I. INTRODUCTION: MAMMALIAN SKELETAL DEVELOPMENT FROM AN EVOLUTIONARY PERSPECTIVE

Форма скелета устанавливается во время ранней дифференцировки в виде столбов соединительной ткани, которые затем разделяются на зачатки костей с помощью апоптоза. Последовательная экспрессия гомеозисных (hox) генов главенствует над региональной дифференцировкой и регионы подразделяются с помощью wingless типа (Wnt)-управляемых часов. Эта последовательность в раннем эмбриональном развитии является родоначальной по происхождению. У позвоночных она адаптируется к установлению сегментов позвоночного столба. Локальная экспрессия bone morphogenetie protein (BMP) и fibroblast growth factor (FGF) предопределяет апоптические границы, которые разделяют индивидуальные кости, и диктует эпидермально-скелетные структуры. Если белки, такие как noggin, который убирает BMPs и ограничивает передачу ими сигналов, теряются, то скелет образуется как слитая масса. Повреждения FGF рецепторов вызывают ошибки в слиянии и разделении индивидуальных костей в черепе и руках. Выросты конечностей используют дополнительные сигналы, которые не будут рассмотрены здесь. Рыхлый мезенхимный зачаток скелета млекопитающих дифференцируется сначала, для большинства частей, как хрящ. Хондроциты из мезенхимных стволовых клеток продуцируют лишенную сосудов ткань из моноядерных клеток в сети type II коллагена и гидрофильных протеогликанов, создавая прочную на разрыв и резистентную к сдавливанию ткань соотв. Хрящевой скелет является конечной стадией у акул и скатов (rays), хотя все существенные компоненты скелета уже присутствуют на этой эволюционной стадии. У костистых рыб скелет минерализуется, но он всё ещё ткань без сосудов; полноценный. снабженный сосудами скелет является приобретением дышащих воздухом позвоночных.

Хрящ в основном замещен новым типом пустотелой, снабженной сосудами кости у наземных позвоночных. При этом переходе хрящевые клетки располагаются в виде рядов вдоль оси роста. Матрикс между рядами хондроцитов минерализован, секретируются metalloproteinases и vascular endothelial growth factor (VEGF) и хондроциты погибают. Вследствие инвазии сосудов дифференцируются остеобласты также из мезенхимных стволовых клеток и откладывается кость на минерализованном хрящевом каркасе. Минерализованный хрящ и соседняя кость составляют primary spongiosa (первичное губчатое вещество). Оно деградирует с помощью происходящих из моноцитов, секретирующих кислоту многоядерных клеток, остеокластов. Дифференцировка остеокластов нуждается в моноядерном growth and survival factor CSF-1 и белке семейства tumour necrosis factor (TNF), RANKL, лиганде рецепторного активатора NF-кВ (RANK), а также во вторичных сигналах. Эти сигналы продуцируются локально в основном как связанные с мембраной белки в стромальных клетках. Остеобласты замещают матрикс по мере его деградации вторичной трабекулярной костью, которые следуют линиям давления. Трабекулярная кость резорбируется, когда она защищена от давления в длинных костях. Хрящ сохраняется в выстилке суставов, создавая условия низкого трения и в ростовых пластинках, где пролиферация хондроцитов позволяет костям расти в длину (Fig. 1A). Возможно, что стволовые клетки, которые могут продуцировать как гематопоэтические, так и мезенхимные компоненты кости, также существуют и во взрослом скелете, но

Fig. 1. Development of a long bone in the terrestrial vertebrates. (A) Cartilage from the anlage of the bone is replaced, except at growth plates and articular cartilages, by bone. Bone forms on columns of mineralized cartilage produced during the nansition of cartilage to bone, mediated by differentiation of cells from vascular ingrowth. (B) Trabecular bone reinforces bone in areas subject to complex forces, while in the shafts of long bones it is resorbed. The trabecular bone has a large surface area, and all formation and resorption take place at the bone surfaces. This renders the regions of trabecular bone susceptible to damage when bone mass is lost overall.

если это так, то они не были выделены и охарактеризованы. Бесклеточная минерализованная ткань тяжелая поэтому адаптация к жизни на суше потребовала развития нового типа крепкой и легкой клеточной кости. Это живая ткань, которая секретирует концентрические слои из type I коллагенового матрикса, которые ориентируются попеременно параллельно и ортогонально по отношению к основной оси, в которых откладывается минерал. Клеточная сеть соединена с помощью CX43 щелевых соединений с внутренней стороной и выстилкой поверхности кости.

В суставах, где силы могут воздействовать под разными углами, костные трабекулы, которые развиваются на минерализованном хряще сохраняются и усиливаются в виде взаимосвязанных дуг. В позвоночнике продуцируется сходное губчатое вещество кости, но трабекулы ориентированы вдоль оси позвоночника с ортогональными поперечными связями, чтобы обеспечить прочную, но легкую губчатую сеть. В центре длинной кости внутренние трабекулы резорбируются в пользу одиночного плотного кортекса с максимумом соотношения крепости к весу в отношении нагрузок вдоль оси кости (Fig. 1B). Заметим, что трабекулярная кость обладает более крупной областью поверхности по сравнению с относительно компактной кортикальной костью, все формирование и резорбция кости происходит на костных поверхностях. Т.о., трабекулярная кость диспропорционально чувствительна к повреждениям, если происходит потеря костных сетей. Трабекулярная кость позвоночника и бедер страдают первыми. В любом случае тщательный баланс между апоптозом, деградацией и синтезом кости абсолютно критический для собственно развития и поддержания размеров. формы и целостности кости.

Баланс формирования и резорбции кости регулируется с помощью перекрестного взаимодействия между синтетической и резорбтивной активностью, с дополнительной регуляцией с помощью тензорных рецепторов и гормональных механизмов. Эти регуляторы механизмов гормонального и локального баланса в большинстве случаев с удивительной точностью позволяют скелетной массе быть использованной для регуляции кальция без компромиссов между её общей крепостью и балансом количеств скелетных масс, необходимых для локальных структурных нужд. Первым из таких регуляторов является parathyroid hormone, PTH. Это является старейшей и первостепеннейшей адаптацией. Использование скелетного минерала для поддержания уровней Ca²⁺ в плазме берет начало от костистых рыб, с развитием бранхиальной (жаберных) паратироидных желез, которые отвечают на снижение кальция секрецией растворимого PTH. Родоначальная система не являлась ещё эндокринной, а паракринной, с передачей клетками связанного сигнала PTH-rP соседним PTH рецепторам; это использовалось в регуляции органогенеза во многих местах, включая решения о дифференцировке хряща и ранней остеобластной дифференцировке в развивающихся костях позвоночных (Kronenberg. 2006). PTH как растворимый гормон действует как ускоритель образования и резорбции скелета. Жизненно необходимая потребность в стабильных уровнях кальция в сыворотке поддерживается реакцией костного скелета, которая сохраняется вплоть до того момента, пока не наступит крах скелета. Скелет регулируется также косвенно с помощью эндокринных факторов, связанных с системой инсулиновой реакции, и с помощью жировой ткани, факторы которой связаны с общим скелетным и энергетическим метаболизмом (Lee et at., 2007). При этом используются как центральный, так и периферический механизмы.

При менее экстремальных условиях, тот факт, что реакция PTH обеспечивается за счет модификации факторов локального роста и дифференцировки, делает возможным сбалансированный синтез и резорбцию кости. Ключевой pro-resorptive агент, который ограничивает дифференцировку остеокластов, RANKL, является связанным с мембраной белком, позитивно регулируемым с помощью PTH (Huang et at., 2004), который управляет развитием остеокластов на клеточном уровне. Локальная организация и сайт-управляемая дифференцировка клеток наблюдается на хорошо фиксированной кости (Fig. 2).

