы или могут оказывать др.трудноуловимые воздействия на клетку.

По этой причине, лаборатории всего мира работают над др. способами запуска репрограммирования. В этом году достигнут быстрый прогресс. Несколько групп установили, что они могут замещать химическими соединениями некоторые из вводимых генов. Др. установили, что аденовирусы также могут выполнять этот трюк, по крайней мере, на мышиных клетках. Аденовирусы, которые вызывают общее охлаждение, не вставляются сами в геном. Вирусы экспрессируют свои гены достаточно долго, чтобы репрограммировать клетку, но как только клетка делится, то вирусы расстворяются до необнаружимых уровней, оставляя репрограммированные клетки с их неизменным исходным геномом. Исследователи и Японии показали, что кольцевая ДНК, называемая плазмидой также может нести необходимые гены в клетку. Альтернативы эти значительно менее эффективны, чем оригинальные рецепты, однако большинство из них toq не апробировано на клетках человека, которые имеют более устойчивые программы, мем мышиные клетки.

Чтобы быть пригодным репрограммирование таже д. стать более эффективным. В большинстве экспериментов репрограммирование происходит менее чем в одной из 10,000 клеток. Поэтому большая удача, что две группы показали в этом году, что клетки кожи, наз. кератиноцитами, особенно пригодны для репрограммирования. Исследователи смогли репрограммировать приблизительно 1%

Diseases With Patient-Specific iPS Cell Lines Amyotrophic Lateral Sclerosis (Lou Gehrig's disease) ADA-SCID Gaucher disease type III Duchenne muscular dystrophy Becker muscular dystrophy Down syndrome Parkinson's disease Juvenile diabetes mellitus Shwachman-Bodian-Diamond syndrome Huntington disease Lesch-Nyhan syndrome (carrier)

из обработанных кератиноцитов и процесс занял только 10 дней вместо нескольких недель, необходимых др. клеткам. Волосяные фолликулы (photo, p. 1766) являются богатым источником кератиноцитов и исследователи из Калифорнии и Испании показали, что они могут эффективно производить персонализованные линии клеток из клеток, полученных из одиночного волоса. выщипанного из скальпа — это даже более легкий источник клеток, чем иссечение кусочка кожи.

Наконец, репрограммирование нуждается в лучшем контроле качества. В этом году американская группа слелала крупный шаг в этом направлении, получая клетки, в которых репрограммируемые гены может быть запущены путем добавления антибиотика doxycycline. Они использовали репрограммированные клетки, чтобы генерировать "второе поколение" iPS клеток, которые генетически идентичны — каждая содержит одну и ту же вирусную вставку. Эти клетки д. позволить ученым изучить процесс репрограммирования впервые в стандартизованных условиях и д. помочь выявить биохимические процессы, которые позволяют взрослым клеткам съезжать с основной дороги, с их однонаправленного пути развития.

ДОЛГОЖДАННАЯ АЛЬТЕРНАТИВА

Дж. Минкел
В Мире Науки, 2008, № 5, С.6-7

Прошло десять лет с тех пор, как на свет появилось первое клонированное животное - овечка Долли. А в ноябре 2007 г. биолог из Эдинбургского университета Иэн Уилмут (Ian Wilmut) заявил, что он больше не собирается участвовать в "играх по клонированию". Уход с "игрового поля" не был триумфальным: ни сам Уилмут, ни кто-либо из его коллег не преуспели в клонировании зрелой клетки человека методом инъецирования ее ядра в подготовленную соответствующим образом яйцеклетку и в получении эмбриональных стволовых клеток. Зато ученому удалось раз- работать метод прямой трансформации клеток кожи человека, в результате которой они приобрели свойства, сходные с таковыми у эмбриональных клеток. В своем интервью Уилмут заявил, что, по его мнению, клонирование - пройденный этап.

