Позвонки происходят из эмбриональных структур, наз. сомитами, которые формируются синхронизированным и ритмическим способом из pre-somitic mesoderm (PSM). Образование сомитов нуждается в молекулярном осцилляторе, наз. сегментационными часами, который контролирует ритмическую транскрипцию циклических генов вдоль PSM⁵. Периодические сигналы от осциллятора превращаются в метамерный набор сомитов за счет пошагового механизма, который базируется на преодолении порога (наз. фронт детерминации) передачи сигналов fibroblast growth factor (Fgf) и Wnt. Осцилляции сегментационных часов и детерминация фронта производства синхронизированы на обеих сторонах эмбриона, давая приблизительно одновременно продукцию сомитов из левой и правой части PSM. Retinoic acid (RA) производное витамина A участвует в контроле симметрии сомитогенеза^1-4. Эмбрионы позвоночных, дефицитные по Raldh2 (также известному как Aldhla2), биосинтетическому энзиму RA, обнаруживают лево-правостороннюю десинхронизацию сомитогенеза⁵. Ретиноевая кислота соединяется гетеродимерами, которые формируются retinoic acid receptors (RARs) и retinoid X receptors (RXRs), которые связываются со специфическими последовательностями ДНК - retinoic acid response elements (RAREs). Связывание ретиноевой кислоты ведет к рекрутированию комплексов коактиваторов, содержащих активности histone acetyltransferase, приводя к транскрипционной активации RA-регулируемых генов⁶.

У позвоночных семейство atrophin белков состоит из двух родственных белков: atrophin 1 (Atn1) и Rere^7,8. Rere, как было установлено, действует как транскрипционный ко-репрессор, взаимодействуя с Hdac1/2 (refs 9, 10). Rere может также ассоциировать с рЗ00 (ref. 11), указывая тем самым. что он может быть также частью транскрипционного активационного комплекса. Мыши, мутантные по Rere, такие как ENU-индуцированные openmind (om) мутанты, обнаруживают эмбриональную летальность и обнаруживают разнообразные дефекты развития, включая нерегулярное вычленение сомитов⁹. Здесь мы впервые исследовали дефекты сомитогенеза у om мутантных эмбрионов мыши. У om эмбрионов сомиты продуцируются синхронным способом на левой и правой сторонах вплоть до стадии 6 сомитов (Fig. 1a, b and data not shown). После этой стадии приблизительно половина мутантов обнаруживает асимметричные полоски сомитного маркера Uncx4J (известен также как Uncx) (Fig. 1r), так что сомитогенез выглядит задержанным в одном-трех сомитах правой стороны (n - 13; Fig. 1c-e). Эта десинхронизация сомитогенеза наблюдается до тех пор, пока эмбрион не достигнет ст. 13-сомитов (Fig. 1f). У контрольных эмбрионов, экспрессия циклических генов lunatic fringe (также известного как Lfng) и hairy и enhancer of split 7 (Hes7)^12-14 синхронизирована на обеих сторонах эмбриона (Fig. 1g and Supplementary Fig. 1a). У мутантных эмбрионов перед стадией 7 сомитов экспрессия Lfng и Hes7 точно скоординирована на левой и правой PSM (data not shown). Однако у мутантов на ст. 7 -13 сомитов экспрессия Lfng и Hes7 становится четко асимметричной, при этом полоски Lfng и Hes7 оказываются локализованы более кзади на правой по сравнению с левой PSM (Fig. 1k and Supplementary Fig. 1d). Сходное поведение наблюдается для циклических генов сигнальных путей Wnt и Fgf, Axin2 (ref. 15) и Snaill (также известен как Snail)¹⁶ (Supplementary Fig. lb, c, e, f). У om embryos, экспрессия Fgf8 расширяется рострально (Fig. 1i, m), а экспрессия Raldh2 сдвигается кпереди в правой части параксиальной мезодермы (Fig. 1h, l). Мы анализировали экспрессию mesoderm posterior 2 (Mesp2), гена, участвующего в позиционировании границ сомитов и который образует симметричные полоски на уровне детерминации фронта¹⁷. У om мутантов, которые достигали ст. 7 сомитов, экспрессия Mesp2 сдвигалась кпереди на правой PSM (Fig. 1j, n). Хотя эти наблюдения демонстрируют, что между формированием сомитов 7 и 13 у om мутантов отсутствует лево-правосторонняя координация осцилляторного поведения циклических генов и наблюдается регрессия детерминации фронта. Эти результаты десихронизации сегментационного каскада, ведут к задержке образования сомитов в правой ростральной части PSM.