Результатом управления костной массой является идеальная, стабильная костная масса в течение всей жизни, с реакцией на нагрузку, усиливающей прочность там, где это необходимо, с минералом, который используется для поддержания в сыворотке уровней Ca²⁺ или pH, и который замещается, если пищевой минерал доступен. Поскольку гомеостаз кальция является критическим для жизнеспособности, то ремоделирование кости in vivo часто происходит с высокой скоростью. Граммы скелетной ткани деградируют и продуцируются ежедневно у взрослого человека. Напротив, избыток скелетной массы становится тяжелым бременем для суставов и мышц. Высокое содержание костной массы отличается от osteopenosis, группы болезней с дефектом удаления минерализованной кости и хряща. Остеопения или снижение костной массы, снижает прочность скелета и ограничивает доступность минералов из скелета для метаболических функций. При его крайней форме остеопорозе, скелет ослабляется настолько. что ломается.

Косвенные эффекты регуляции более высокого порядка кости с помощью продукции гормонов подтверждены в исследованиях in vitro, которые показали, что гормоны модифицируют продукцию RANKL в остеобластах и предшественниках остеобластов, тогда как не оказывают эффекта на дифференцировку остеокластов в присутствии RANKL. Остеобласты секретируют также растворимый TNT рецептор,

Fig, 2. Bone cell differentiation. Note the distinct compartments of marrow cells producing leukocytes and red blood cells (marrow) as well as bone bordered by osteoblasts (OB) and osteoclasts (ОС). The individual domains are completely separate and highly organised. The field is 0.4 mm square. To minimize arrifacts, a 5 mm cube of live avian trabecular bone was dropped into ice-cold 4% glutaraldehyde and plastic embedded. The tissue was cut without decalcification to 500 nm thickness and stained with Methylene Blue.

osteoprotegerin, который связывает RANKL и др. TNFs, включая TRAIL. Эти "decoy" рецепторы убирают любые RANKL, которые высвобождаются в результате протеолиза и подтверждают, что дифференцировка костных клеток ограничивается точным местом, где клетки необходимы (Fig. 2). Т.о., поскольку их ключевой функцией является формирование новой кости, то остеобласты также контролируют потерю кости, влияя на активность остеокластов. Стандартная модель дифференцировки костных клеток является, таким образом, локальной в основном за счет связанных с клеточными мембранами или с матриксом факторов роста и дифференцировки, продуцируемых как раз остеобластами и остеокластами, возникающими из ближайших предшественников (Fig. 3). В свою очередь высшего порядка регуляция модифицирует жизнеспособность и активность костных клеток путем модулирования тех же самых факторов роста и дифференцировки, которые также необходимы для выживания костных клеток и для их устранения в случае апоптоза.

Механизмы, регулирующие связь между формированием и резорбцией кости лучше всего рассматривать в контексте относительно простой, локальной клеточной дифференцировки (Fig. 3) и ключевых клеточных сигналов. При этом, хотя и опускаются многие детали формируется надежная основа для рассмотрения дополнительной регуляции

Fig. 3. Mediation of bone cell differentiation by local expression of growdi and differentiation factors. Mesenchymal stem celLs from stroma differentiate to form osteoblasts; this requires multiple stimuli including bone morphogenetic proteins (BMPs) which are not well defined. Osteoblasts are connected in cohorts of cells that secrete matrix togedier by coimexons with CX43 being a central component; lines of cells that are buried in matrix (osteocytes) remain connected to the surface las'er and survive as long as the bone matrix is retained; these cells are believed to be important in stretch-mediated signalling for matrix maintenance. In the case of osteoclast development, however, it is predominately membrane forms of CSF-1, the f'ms ligand, and the tumour necrosis factor (TNFj-famify protein RANKL, which mediate highly localised development of osteoclasts precisely where the inducing growth factors occur.

Соответствующая связь между резорбцией и формированием кости является обязательным условием для поддержания и репарации скелета. С др. стороны, д. существовать гибкость в отношении использования скелета для предотвращения фатальных изменений в уровнях кальция в сыворотке или менее распространенной функции, регуляции в сыворотке pH. Скелет является резервуаром кальция, но противоионами кальция являются PO₄^3- и OH^-, так что резорбция кости также забуфферена с помощью противодействующих крупных кислых нагрузок, которые известны уже многие годы, но часто не учитываются (Fitz, Alsberg & Henderson, 1907). Регуляция высшего порядка с помощью системных гормонов с потребностью в хроническом ацидозе и в регуляции кальция, продуцирует системные болезни, что наиболее важно, остеопороз. Аномалии в локальной передаче сигналов обусловливают деструкцию кости при некоторых формах артритов и при раке.

II. THE ORIGIN OF THE OSTEOBLAST

Mesenchymal stem cells (MSCs) поддерживаются в самообновляющихся недифференцированных компартментах кости. Они появляются как неопределенного вида клетки на границах компартментов из дифференцированных клеток (недифференцированные небольшие клетки на границах между определенными популяциями клеток костного мозга, видимого на Fig. 2 включая стволовые клетки), и могут при соотв. стимулах продуцировать остеобласты, хондроциты, фибробласты и адипоциты. Они способны продуцировать клетки многих др. тканей также. Кость является самым богатым источником MSCs, отражающим активность оборота скелета. Он настолько активен, что оборот кости может быть отслежен путем измерения гидроксипролина из коллагена: оборот коллагена в др. тканях количественно несущественен по равнению с костью. Фенотипический переход от MSG нуждается в точной, непрерывной и асинхронной экспрессии генов. Для некоторых клонов критические сигналы известны, но программа формирования остеобластов изучена недостаточно. Условия для дифференцировки остеобластов in vitro являются дозволяющими. Сами MSG характеризуются ранними маркерами и низким уровнем экспрессии широкого разнообразия рецепторов гормонов и цитокинов, включая некоторые неожиданности, такие как рецептор follicle stimulating hormone (FSH) . Как поддерживается резервуар MSCs пока неизвестно. Это может быть связано с выделением в компартментах экспрессирующихся ранних факторов жизнеспособности, но не существует системной модели для такого компартмента.

Хотя специфические условия, которые могут индуцировать формирование остеобластов, не определены, последовательность маркеров клеточной дифференцировки и транскрипционных факторов, которые экспрессируются во время дифференцировки остеобластов изучалась интенсивно. Инициальная ступень наиболее мистическая, превращение в остеопредшественники. Это совпадает с высоким уровнем экспрессии рецепторов для гормонов и цитокинов, включая PTH, prostaglandins, interleukin (IL)-11, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) и transforming growth factor-β (TGFβ), которые активны в остеобластах. Отметим, однако, что ни один из рецепторов не является специфическим для остеобластов. После этого клетки продолжают пролиферировать, но обнаруживают сильно сниженную пластичность. Wingless-типа белки (Wnts) и bone morphogeneitic proteins (BMPs) управляют этими ранними событиями, тогда как helix-loop-helix белки Twist и Id поддерживают пролиферацию.

Клетки постепенно заканчивают пролиферацию и начинают секретировать типа I коллаген. Поперечные связи типа I коллагена являются основными строительными блоками кости. Кроме того, продуцируются не-коллагеновые белки, включая osteocalcin, малый vitamin-K-зависимый (γ-carboxyglutamate-содержащий) белок, связывающий кальций, который является специфическим для кости, и щелочную фосфатазу, которая важна для отложения минерала. Дефицит в кости щелочной фосфатазы ведет к летальному фенотипу из-за отсутствия минерализации костей и накопления pyrophosphate в сыворотке (hypophosphatasia). Дополнительными важными белками остеобластов являются протеогликаны, такие как biglycan и decorin, которые модулируют активность образование коллагеновых фибрилл многих ростовых факторов, включая TGFβ. Дополнительные матричные гликопротеины osteonectin и tenasins регулируют минерализацию и матричную организацию, а некоторые arginine-glycine-aspartate-(RGD)-содержащие гликопротеины важны для взаимодействий остеокласт-матрикс и для белков прикрепления остеобластов (Ling et aL, 2005). В частности, активные остеобласты противостоят вновь формируемому белковому матриксу или остеоиду, где они закреплены с помощью cadherin-11 и N-cadherin. Integrins, включая α1 субъединицу обеспечивают слипчивость и важны для секреции коллагена и др. матричных белков. Остеобласты общаются с находящимися рядом гематопоэтическими стволовыми клетками посредством трансмембранного белка notch и его рецептора jagged (Visnjic et aL, 2004; Calvi et aL 2003; Zhang et aL, 2003). Уплощенные, пассивные остеобласты выстилают неактивную поверхность кости, или внутреннюю (эндостальную) или наружную (надкостничную).