Если продукт трансформации, о котором идет речь, а именно - индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки в до- статочной степени универсальны и не содержат дефектов, то они мо- гут стать доступным источником стволовых клеток, что позволит проводить апробирование лекарственных препаратов и подбирать способ лечения с использованием клеточных линий, совместимых с иммунной системой больного. "Все это вполне реально, а возможность обходиться в работе без ооци- тов человека крайне привлекательна", - говорит Арнолд Кригштайн (Arnold Kriegstein), директор Института регенеративной медицины при Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Рождение Долли доказало, что клетки можно перепрограммировать. Весь вопрос в том, каким способом. Если осуществлять слияние взрослой клетки и эмбриональной стволовой, то образуется "коктейль" из генных продуктов, способных инициировать перепрограммирование. К такому заключению пришли авторы одной из статей, опубликованных в 2005 г. в журнале Science. Уже на следующий год после по- явления этой публикации группа ученых - специалистов в области биологии стволовых клеток, которую возглавляет Шинья Яманака (Shinya Yamanaka) из Киотского университета в Японии, опубликовала "рецепт" перепрограммирования фибробластов (клеток соединительной ткани) мыши. В его основе лежит встраивание в клеточную ДНК четырех мощных регуляторных генов - Oct4, Sox2, c-myc и Klf4, каждый из которых доставляется к месту назначения с помощью "своего" ретровируса. Подобно рубильнику на электростанции, эти гены одновременно включают множество других. Трансформирован- ные таким образом клетки прошли тест на плюрипотентность: когда их инъецировали в мышиные эмбрионы, они дали начало всем трем основным зародышевым листкам эмбриона.

Сходные сообщения поступили в начале прошлого года из лабораторий Рудольфа Джениша (Rudolf Jaenisch) из Института биомедицин- ских исследований при Массачусетском технологическом институ- те и Конрада Хохедлингера (Konrad Hochedlinger) из Гарвардского института по исследованию стволовых клеток. Затем в ноябре две группы - одна во главе с Яманака, и другая под руководством Джеймса Томсона (James Thomson) из Висконсинского университета в Мадисоне, - не- зависимо друг от друга опубликовали в Science результаты экспериментов на фибробластах человека. "Мне казалось, что для решения данной проблемы потребуется лет 20, но, к счастью, я ошибался", - говорит Томсон, в 1998 г. впервые выделивший стволовые клетки человеческого эмбриона. Примечательно, что Томсон и его коллеги получили iPS-клетки, не используя ген c-myc, который причастен к возникновению рака. Правда, при этом они перепрограммировали клетки плода и новорожденного, а не клетки взрослого человека. Всего неделей позже Яманака сообщил о том, что ему удалось сделать то же самое на клетках взрослого человека и мыши. Из 26 грызунов, на которых проводились опыты, ни один не погиб от рака, а из 37 мышей, несущих генc-myc, умерли шесть.

Следующим шагом в совершенствовании метода перепрограммирования станет замена ретровирусов другими векторами. Ретровирусы встраивают свою ДНК в геном клетки хозяина в случайных позициях, что может отрицательно сказаться на работе ключевых генов. Первоочередной задачей исследователей является поиск низкомолекулярных веществ, которые мог- ли бы инициировать перепрограммирование. Независимо от способа получения плюрипотентных клеток до их применения в клинике еще далеко. Пока что Джейкоб Ханна (Jacob Hanna) из группы Джениша попытался ис- пользовать iPS-клетки (с исключенным c-myc-геном) для нормализации крови трансгенных мышей, которым был встроен мутантный генгемоглобина, ответственный за раз- витие серповидноклеточной анемии. Томсон и другие исследователи подчеркивают, что эмбриональные стволовые клетки остаются неоценимым исследовательским инструментом. И совершенно необходимы они будут тогда, когда потребуется подтвердить полноценность и бе- зопасность iPS-клеток. "Перепрограммированные клетки могут отличаться с клинической точки зрения от эмбриональных стволовых, -замечает Томас. - Многим хотелось бы совсем отказаться от экспериментов на эмбрионах, и, несомненно, так и произойдет, однако не пря- мо сейчас".