Спеифичность дефектов для правой стороны заставила нас исследовать пути передачи лево-правосторонних сигналов у om эмбрионов¹⁸. У всех проанализированных мутантов симметричная экспрессия Nodal и его генов мишеней-Lefty 1-2 и Pitx2, а также sonic hedgehog (Shh)-сохраняется (Supplementary Fig. 2a-h and data not shown). Мы проверяли эффект реверсии left-right situs на латерализацию дефектов сомитов, используя мутации inversus viscerum (iv) мыши, которые рандомизируют situs determination¹⁹. In iv^-/- om/+ эмбрионов сомиты формировались синхронно (Fig. 1o). У iv^+/+ om/om и iv^+/-om/om асимметричные эмбрионы на правой эмбриональной стороне обнаруживали меньше сомитов, чем на левой (Fig. 1p, s and data not shown). Однако на 7-13-сомитной стадии iv^-/- om/om десинхронизированные эмбрионы обнаруживали в половине случаев специфичные для правой стороны дефекты, тогда как в др. половине сомитогенез задерживался на левой стороне эмбриона (Fig. 1q, s). Следовательно, эти результаты указывают на то, что дефект латеральности сомитов у om мутантных эмбрионов контролируется с помощью аппарата лево-правосторонней передачи сигналов.

Фенотип сомитогенеза у omдовольно сходен с таковым у Raldh2-нулевых мутантных эмбрионов1,2,4. Чтобы исследовать потенциальные генетические взаимодействия между Rere и RA путем, мы скрещивали om мутантов с Raldh2-дефицитными мышами. У Raldh2^+/- om/+ транс-гетерозигот сомитогенез нормальный (Fig. 2a). Однако Raldh2^+/- om/om мутанты обнаруживают десинхронизацию сомитов. напоминающую таковую у om одиночных мутантов(Fig. 2b), the Raldh2^-/- om/ + эмбрионы обнаруживали более строгие дефекты, чем Raldh2-нулевые мутанты (Fig. 2c, d). У 50% (6 out of 12) таких эмбрионов сомитогенез прогрессировал на левой PSM, но не наблюдалось четких сегментированных структур на правой стороне (Fig. 2d). У Raldh2^-/- om/om двойных мутантов сомитогенез затухал после образования первых пяти пар сомитов (Fig. 2e). Следовательно, эти данные демонстрируют сложные генетические взаимодействия между om и Raldh2 мутантами мыши. Мы скрещивали om мутантов с чувствительным репортером к присутствию эндогенной RA, RARE-LacZ репортерные мыши²⁰. Активность передачи сигналов ретиноевой кислоты у om эмбрионов была тяжело подавлена в туловище эмбриона и в регионах переднего мозга (Fig. 2h,i), указывая тем самым, что у om потеря функции Rare влияет на передачу сигналов RA у эмбрионов. Мы также трансфицировали F9 клетки линии эмбриональной карциномы Rere и RARE-luciferase репортером. После воздействия RA, активность передачи сигналов RA увеличивалась в присутствии повышенных количеств Rere (Fig. 2j). Эти результаты идентифицируют Rere как новый компонент, который действует как позитивный регулятор активации передачи сигналов RA у эмбрионов мыши.

Затем мы использовали метод иммунопреципитации хроматина (ChIP) на F9 и NIH3T3 клетках, чтобы проанализировать соединение Rere с промотором Rarb, хорошо охарактеризованная RA мишень, которая содержит RARE, связывается с помощью гетеродимеров RARs и RXRs^21,22. Как Rere, так и Rarα оккупируют промотор Rarb в F9 и NIH3T3 клетках (Fig. 3a, b). Закрепление Rere на промоторе усиливается в F9 и NIH3T3 клетках после обработки 0.1 and 1 µМ RA, соотв. (Fig. 3a, b). NIH3T3 клетки обнаруживали более высокий уровень базовой передачи сигналов RA, чем F9 клетки, это можно объяснить более высоким уровнем оккупации Rere без добавления экзогенной RA. Многочисленные Rere локализуются на RARE промотора Rarb, а также в регионах в 3 kilobases (kb) выше и в 3kb ниже RARE, где они в меньшем количестве используются для связывания (data not shown). Эти данные указывают на то, что Rere рекрутируется на регуляторную область, управляя RA-зависимой активацией Rarb после воздействия RA. Рекрутирование p300 на промотор увеличивается после воздействия RA в обоих типах клеток, , следовательно, происходит параллельное рекрутирование Rere (Fig. 3a, b)23. Очищенный Rere белок специфически взаимодействует in vitro с человеческими NR2 типа ядерными рецепторами, такими как NR2E1 (также известен как TLX) и NR2F (СOUP-TF)¹⁰. В NTH3T3 клетках Nr2f2 (также известный как COUP-TF2) оккупирует Rarb промотор и его рекрутирование увеличивается после воздействия RA (Fig. 3c). Репортер RARE-LacZ, чья экспрессия подавляется у om мутантов , представлен тремя копиями из 32-base-pair (bp) последовательности Rarb DR-5 RARE²⁰. Используя ChIP, мы нашли, что Rere, p300, Nr2f2 и Rarβ обогащены в RARE-содержащей репортерной конструкции у трансгенных RARE-LacZ эмбрионов мыши (Fig. 3d-f). В трансфицированных NIH3T3 клетках, ко-экспрессирующих Flag-Nr2f2 и Rere-haemagglutinin эпитоп (HA), мы наблюдали связывание мышиного Rere с Nr2f2, p300 и Rarα (Fig. 3l,m ). Т.о., наши результаты показали, что Rere может формировать комплекс, который содержит Nr2f2, Rar и p300, которые рекрутируются на стержневой RARE промотор генов мишеней для RA после воздействия RA.