Белковый матрикс минерализуется с помощью процесса. который до сих пор до конца неясен. Кальцификация хряща четко управляется с помощью расщепления источников фосфатов в рыхлом матриксе, давая в результате слабо минерализованную и плохо упорядоченную ткань, которая однако, по-видимому, вполне адекватна для её каркасной функции во время перехода в кость. Фосфаты также являются ключом к отложению минерала в кости, где смесь из pyrophosphate и nucleotide triphosphate субстратов является источником фосфатов. Однако в этом случае минерализация происходит внутри определенной многоклеточной группы электрически связанных остеобластов. Отложение минерала является быстрым, плотным и векторным. Нет доказательств активного транспорта кальция. Первоначально отложенный минерал преобразуется по мере созревания, хотя механизм этого неизвестен.

Неправильный синтез или неправильное отложение коллагена нарушают образование кости, вызывая генетические заболевания, классифицируемые широко как osteogenesis imperfecta. Так, группа коллагеновых дефектов является наиболее распространенной среди генетических болезней, затрагивающих скелет, с частотой, по крайней мере, 1 % у людей. Эти болезни, которые воспроизводятся на генетически преобразованных мышах, характеризуются скелетной патологией, которая варьирует в пределах в зависимости от локуса и тяжести мутации, от незначительных или отсутствия отклонений до отсутствия минерализации черепа. Характерными признаками у человека являются osteopenia и повторяющиеся переломы и деформации. Однако фенотипические отклонения могут распространяться на др. органы, которые содержат типа I коллаген, включая зубы, склеры и косточки среднего уха. Напротив, не-коллагеновые белки, будучи устранены генетически могут или не могут вызывать видимые дефекты костей.

Остеоциты, внедренные в кость, не экспрессируют щелочную фосфатазу, но продуцируют osteopontins, а также др. матричные белки. Они общаются др. с др. и костной поверхностью посредством connexin-обеспечиваемых щелевых соединений между филлипоидальными выпячиваниями в канальцах. Остеоциты отвечают на изменения в сдавливании и растяжении. Молекулярные сенсоры для механической стимуляции не определены. Кандидаты включают voltage-gated Ca²⁺ каналы, β1 integrins и adhesion-associated К⁺ каналы. Общение посредством щелевых соединений может быть важным для передачи сигналов. Остеоциты живут длительный период, но в конце концов подвергаются апоптозу. Это определенно происходит, когда остеокласты деградируют матрикс. Помимо этого гибель изолированных остеоцитов может предопределять пространственные домены, где косвть нуждается в ремоделировании, таких как репарация микроразрушений (Han et aL. 2005). Когда остеоциты погибают в больших количествах, то бесклеточная кость быстро атакуется остеокластами. Это происходит при остеонекрозах, связанных с терапией высокими дозами glucocorticoid (Eberhardt, Yeagerjones & Blair, 2001).

(1) Transcriptional regulation of osteoblast differentiation

Последовательная дифференцировка остеобластов регулируется с помощью Runt homology domain транскрипционного фактора Runx2 и osterix, члена семейства транскрипционных факторов specificity protein-1 (Sp1), который обладает законсервированным zinc-finger регионом. Мутации потери функции в этих генах вызывают в разной степени неспособность замещать хрящевой скелет и дефектную оссификацию, osteo-chondrodysplasias. Др. дефекты ведут к дефициту костной массы или остеопорозу. Большинство мутаций с избыточной функцией вызывают увеличение костной массы. Однако использование только фенотипических отклонений у мутантных мышей часто затрудняет разделение эмбрионального и постнатального вкладов в скелетные аномалии. Дифференцировка модифицируется транскрипционными факторами, которые не специфичны для остеобластов, включа активность нижестоящих Wnt, BMP, TGFβ-семейств и др. рецепторов. Большинство ядерных транскрипционных факторов активируется ниже этих сигналов и имеют отношение к обороту кости. Однако важно оценить, какой набор транскрипционных регуляторов существенен для пространственной и временной точности образования кости (Table 1), После Runx2 и osterix терминальная дифференцировка остеобластов регулируется за счет активационного транскрипционного фактора-4 (ATF4), субстрата для ростового фактора, регулируемого киназой Rsk2 (Yang et at., 2004). Устранение ATF4 задерживает образование кости, фенотип воспроизводит Coflin-Lowry Syndrome (Yang et aL, 2004).

Будучи детерминированными остеопредшественники начинают экспрессировать главный транскрипционный регулятор Runx2 в результате подавления helix-loop-helix транскрипционного фактора Twist (Bialek el aL, 2004). Экспрессия Runx2 необходима для непосредственной дифференцировки кость-формирующих клеток и прежде всего остеобластов, хотя Runx2 продуцируется также прежде в хондроцитах и контролирует вместе с PTH-rP (Guo et ai, 2006) (сигнал паракринной дифференцировки, как полагают, являющийся прародителем PTH гормональной передачи сигналов) переключение хондроцит-остеобластной дифференцировки, указывая на тесное взаимоотношение этих клеток. Runx2 с Runx3 необходим для инициации образования эндохондральной кости. Поэтому делеция Runx2 у мышей или мутации у человека вызывают дефекты в замещении хряща на кость.

Table 1. Key transcriptional regulators in osteoblasts. The list includes proteins with indispensable roles in osteoblast differentiation and selected proteins active in expression of major osteoblast proteins, but is not comprehensive

Доминантная функция Runx2 благодаря cleidocranial dysplasia у гетерозигот по делеции Runx2 deletion. Даже незначительные Runx2 полиморфизмы вызывают дефекты в пределах от высокой костной массы (Doecke et aL, 2006) до измененной геометрии бедренных костей (Ermakov a aL, 2006).

Runx2 является платформой для модификаторов цитокинов и гормонов при созревании остеобластов. Это соответствует его партнерам по связыванию и ко-модуляторам. Напр., Runx2 может быть активирован с помощью Smads, которые фосфорилируются в ответ на BMPs и TGFβ. Это является критическим; мутации, разрушающие Smad-связывающий домен в гене Runx2 вызывают тяжелые черепно-лицевые деформации, даже если Runt домен сохраняется. Напротив, PTH и FGFs вызывают фосфорилирование Runx2, а TNFα ведет к ubiquitination Runx2 посредством лигаз Smurf-1 и -2 (Kaneki et aL, 2006). Физиологические последствия последних путей неизвестны. Соединение Runx с ДНК с партнером, CBFβ, обязательно для нормального образования кости (Miller et al., 2002). Несмотря на диапазон возможных молекулярных пермутаций и вторичных модификаторов, удивительно. как четко Runx2 определяет границы программы остеогенной генной транскрипции. Чтобы модифицировать базовую программу, Runx2 формирует мультимерные комплексы с ДНК и её наборами коактиваторов и корепрессоров. В зависимости от добавочных стимулов в разных компартментах матрикса (see Fig. 2), степень дифференцировки остеобластов и активность продукции матрикса, варьирует. Существует дополнительный уровень внутриклеточной организации с молекулами, такими как p300 и histone acetyl transferases, которые ремоделируют пространственные домены хроматина локально и по времени, управляя способом тонкой модификации паттерна генной экспрессии.

