Роль Cathepsin L

E. Duncan, T. Muratore-Schroeder, R. Cook, B. Garcia, J. Shabanowitz, D. Hunt, C. Allis Cathepsin L proteolytically processes histone H3 during mouse embryonic stem cell differentiation. Cell 135, No. 2 284–294 (2008) Article
Ruthenburg, A. J. et al. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 983–994 (2007) Article Sims, R. J. 3rd & Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications? Nature Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815–820 (2008) Article	Пост-трансляционные модификации гистонов важны для генной активности и д. избирательно удаляться в ответ на онтогенетические сигналы, чтобы активировать или репрессировать специфические гены. David Allis с коллегами впервые показали, что гистоновые хвосты H3 'обрубаются' во время дифференцировки embryonic stem (ES)-клеток, открыв тем самым новый способ быстрой регулировки генной активности. Используя immunoblot анализ, авт. обнаружили короткий гистоновый H3 белок, который лишен своего N-терминального фрагмента в дифференцирующихся ES клетках, но не недифференцированных ES клетках. Путем определения белковой последовательности короткого H3 белка, Allis с сотр. установили, что короткий H3 белок возникает в результате N-терминального отщепления от изоформы гистона H3.2 (с предпочтительным местом расщепления между аминокислотами 21 и 22 N конца). Чтобы идентифицировать ответственную за это H3 proteases, группа экстрагировала белки из недифференцированных и дифференцированных ES клеток и тестировали их способность in vitro расщеплять версию гистона H3, которая была помечена по С концу. Не удивительно, что только экстракты из дифференцированных ES клеток содержали H3 протеазную активность и масс-спектрометрический анализ идентифицировал члена семейства цистеиновых протеаз cathepsin L в активных белковых фракциях. Специфическое ингибирование cathepsin L блокировало H3 протеазную активность in vitro, а истощение cathepsin L в дифференцированных ES клетках с помощью RNA interference или химического ингибирования устраняло расщепление H3 cleavage in vivo. Рекомбинантный cathepsin L расщепляет H3 гистон in vitro, а возникающий в результате более короткий фрагмент H3 специфически распознается антителами. приготовленными против места расщепления H3 in vivo. Эти результаты показали, что cathepsin L отщепляет хвост H3 в дифференцированных ES клетках. Короткий гистоновый H3 белок содержит пост-трансляционные модификации, включая ацетилированный Lys23 и метилированный Lys36 (обе метки активной транскрипции) и метилированный Lys27 (метка замалчивания транскрипции). Метод in vitro расщепления с рядом субстратов - не модифицированный гистон H3, гистон H3, который диметилирован по Lys27, ацетилированный гистон H3 и H3, который содержит оба типа модификаций - показал, что cathepsin L эффективно расщепляет хвост гистона H3, который диметилирован по Lys27. Напротив, ацетилирование Lys остатка предупреждает расщепление. Итак, расщепление хвоста гистона H3 может регулироваться с помощью пост-трансляционных модификаций, которые присутствуют на хвосте гистона. Предыдущие исследования показали, что деацетилирование гистона необходимо для дифференцировки ES клеток. В самом деле, деацетилирование гистона H3 является обязательным условием для расщепляющей активности cathepsin L в дифференцированных ES клетках. Авт. полагают, что укорочение гистоновых хвостов может "удалять критические элементы распознавания и тем самым блокировать связывание нижестоящих эффекторов" которые важны для процесса дифференцировки ES клеток.

Пост-трансляционные модификации гистонов важны для генной активности и д. избирательно удаляться в ответ на онтогенетические сигналы, чтобы активировать или репрессировать специфические гены. David Allis с коллегами впервые показали, что гистоновые хвосты H3 'обрубаются' во время дифференцировки embryonic stem (ES)-клеток, открыв тем самым новый способ быстрой регулировки генной активности.

Используя immunoblot анализ, авт. обнаружили короткий гистоновый H3 белок, который лишен своего N-терминального фрагмента в дифференцирующихся ES клетках, но не недифференцированных ES клетках. Путем определения белковой последовательности короткого H3 белка, Allis с сотр. установили, что короткий H3 белок возникает в результате N-терминального отщепления от изоформы гистона H3.2 (с предпочтительным местом расщепления между аминокислотами 21 и 22 N конца).

Чтобы идентифицировать ответственную за это H3 proteases, группа экстрагировала белки из недифференцированных и дифференцированных ES клеток и тестировали их способность in vitro расщеплять версию гистона H3, которая была помечена по С концу. Не удивительно, что только экстракты из дифференцированных ES клеток содержали H3 протеазную активность и масс-спектрометрический анализ идентифицировал члена семейства цистеиновых протеаз cathepsin L в активных белковых фракциях.

Специфическое ингибирование cathepsin L блокировало H3 протеазную активность in vitro, а истощение cathepsin L в дифференцированных ES клетках с помощью RNA interference или химического ингибирования устраняло расщепление H3 cleavage in vivo. Рекомбинантный cathepsin L расщепляет H3 гистон in vitro, а возникающий в результате более короткий фрагмент H3 специфически распознается антителами. приготовленными против места расщепления H3 in vivo. Эти результаты показали, что cathepsin L отщепляет хвост H3 в дифференцированных ES клетках.

Короткий гистоновый H3 белок содержит пост-трансляционные модификации, включая ацетилированный Lys23 и метилированный Lys36 (обе метки активной транскрипции) и метилированный Lys27 (метка замалчивания транскрипции). Метод in vitro расщепления с рядом субстратов - не модифицированный гистон H3, гистон H3, который диметилирован по Lys27, ацетилированный гистон H3 и H3, который содержит оба типа модификаций - показал, что cathepsin L эффективно расщепляет хвост гистона H3, который диметилирован по Lys27. Напротив, ацетилирование Lys остатка предупреждает расщепление. Итак, расщепление хвоста гистона H3 может регулироваться с помощью пост-трансляционных модификаций, которые присутствуют на хвосте гистона.

Предыдущие исследования показали, что деацетилирование гистона необходимо для дифференцировки ES клеток. В самом деле, деацетилирование гистона H3 является обязательным условием для расщепляющей активности cathepsin L в дифференцированных ES клетках. Авт. полагают, что укорочение гистоновых хвостов может "удалять критические элементы распознавания и тем самым блокировать связывание нижестоящих эффекторов" которые важны для процесса дифференцировки ES клеток.