Nr2f2 участвует в регуляции передачи сигналов RA²⁴, это привело нас к тесту функции Nr2f2 в Rere-зависимой контрольной RA реакции. Обработка клеток NIH3T3 small interfering РНК (siRNA) против Nr2f2 приводило к 60% снижению активации RARE-luciferase в присутствии RA (Fig. 3h and Supplementary Fig. 3a). Сходное снижение наблюдалось, когда NIH3T3 клетки обрабатывали RA и siRNA против Rere (Fig. 3i and Supplementary Fig. 3b). Более того, в RA-обработанных NIH3T3 клетках, трансфицированных siRNA против Nr2f2, избыточная экспрессия Rere не приводила к достоверному увеличению RA реакции (Fig. 3j). Кроме того, нокдаун Rere в Nr2f2-siRNA-обработанных NIH3T3 клетках ещё больше снижает активность передачи сигналов RA по сравнению с клетками, обработанными только Nr2f2 siRNA (Fig. 3k). Рекрутирование на промотор Rarb Rere и p300, но не Rarα, существенно влияет на NIH3T3 клетки, обработанные RA и Nr2f2 siRNA (Fig. 3g). Более того, в то время как ни Nr2f2^+/-, ни om/+ гетерозиготы не обнаруживали сомитного фенотипа, 33% (3 из 9) из Nr2f2^+/- om/+ транс-гетерозиготные эмбрионы одного помёта обнаруживали асинхронное образование сомитов, указывая тем самым на генетическое взаимодействие между двумя аллелями (Fig. 2f, g). Всё это подтверждает синергичную роль synergistic role for Nr2f2 и Rere в позитивном контроле передачи сигналов RA, а также в потребности Nr2f2 для формирования комплекса, содержащего Rere, рЗ00 и Rar на промоторе генов мишеней для RA.

Эти наблюдения привели нас к проверке онтогенетической экспрессии Nr2f2 у эмбрионов мыши. Хотя экспрессия Rere повсеместна в PSM (Fig. 4a) у эмбрионов на ст. первичной полоски, Nr2f2 экспрессируется в сомитах и передней части PSM, где он активируется на правой стороне (Fig. 4c). Экспрессия Nr2f2 на правой стороне PSM коррелирует с позицией будущих дефектов сомитогенеза, наблюдаемых у om и Raldh2 мутантных эмбрионов¹. У om мутантов экспрессия Nr2f2 сохраняется (Supplementary Fig. 4a, b). На этой стадии мы наблюдали позитивную регуляцию RARE-LacZ репортера в домен экспрессии Nr2f2, это указывает на асимметричность предачи сигналов RA в правой части PSM эмбрионов дикого типа (Fig. 4b). У эмбрионов кур десинхронизация дефектов, возникающая в результате отсутствия продукции RA, доказана на противоположной (левой) стороне по сравнению с мышами². На ранней сомитной ст. у эмбрионов кур, NR2F2 мРНК позитивно регулируется на левой части PSM (Fig. 4d), это коррелирует с дефектами десинхронизации. Инверсия экспрессии мРНК Nr2f2/NR2F2 и дефектов сомитогенеза между курами и мышами также коррелирует с функцией Fgf8, который действует как правый детерминант у кур и как левый детерминант у мыши^25,26(Fig. 4e-h). Чтобы определить, происходят ли дефекты сомитогенеза у мутантов Rere ниже функции Fgf8 на пути лево-правосторонности, мы скрещивали om и Fgf8 мутантных мышей. Мы наблюдали, что количество Fgf8^+/- om/om эмбрионов с асимметричными сомитами было выше, чем у одиночных om мутантов (Supplementary Fig. 5a-e). У рыбок данио такое генетическое взаимодействие происходит между Rere и Fgf8 во время развития задней части мезодермы²⁷.

Итак, эти результаты указывают на то, что асимметричная экспрессия Nr2f2 необходима, вместе с функцией Rere, чтобы контролировать асимметричную передачу сигналов RA в правую часть PSM мыши. Наши результаты указывают на то, что активность асимметричной передачи сигналов RA действует, чтобы буферизовать лево-правостороннюю функцию Fgf8, чтобы поддерживать билатеральную симметрию шейных сомитов. У человека основные дефекты билатеральной симметрии производных сомитов наблюдаются на спинальном уровне в классе болезней, наз. сколиозом. Дефекты Rere-зависимого RA пути, описанные в этой работе, которые нарушают симметрию предшественников позвонков, могут быть клинически отнесены к спинальной патологии у человека.