Osterix (Osx) также является облигаторным транскрипционным фактором в дифференцировке остеобластов. Подобно Runx2, экспрессия osterix регулируется анаболическими сигналами, BMP-2 и IGF-1. Как и Runx-дефицитные мыши, мыши, лишенные osterix, не образуют кости (Nakashima et al., 2002). Однако, Osx-дефицитные мыши обладают нормальными уровнями Runx2, указывая, что osterix находится ниже Runx2. В отличие от Runx2, osterix д. формировать комплекс с nuclear factor of activated T-cells (NFAT) транскрипционным фактором NFAT2 (Koga et aL 2005), чтобы обеспечить osteoblastogenesis. NFATs были идентифицированы в лимфоцитах. Они регулируют транскрипцию во многих клетках, включая остеобласты и остеокласты. Они дефосфорилируются с помощью calmodulin-регулируемой phosphatase calcineurin. Делеция NFAT2 в остеобластах снижает образование кости, т.к. обнаруживается недостаточность Aα изоформы calcineurin (Sun et al., 2005). Напротив, избыточная экспрессия calcineurin Aα усиливает дифференцировку остеобластов и образование кости (Sun et al,, 2005). Последний механизм может лежать в основе острой потери кости вследствие органного трансплантата. Драматическое снижение формирования кости наблюдается у пациентов, получающих иммуносупрессирующие ингибиторы calcineurin (Epstein et al., 2003). Потеря кости при ингибировании calcineurin может быть осложнена тем фактом, что глюкокортикоиды, которые также вызывают потерю кости, часто применяют вместе с ингибиторами calcineurin. Однако, по крайней мере, частично потеря пост-трансплантационной кости может быть приписана ингибированию активности calcineurin и последующим эффектам на передачу сигналов NFAT2.

III. WNT AND BMP SIGNALS DEFINE WHERE BONE FORMATION OCCURS

Поскольку RunX2 и osterix предопределяют раннюю и позднюю дифференцировку остеобластов, то более высокий уровень организации регулирует, где эта дифференцировка будет происходить. Недавние исследования показали, что Wnt3a часы являются критическими для предопределения сегментации позвоночника, а локальная экспрессия BMPs является критической для разделения скелетных элементов на границах (Aulehla & Herrmann, 2004; Storm & Kingsley 1999).

Каноническая передача Wnt и β-catenin является критической для развития и ремоделирования скелета, соотв. Первые указания на связь передачи сигналов Wnt с биологией кости получены с открытием, что инактивирующие и активирующие мутации низкой плотности lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) рецептора вызывают синдром остопороз-псевдоглиомы и фенотипы с высоким содержанием костной массы. Недавние исследования приписали фенотип высокой костной массы мутации избыточной функции G171V , редуцирующей сродство Lrp5 рецептора с его физиологическим ингибитором Dickkopf белком Dkk1, делающим неограниченную передачу сигналов ниже (Zhang et at., 2004). В противоположность чисто скелетному фенотипу мутаций Runx2 , инактивация Lrp5 вызывает офтальмические аномалии помимо остеопороза. В отличие от Runx2, Lrp5 не является доминантной и гетерозиготы обнаруживают лишь незначительные дефекты в виде остеопороза (Hartikka et al., 2005). Lrp5, единожды пронизывающий трансмембранный рецептор, взаимодействует с frizzled рецепторным комплексом, чтобы ингибировать фосфорилирование β-catenin с помощью glycogen synthetase kinase-3β (GSK3β). Т.к. фосфорилированный β-catenin чувствителен к ubiquitin-обеспечиваемой деградации, то ингибирование GSK-3β делает возможным накопление β-catenin и его проникновение в ядро. Активированный β-catenin затем взаимодействует кооперативно с Tcf/Lef транскрипционными факторами, чтобы стимулировать дифференцировку остеобластов. Мутации в Wnts, устранение Wnt корецепторов Lrp5 или Lrp6, или использование Wnt ингибиторов (sclerostin, растворимые frizzled-related proteins fsFRPs), Wnt inhibitory factors (Wif) и Dickkopf family Wnt модуляторы, Dkk1 и Dkk2, снижают остео-бластогенез и формирование кости (Bodine et at.. 2004; Tian et al, 2003; Li et al, 2005; Semenov; Tamai & He. 2005).

Разные Wnts обладают разным действием на остеобласты. Неясно, как разные Wnts обусловливают альтернативные исходы, но, по-видимому, это связано как со временем клеточного ответа, так и с одновременной передачей сигналов, которые изменяют пути клеточных реакций так, чтобы активировать Wnt сигнал. Wnt10b принимает решение давать остеобласты в противовес адипоцитам, путем активации Runx2, osterix и Dlx5, но супрессируя peroxisome proliierator-activated receptor (PPAR)γ и CCAAT-enhancer-binding protein (C/EBP)α. Wnt3a и 5a предупреждают апоптоз (Almeida et at., 2005). Кроме того, β-catenin, совместно с ранним B-cell factor (EBF)-2, способствует экспрессии osteoprotegerin, растворимого TNF рецептора, который связывает TNFs, включая TRAIL и, что важно., RANKL (Glass et at., 2005: Kieslinger et al., 2005). β-catenin или EBF2 нулевые мыши, т.о., обнаруживают плохое образование кости и усиленную резорбцию кости (Kieslinger et al., 2005). Фактически, избирательная делеция Tcf-1 или β-catenin в остеобластах дают мышей с нормальным количеством остеобластов, но с повышенной активность остеокластов (Glass & Karsenty 2006). далее. по крайней мере, один из Wnts, Wnt3a, который предупреждает апоптоз остеобластов и участвует в ранней сегментации аксиальной соединительной ткани, которая д. стать позвоночным столбом (Aulehla & Herrmann. 2004), усиливает свою активность в сосудистых перицитах, экспрессируя избыточно транскрипционный регулятор Msx2 (Towler et al, 2006). Сложные взаимодействия и экспрессия во многих тканях осложняют понимание передачи сигналов Wnt и подчеркивают, что Wnt реакции являются контекст-заисимыми в каждой данной клетке.

Др. главные сигналы, которые определяют границы, где д. происходить образование кости, включают BMPs. Рецепторы Smads, активируемые после связывания с BMP-2, BMP-4 или BMP-7 с BMPR1A/1B рецептором, гетеродимеризуются в ДНК-связанные Smads. которые совместно с др. регуляторами делают возможной транскрипцию генов. Транскрипционная регуляция с помощью Smads предопределяет раннюю детерминацию остеобластов, прежде всего, в ответ на производные остеобластов BMPs. Существует значительная перекрываемость BMPs, причем многие из этих сигналов оказывают те же самые эффекты на остеобласты благодаря взаимодействию с одними и теми же рецепторами. Эта система важна, т.к. высоко локализованная экспрессия BMPs определяет границы костей во время эмбриогенеза и способствует активности, делая возможной эту селективную экспрессию множества генов, чтобы содействовать сходным функциям, но в разных местах (Storm & Kingsley, 1999). Некоторые BMPs, включая BMP-2 и BMP-4 являются мощными индукторами остеогенеза, но они также запускают и синтез ингибиторов, включая noggin и chordin, которые связывают BMPs и предупреждают неограниченное действие BMP (Wu et aL 2003). Пониженное действие BMP при избыточной экспрессии noggin или у мутантных Smad мышей ведет к снижению образования кости и к остеопении (Wu et al., 2003). Напротив, чересчур активная передача сигналов BMP вызывает образование эктопических костей, как это наблюдается при crippling болезни, fibrodysplasia ossificans progressiva (Shore et al, 2006).

IV. THE DERIVATION OF THE OSTEOCLAST

Остеокласты являются многоядерными клетками, уникальными по своей способности резорбировать минерализованную ткань. Их происхождение прослеживается до костистых рыб, которые дают растворимый лиганд для parathyroid рецептора (чьим наиболее примитивным онтогенетическим лигандом является PTH-rP), секретируемый с помощью кальций ощущающего gill (жаберного) органа. Этот gill орган является предшественником parathyroid железы. которая продуцирует paradiyroid hormone, PTH, в ответ на снижение в сыворотке активности кальция у живущих на суше позвоночных. PTH стимулирует костные клетки рекрутировать макрофаги, чтобы деградировать минерализованные кости и хрящи. Эти клетки адаптировались в многоядерные клетки, которые экспрессируют огромные количества вакуолярного типа H⁺-ATPase на поверхности минерализованной ткани, чтобы растворить костный минерал, который является фосфатом и гидроксидом кальция, hydroxyapatite.

Активность остеокластов, с этой точки зрения, интегрирована в скелетный морфогенез и реструктуирование. Избыточная общая активность остеокластов ведет к потере кости и остеопорозу. Фокальная активность остеокластов вызывает Paget's bone болезнь, опухолевый osteolysis, различные arthritides и перидонтальную болезнь. Остеокласты дифференцированы окончательно и сохраняют свои характеристики до тех пор, пока они не подвергнутся апоптозу. Гематопоэтические стволовые клетки дают несколько терминальных типов клеток, включая остеокласты, макрофаги, лимфоциты и дендритные клетки. Эти типы клеток обладают общими регуляторными механизмами. Самой ранней ступенью в остеокластогенезе является детерминация предшественников стволовых клеток, которая индуцируется с помощью erythroblast transformation specific (ets) транскрипционного фактора, члена семейства family member PU.1 (Spi-1), ранее идентифицированного как B-клеточный транскрипционный модулятор. Примерно в это же время клетки приобретают c-fms рецептор и т.о., подвергаются пролиферации в ответ на macrophage colony stimulating factor (M-CSF или CSF-1), происходящий из стромальных клеток и остеобластов. Фосфорилирование некоторыми киназами, особенно важно, Src, Grb2 и PI3-киназой, приводит к активации cyclin D , чтобы вызвать пролиферацию. M-CSF также активирует c-Сbl позволяя ей ubiquitylate и направлять на деградацию про-апоптический белок Bim (Akiyama et al, 2003). Этот механизм гарантирует жизнеспособность клеток. Удаление негативного регулятора M-CSF, SHIP, дает в результате многочисленные остеокласты (Takeshita et al., 2002).

С этой точки зрения B-лимфоциты могут быть сформированы после соотв. стимуляции. Однако с появлением c-fos и RANK, предшественники не могут больше формировать лимфоциты. Фактически, RANKL, из стромальных клеток и остеобластов является обязательным для эффективного развития остеокластов. По крайней мере, у человека кость-деградирующие клетки дифференцируются с TNFα, рецептор для которого экспрессируется остеокластами и активность которого перекрывается с таковым для RANK. Однако эти клетки меньше и менее активны, чем нормальные остеокласты, продуцируемые с RANKL (Kudo et al, 2002). действие RANKL ограничено довольно широко распространенным decoy рецептором, osteoprotegerin, продуцируемым остеобластами и многими др. клетками. Osteoprotegerin связывает также TRAIL (Emery el al, 1998) и возможно др. белки семейства TNF. Разнородность decoy рецепторов не является необычной. Большей частью, лиганды для TNFs являются связанными с мембранами локальными сигналами и decoy рецепторы служат для ограничения передачи сигналов в намеченные локальные ниши. В дополнение к RANK и M-CSF, дифференцировка остеокластов нуждается в дополнительных стимулирующих сигналах от immunoreceptors, TREM2 или OSCAR (Koga et al., 2004). Когда RANK активирован, он рекрутирует docking (стыковочный) белок TRAF-6 на свой цитоплазматический домен. Это обусловливает активацию NF-кВ и mitogen-activated protein (MAP) киназы за счет сложной последовательности событий, которые находятся за пределами темы обзора. Параллельно обладающие immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) адапторы, DAP12 или FcRγ, рекрутируют spleen tyrosine kinases (Syk), которая активирует phospholipase Cγ, чтобы высвобождать Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ (Mocsai et al., 2004). Высвобождение Ca²⁺ активирует calmodulin-регулируемую фосфатазу calcineurin, которая дефосфорилирует транскрипционный фактор NFAT2 (Takayanagi et al., 2002). NFAT2 подвергается транслокации в ядро и вместе с c-fos, умножает экспрессию критических для остеокластов генов, включая сам NFAT2 (Gohda et al, 2005; Kim et al, 2005; Asagiri et al., 2005) . Генетическая делеция любой из этих молекул элиминирует osteoclastogenesis. Подобно RANKL и RANK нокаутным мышам, как Syk-дефицитные мыши, так и DAP12/FcRγ двойные нокауты лишены остеокластов (Mocsai et al, 2004). Эмбриональные предшественники из летальных NFAT2 нокаутов не могут формировать остеокласты ex vivo. Однако избыточная экспрессия NFAT2 дает остеокласты даже в отсутствие RANKL (Whyte, 2006) , указывая, что NFAT2, наиболее дистальная мишень, не только не безразлична, но и даже достаточна для osteoclastogenesis. Ключевые пути, участвующие в дифференцировке остеокластов, приведены на Fig. 4.

Инактивирующие мутации RANKL и RANK не идентифицированы у людей. Такие мутации д. также затрагивать иммунное развитие. Напротив, конституитивная активация RANK наблюдается при редких аутосомно доминантных системных osteolytic синдромах человека. Сюда входят familial expansile osteolysis, семейная форма Paget's болезни и expansile skeletal hyperphosphatasia (Whyte, 2006). Недостаточность osteoprotegerin при аутосомно рецессивных инактивирующих мутациях TNFSF11B гена вызывает ювенильную Paget's ,боезнь (Whyte, 2006). Потеря высокого оборота кости, лизис зубов у взрослых, фокальные повреждения аппендикулярных костей и глухота в детстве являются признаками этой болезни.

(1) The biochemical mechanism of osteoclast bone degradation

Остеокласты создают кислый микро-компартмент на кости, чтобы растворять костный минерал. Клетки прикрепляются к кости с помощью

Fig. 4. Selected osteoclast differentiation pathways. In vivo, normal signals for osteoclast differentiation are mostly cell-bound proteins. In vitro, media with selected serum, ligands for Fms and RANK may be sufficient for differentiation, although activation of Fey is also required as a co-stimulus (not diagrammed, see text). Many intermediate steps and cross-relationships of pathways exist in addition to those diagrammed. Some major intracellular proteins are indicated, but many steps in addition to the molecules named are involved; for example, numerous steps, including ubiquitination of IkB and proteasomai degradation, are required for NF-кВ activation.

мембранных integrins, главным образом αVβ3, связывающими RGD мотивами матричных белков. Передача сигналов наизнанку с помощью integrins вместе с разнообразными вторичными белками, включая kinases c-src и Syk и гуаниновый нуклеотид-связывающий фактор Vav-3 (Faccio et aL, 2005) регулируют дальнейшую клеточную активность. Цитоскелет остеокластов и прикрепление интегринов располагаются по кругу для тесного соединения с субстратом. Хотя механизмы ремоделирования цитоскелета неполностью понятны, всё же некоторые динамические молекулярные комплексы регулируют прикрепление остеокластов. Напр., αvβ3 активируют c-src и Pyk-2, которые рекрутируют мульти-сайтовые адапторы c-Cbl и СЫ-b, это сопровождается активацией PI3-киназы и GTPase dynamin (Bruzzaniu et aL, 2005). Сходным образом, образуются комплексы между gelsolin и integrin-ассоциированными белками, включая vasodilator-stimulated phosphoproteins (VASPs), ITАМ-обладающие белки и c-src/Syk кооперирующие адапторы, хотя и за счет неизвестных механизмов.

Слипчивые клетки поляризуются за счет примыкающего к кости (apical) растяжения мембраны. Эта мембрана, наз. ruffled (рифленный) край, обязана своим видом на поперечном сечении, является каркасом для больших количеств вакуолярных H⁺-ATPase, которые управляют секрецией кислоты. Вакуольная H⁺-ATPase экспрессируется в ацидифицированных вакуолях и др. мембранах, транспортирующих кислоту, включая дистальные почечные канальцы, но форма из остеокластов имеет уникальную субъединицу, которая необходима для её экспрессии в ruffled мембране, a3 субъединица (TCIRG). Вакуольная, электрогенная H⁺-ATPase качает протоны поперек рифленого края, вызывая падение общесредовой pH внутри резорбтивных лакун (Silver, Murrills & Etherington, 1988). Это растворяет костный минерал и позволяет энзимам с кислым оптимумом, таким как cathepsin K, расщеплять коллаген и высвобождать пептиды, которые подвергаются трансцитозу и выбрасываются на дорсо-латеральной поверхности остеокластов. Костный коллаген жестко связан поперечно и пептиды содержат поперечные связи, не деградируемые с помощью proteinases. Количество этих содержащих поперечные связи фрагментов в сыворотке и моче может быть использовано для определения скорости резорбции кости. Электрогенная активность H⁺-ATPase сбалансирована за счет транспорта анионов. Существует несколько транспортеров анионов в мембранах остеокластов, и недавно было установлено, что недостаточность широко экспрессируемого chloride транспортера, GLCN7 вызывает остеопетроз (Kornak et aL, 2001). CLCN7 является почти определенно chloride-proton antiporter скорее, чем chloride канал, исходя из свойств гомологов из того же самого семейства (Picollo & Pusch, 2005). Это требует, по крайней мере, двух chloride транспортеров для секреции кислоты остеокластами, т.к. chloride-proton antiporter д. функционировать без H⁺ градиента (Diewald et aL, 2002).

(2) Osteoclast defects

Остеопетроз группа родственных болезней с дефектами резорбции кости. Это ведет к накоплению плотного минерализованного хряща с первичным костным матриксом. В своей тяжелой форме болезнь устраняет образование костного мозга с extramedullary гематопоэзом и анемией и вызывает перинатальную слепоту из-за неспособности ремоделирования трактов зрительного нерва. При менее тяжелых формах сохраняется частичная функция остеокластов, совместимая с жизнью, но с ломкими "мраморными костями", склонными к переломам (Li et aL, 2006). Как отмечалось выше основной причиной остеопетроза у человека являются дефекты функции остеокластов скорее, чем их образования, имеется однако множество описаний osteoclast-poor osteopetrosis, но они не были ещё отслежены до специфических онтогенетических генных дефектов. Примерно половина из тяжелых случаев остеопетроза имеет дефекты в a3 субъединице V-ATPase TCIRG1 или в chloride транспортереr CLCN7 (CLC-7). Сегодня единственной эффективной терапией тяжелого остеопетроза является трансплантация костного мозга. Её использование, сопряженное с высокой смертностью из-за ограничения в приживлении, и graft-versus-host болезни, ограничено случаями, при которых ожидается фатальный исход в отсуствие лечения (infantile malignant osteopetrosis). Pycnodysostosis или болезнь Toulouse-Lautrec, является менее тяжелой sclerotic болезнью. Она вызывает нарушения роста и ломкость костей из-за дефицита активности cathepsin К с плохой деградацией матричных белков. Др. случаи легкого остеопетроза включают некоторые типы недостаточности carbonic anhydrase IIс легким остеопетрозом и дефектами в ацидификации мочи. В остеокластах carbonie-anhydrase-катализируемое превращение CO₂ в carbonic кислоту, увеличивает доступность кислоты и базовых эквивалентов для деградации кости и для chloride-bicarbonate обмена, поддерживает в остеокластах внутриклеточный pH во время секреции кислоты. Редкий синдром с нарушенной резорбцией кости вызывается мутацией стоп кодона в гене IKKγ . Это нарушает передачу сигналов NF-kB , вызывая anhidrotic ectodermal dysplasia, иммунонедостаточность и остеопетроз (Doffmger et aL, 2001).

V. REGULATION OF BONE RESORPTION BY LOCAL SIGNALS

Тонкий баланс между формированием кости и относительно быстрым процессом резорбции является обязательным условием для поддержания целостности скелета во время взрослой жизни. Как коротко упоминалось в Section I, при hypocalcemia и metabolic acidosis скелет приносится в жертву поддержания кальция и pH в сыворотке даже если это доводит скелетные массы до уровней, вызывающих переломы (Fitz et aL, 1907). Этот факт, который известен более века, часто не принимается во внимание, но он отражает быструю потерю кости при многих типах метаболического ацидоза. PTH составляет исключение, которое подчеркивает правило дифференцировки костных клеток. PTH управляет формированием остеокластов и матричным синтезом остеобластами в качестве генерального ускорителя. Растворение матричного минерала преобладает, но остеокласты не реагируют на PTH, этот механизм обеспечивается посредством остеобластов и их предшественников, реагирующих на растворимый PTH вторичным синтезом RANKL (Huang et aL. 2004), помимо многих др. индуцируемых PTH изменений. Примечательно, в частности, что PTHrP, родоначальный предшественник PTH, интегрируется в и существенен для формирования скелета (Kronenberg, 2006; Guo et aL, 2006). Т.о., растворимый PTH формирует чистый "accelerator", поскольку он использует предсуществующий сайт-специфический механизм, который позволяет контролировать и на организменном уровне. Сходным образом, воспалительный рост, дифференцировка и апоптозный фактор TNFα участвуют в системных заболеваниях, связанных с воспалением, включая ревматоидные артриты и возможно некоторые формы остеопороза и он может появляться в достоверных количествах, как растворимый фактор, хотя почти все TNFs (исключения составляют VEGI/TL1A, который не имеет трансмембранного домена, и TNFα, который не удаляется эффективно) появляются как трансмембранные белки и быстро очищаются и удаляются с помощью растворимых "decoy" рецепторов, включая osteoprotegerin, который соединяется с RANKL и TRAIL, если они высвобождаются с помощью активности proteinase (Bodmer, Schneider & Tschopp, 2002). Этот факт часто забывают, поскольку столь много работ проделано с синтетическими белками, а он лежит в основе изысканного сайт-управляемого образования остеокластов (Fig. 2), которые часто наблюдается на одной стороне трабекулы, тогда как остеобласты добавляют кость к др. , перемещая тем самым трабекулу в пространстве, позволяя ей оставаться ориентированной в пространстве вдоль линий сдавливания в кости.

Растворение hydroxyapatite с помощью HCl поднимает концентрацию Ca²⁺ приблизительно до 40 мМ в пространстве резорбции остеокластами (Silver el al, 1988). Это активирует сенсор Ca²⁺ на поверхности остеокластов, вызывая высвобождение Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ, что сопровождается открытием возможности притока Ca²⁺ (Zaidi, Moonga & Huang, 20Q4; Moonga et al, 2002; Zaidi et al, 1989). Возрастание цитозольного уровня Сa²⁺ активирует индуцибельную nitric oxide synthase, которая в свою очередь, генерирует nitric oxide локально, позволяя остеокластам отсоединиться и оттянуться назад (Maclntyre et al., 1991). Возобновление резорбции сопровождается Ca²⁺-обусловленным синтезом и локальным высвобождением interleukin-6 из ингибированных остеокластов (Adebanjo et al., 1998). Interleukin-6 в свою очередь определяет границы этой ингибирующей обратной связи, позволяя остеокластам возобновить резорбцию. Т.к. физиология контроля восприятия Ca²⁺ vis-a-vis остеокластами установлена, то мы первоначально не отнесли эту функцию к молекулярной сущности. Вряд ли это parathyroid-cell Ca²⁺ рецептор. Гомологичное клонирование оказалось неспособным идентифицировать сходную молекулу в остеокластах и остеокласты оказываются нормальными у мышей, лишенных parathyroid Ca²⁺ рецептора. Более того, calcimimetics не нарушают функции остеокластов, а потребности в восприятии Са²⁺ в паратироидных клетках и остеокластах количественно различны (Zaidi et al., 2004).

Несмотря на это, мы полагаем, исходя из молекулярных и электрофизиологических доказательств, что существует типа 2 ryanodine рецептор, расположенный на мембране остеокластов, который служит как Ca²⁺ канал и как Ca²⁺ сенсор (Moonga et at., 2002; Zaidi et al., 1995). Повышенная резорбция кости у CD38 нокаутных мышей подтверждает это мнение. У этих животных cyclic ADP-ribose (физиологический агонист ryanodine рецепторов) снижена (Sun etal., 2003). CD38 является ADP-ribosyl cyclase, которая катализирует превращение промежуточного метаболита NAD⁺ в циклическую ADP-ribose. Мы установили, что CD38 воспринимает NAD⁺, генерируемый как следствие метаболической активности в остеокластах, возникающей в результате их интенсивной подвижности и транспорта кислоты. Путем превращения NAD⁺ в циклическую ADP-ribose (т.е., путем восприятия метаболического истощения) CD38 по существу связывает метаболическую активность с восприятием Ca²⁺ (Sun et al, 2002). Интересно, что цитокины, такие как TNFα, которые стимулируют резорбцию кости остеокластами, усиливают активность CD38. Это может позволить избыточность, чтобы защитить скелет от избыточной резорбции (Iqbal el ai, 2006a).

Значительное перекрывание существует при регуляции деградации кости с помощью цитокинов, включая про-резорбтивные эффекты IL-1, -6, -11, -18, TNFα, interferon-γ, также как PTH и oestrogen. Большинство цитокинов и гормонов действуют путем регуляции стромальными клетками продукции RANKL или osteoprotegerin. Др., включая IL-6 и IL-11, обладают общими нижестоящими сигнальными молекулами, такими как gp130. В общем, делеция большинства цитокинов не приводит к фенотипическим отклонениям в скелете. Ни один из большинства цитокинов не является хорошим лекарством, направленным на контроль костной массы. Однако , TNFα обычно повышен при некоторых состояниях потери кости и действует как общий ускоритель потери кости и его прямые эффекты на дифференцировку и активность остеокластов важны. Поэтому anti-TNFα терапия используется для лечения кость-повреждающих болезней, хотя это опасно, т.к. TNFα также важен для иммунной функции (Curtis et al., 2007).

VI. REGULATION OF BONE RESORPTION BY NEURAL MECHANISMS

Помимо гомеостаза кальция посредством PTH, и реакции локальных ростовых факторов на онтогенетические и гормональные стимулы нейроэндокринные сигналы регулируют непосредственно скелетную массу. Сюда входит нейрональные разряды и гипоталямическая регуляция (Zaidi, 2005). Эта нейрогуморальная регуляция является наивысшим уровнем регуляции за пределами межклеточных взаимодействий, используемых в развитии. Гомеостаз PTH/calcium и реакция на растяжение поддерживают микроархитектуру кости. Гипоталямус регулирует как образование, так и резорбцию кости негативно посредством симпатических разрядов (discharges) под центральным leptinergic контролем. Такие симпатические разряды негативно регулируют выход предшественников остеокластов из костномозговых ниш. Существует незначительное перекрывание в этих механизмах контроля высшего уровня и скелетные фенотипические отклонения возникают в результате дефектов любого из нейроэндокринных компонентов. Существует предположение, что непосредственная beta adrenergic реакция регулирует костную массу, но исследования показывают, что это вряд ли достоверно (Reid et ai, 2005; de Vries et al., 2007).

Демонстрация Karsenty с коллегами, что ЦНС регулирует костную массу (Ducy et al, 2000; Takeda et al., 2002) стала центральной для оценки нейральной регуляции скелета. Стимуляция нейронов, экспрессирующих leptin-рецепторы, с помощью центрально применяемого leptin нарушает формирование кости, редуцирует костную массу. Мыши, лишенные leptin или его рецептора, образуют большие костные массы. Эти находки устанавливают центральную leptinergic регуляцию кости, они подтверждены парабиотическими экспериментами. Не выявлено гуморальных эффектов, обеспечиваемых действием leptin на скелет. Однако рецепторы leptin были идентифицированы на костных клетках, это оставляет возможность, что регуляция периферическим лептином может всё же происходить, хотя продуцируемый на периферии leptin не выявлен. Leptin из жировых клеток супрессирует аппетит посредством гипоталямических рецепторов, чтобы регулировать массу тела. Анти-остеогенное действие центрального leptin не зависит от эффектов leptin на аппетит (Elefteriou et al, 2005). Мыши, лишенные нижестоящих leptinergic сигналов, α-melanocyte stimulating hormone или cocaine- и amphetamine-regulated transcript (CART), не имеют костных фенотипических отклонений (Elefteriou et ai, 2005). Более того, тощие leptin-дефицитные lipodystrophic мыши имеют высокую костную массу, фенотип, идентичный таковому тучных ob/ob мышей. Т.о., содержание жировой ткани не влияет на костную массу, по крайней мере, на этих моделях. Более того, ob/ob мыши обладают высокой костной массой несмотря на наличие hypercortisolism и hypogonadism. Эти данные строго подтверждают гипотезу, что эффекты центрального leptin не зависят от половых стероидов и продукции глюкокортикоида.

Дополнительные исследования показали, что центральный leptinergic контроль осуществляется посредством периферических симпатических разрядов (discharges), которые модифицируют активность остеобластов (Takeda et at, 2002). Мыши, лишенные адренэргического рецептора Adrb2 или синтетического энзима dopamine β-hydroxylase? имеют значительную костную массу и у этих мышей отсутствует ингибирующий эффект на образование кости центрально применяемого leptin (Takeda et aL, 2002; Elefteriou et aL, 2005). Сходным образом, β-adrenergic блокада увеличивает костную массу. Интересно, что Ardb2 нокаутные мыши обнаруживают усиленное образование кости и низкую резорбцию кости. Предполагается, т.к. остеокласты являются производными коротко живущих моноцитов и определенно не иннервированы, то эти эффекты leptin на резорбцию кости являются косвенными (Elefteriou et aL, 2005). Это скорее всего осуществляется за счет цитокинов, модулирующих остеокласты, в стромальных компонентах или в самих остеобластах. Т.к. точный механизм неизвестен, интересна связанная находка, что выход гематопоэтических стволовых клеток из костного мозга модулируется симпатическими разрядами, направленными на остеобласты (Katayama et aL, 2006). При потере симпатической активности у мышей, дефицитных по UDP-galactose: ceramide-galactosyltransferase, развитие предшественников остеокластов ослабляется. Т.о., leptinergic нейроны регулируют образование и резорбцию кости вместе с периферическими симпатическими нервами.

Предположено частие циркадного ритма в обороте кости путем адренэргической стимуляции, взаимодействующей с генами часов Per и Cry в остеобластах (Fu et aL, 2005). Мыши, лишенные Per или Cry, или с Per , делетированным только в остеобластах, имеют высокую костную массу и парадоксальное увеличение плотности кости, возникающее после центрального применения leptin. Эти гены обеспечивают антипролиферативное действие и симпатическое воздействие за счет ингибирования G1 cyclin (Fu et aL, 2005). Эти находки могут объяснить суточные вариации в резорбции кости у человека (Qyist et aL, 2002). Пока неясно, однако как центральная нейральная регуляция костной массы обеспечивается исключительно leptinergic и симпатическими механизмами. Anticholinergic и peptidergic нервы также могут участвовать. В самом деле, кости иннервируются Ad- и C-типа нервными волокнами, которые несут некоторые нейротрансмиттеры, включая neuropeptide Y (NPY) и calcitonin gene-related peptide (CGRP). CGRP обладает anabolic и антирезорбтивным действием (Zaidi et aL, 1987), тогда как роль NPYergic нервных окончаний не установлена (Baldock et aL, 2002; Elefteriou et at, 2003). Во всяком случае, потенциал для блокирования симпатических разрядов с помощью избирательного таргетинга кости β-,блокаторами остается. Было бы интересно проверить в клинике будут ли пациенты, получающие β-,блокаторы иметь повышенную костную массу.

Др. нейропептид, который также может экспрессироваться в эндокринных органах и который может регулировать скелетный гомеостаз, это calcitonin. Он вместе с паратироидным гормоном появляется у костистых рыб, чтобы регулировать резорбцию кости. В случае calcitonin, действие завершается активностью остеокластов. Calcitonin связывает определенный G-protein-coupled рецепторы на остеокластах. Он появляется у примитивных организмов, которые имеют предшественник минерализованного скелета, включая асцидии Stycia clava (Thorndyke and Probert, 1979). Calcitonin у высших позвоночных продуцируется G-клетками щитовидной железы, которые дифференцируются из клеток нервного гребня. Однако до сих пор неясно. является ли calcitonin функциональным антирезорбтивным гормоном у человека. Его делеция у мышей дает высокую скелетную массу скорее, чем остеопению (Zaidi, Moonga & Abe, 2002; Hoff et aL, 2002). Несмотря на это calcitonin эффективно используется как лекарство костных болей у людей. Однако парадоксально у пациентов с imedullary thyroid carcinoma, циркулирующий в крови calcitonin сильно увеличен, но увеличения костной массы не происходит. И у thyroidectomized пациентов с отсутствием практически циркулирующего calcitonin не развивается остеопороз. Т.о., у человека реакция костных болей на calcitonin возможно обусловлена главным образом реакцией центральных нервов, с непосредственным эффектом на оборот кости, in vivo, возможно являющимся остаточным. Мыши, дефицитные по amylin, родственному с calcitonin пептиду, дают остеопению (Dacquin et aL, 2004; Datta et aL, 1989).

VII. PITUITARY GLYCOPROTEINS AND THE REGULATION OF BONE MASS

Гипофизарная эндокринная ось также стимулирует образование кости посредством оси growth hormone/IGF-1 axis, и регулирует резорбцию кости позитивно и негативно посредством follicle stimulating hormone (FSH) и thyroid stimulating hormone (TSH). В частности гормоны из передней части гипофиза, гормон роста, TSH и FSH, также регулируют костную массу. Др. гормоны из периферических эндокринных органов 1,25-dihydroxyvitamin D3 и тироидный гормон описаны в др. месте (Mundy & Guise, 1999). Гормон роста является anabolic, но осуществляет свои эффекты посредством insulin-like growth factor-1 (IGF-1) из печени. Имеется прекрасная корреляция между костной массой и уровнями IGF-1 в сыворотке. чем между костной массой и гормоном роста в сыворотке (Yakar et aL, 2002). Генетический дефицит IGF-1 вызывает выраженную задержку роста и остеопению (Mohan and Baylink, 2005). Эти скелетные потери необратимы с помощью гормона роста, это подтверждает, что IGF-1 является активным физиологическим агентом. Однако инсулиновые рецепторы не влияют существенно на развитие кости (Irwin et al., 2006), хотя insulin receptor substrate-1 важен для оборота кости (Ogata et al.. 2000), а агонист peroxisome proliferator-activated recepior-Y rosigliiazone снижает образование кости и костной массы (Grey et al., 2007), так что этот вопрос сложен. В противовес непрямому действию гормона роста, устранение гена направляет эффекты TSH и FSH на резорбцию кости (Zaidi et aL, 2006). До сих пор ожидается, что эти гормоны сами регулируют секрецию thyroxine и половых стероидов в эндокринных органах мишенях. В частности, TSH снижает образование, функцию и жизнеспособность остеокластов путем воздействия на G-protein-coupled рецепторы на остеокластах (Abe et al., 2003). То, что этот скелетный эффект является доминантным и выраженным иллюстрируется тем, что вызываемые дефектом TSH рецептором гетерозиготные мыши являются osteopenic несмотря на нормальную функцию щитовидной железы (Zaidi et al., 2006). Сходным образом, FSH стимулирует образование и функцию остеокластов посредством FSH рецепторов на остеокластах, с высокой костной массой у гетерозиготных FSHβ нокаутов. которые имеют нормальную овариальную функцию (Sun et at, 2006).

Как TSH, так и FSH регулируют активность остеокластов ниже RANK, хотя точные механизмы изучены недостаточно (Abe et al., 2003; Sun et al., 2006). Далее экспрессия гипофизарных гликопротеиновых рецепторов в кости, хотя и продемонстрирована четко, может функционировать только в ограниченных условиях и может обнаруживать существенные межвидовые вариации (Blair, Wells & Isales. 2007). Главные механизмы кандидаты включают ингибирование с помощью TSH внутриклеточной киназы Janus N-terminal kinase (JNK) и предупреждение проникновения в ядро с-jun. Напротив, FSH стимулирует фосфорилирование extracellular signal-regulated protein kinase (Erk) и protein kinase В (Akt1) посредством ингибрующего G белка Gi2α. Пептиды противоположным образом затрагивают активацию NF-kB с помощью модулирования фосфорилирования его ингибирующей субъединицы I-кВ. Далее, TSH и FSH оказывают реципрокные эффекты на продукцию TNFα: TSH ингибирует, а FSH стимулирует TNFα Эти действия вносят вклад в анти- и про-osteoclastic действия двух гормонов ( Hase et al., 2006; Iqbal et al., 2006b), и могут иметь ключевое значение.

VIII. CONCLUSIONS

In bone development, local growth and differentiation factors establish the skeletal shape and the characteristics of its cell and tissue components.

Skeletal development follows a sequence that includes conserved elements of early differentiation for segmentation, regulated by hox genes.

Modeling of the skeleton uses a number of gradient sensitive mechanisms and seven transmembrane-pass protein recognition receptors, including PTHrP, Writ, and BMP signals, to regulate where skeletal elements are formed, and where mesenchymal tissue undergoes apopto-sis to form joint spaces.

All new bone is produced and destroyed by new cells differentiating from stem cells. This is a continuous process that occurs throughout life. Thus, the regulation of skeletal turnover, an important biological and medical issue, is logically considered in the context of differentiation.

The growdt factors that control the development of bone also regulate skeletal replacement and use of skeletal mineral for metabolic homeostasis, in some cases by direct adaptation such as the use of PTH for regulation of bone degradation rate using receptors also involved in bone modeling.

While programmed development and local regulation are critical to bone modeling and to regulation of turnover, neural and neuroendocrine regulation of bone integrates bone metabolism with activity of the organism as a whole. These mechanisms reflect, in part, direct signalling by pituitary glycoproteins that are largely known from specialised endocrine regulation but where more primitive direct regulation of skeletal metabolism is retained.

The Developmental Basis of Skeletal Cell Differentiation and the Molecular Basis of Major Skeletal DefectsHarry C. Blair, Mone Zajdi, Christopher L.-H. Huang and Li SunBiological Revievs 83 (2008) 401-415 © 2008 The Authors Journal compilation © 2008 Cambridge Philosophical Society

The Developmental Basis of Skeletal Cell Differentiation and the Molecular Basis of Major Skeletal Defects
Harry C. Blair, Mone Zajdi, Christopher L.-H. Huang and Li Sun
Biological Revievs 83 (2008) 401-415 © 2008 The Authors Journal compilation © 2008 Cambridge Philosophical Society