Каждая жизнь на Земле зависит от углеводов, которые предоставляют клеткам энергию и строительные блоки для биосинтеза всех макромолекул. Поэтому не удивительно, что потребление и метаболизм углеводов экстенсивно регулируется на всех уровнях. Организмы обычно экспрессируют гены, необходимые для утилизации определенных сахаров субстратов только если они доступны в среде. Регуляция Escherichia coli лактозного оперона с помощью Lac репрессора представляет классический пример такого типа контроля (Miller-Hill 1996). Однако субстрат-зависимый контроль генной экспрессии может также быть достигнут после инициации транскрипции сс помощью разнообразных механизмов, включая ослабление транскрипции, контроль трансляции и модуляцию распада мРНК.
Организмы часто сталкиваются в среде своего обитания со смертью различных источников углерода и поэтому обладают средством избирательности, чтобы получать и метаболизировать те субстраты, которые делают возможным наиболее быстрый рост и обещают наибольший успех в конкуренции с др. видами. Многие гетеротрофные бактерии и грибы предпочитают глюкозу в качестве источника и обычно репрессируют использование др. сахаров, если доступна глюкоза. Этот феномен "catabolite repression" базируется на восприятии активностей транспортеров углеводов или внутриклеточных гликолитических метаболитов. Эти сигналы модулируют синтез внутриклеточных сигнальных молекул, таких как цАМФ, или активность протеин киназ, которые в свою очередь контролируют активность глобальных регуляторных белков; напр., Crp (cAMP receptor protein) в кишечных бактериях или cAMP-контролируемой протеин киназы А в эукариотических клетках (Deutscher 2008; Gancedo 2008; Go"rke and Stu"lke 2008).
Проникнув во внутрь клетки углеводы вступают на центральный путь метаболизма, т.e., гликолиз, pentose phosphate путь или цикл Krebs (TCA) . Поступление через эти пути д. быть тонко скоординировано со всем др. процессами в клетке, чтобы избежать вредного накопления или нехватки метаболитов. Глобальные регуляторы, такие как Escherichia coli Cra белок, координируют транскрипцию glycolytic и gluconeogenic генов (see Nanchen et al. 2008 and references therein), тогда как широко распространенное семейство CsrA/RsmA РНК-связывающих белков контролирует метаболические гены на пост-транскрипционном уровне. Заметим, что CsrA/RsmA-like белки обычно ассоциируют с антагонистическими малыми РНК - напр., E. coli CsrB (Liu et al. 1997)- которая контролирует пул активного регулятора (Babitzke and Romeo 2007; Lapouge et al. 2008). Более того, существует экстенсивная регуляция на уровне метаболических энзимов; напр., с помощью аллостерической регуляции или фосфорилирования (Bott 2007; Lomas-Lopez et al. 2007; Macek et al. 2007).
Здесь мы рассмотрим новый класс пост-транскрипционных регуляторов путей бактериальных сахаров; т.e., малые не кодирующие РНК (sRNAs), которые воздействуют на транс-кодируемые мРНК мишени. Кстати, функции sRNA наиболее экстенсивно были изучены на Грам-отрицательных видах. включая E. coli и Salmonella, у которых с помощью разных подходов (Vogel and Sharma 2005) было идентифицировано более сотни кодируемых хромосомами sRNAs. Эти молекулы, которые обычно в пределах от 50 до 250 nucleotides (nt) в длину, известны у бактерий с начала 1970s, но их значение определено лишь недавно (Majdalani et al. 2005; Storz et al. 2005; Romby et al. 2006). Т.к. E. coli sRNAs законсервированы у широкого круга видов (Hershberg et al. 2003), их функциональный анализ часто предсказывает физиологические роли внутри этого модельного организма. Так, открытие у E. coli RyhB sRNA (Masse' and Gottesman 2002), чья генеральная роль касается гомеостаза железа, воспроизводится в ортологах и паралогах sRNAs у удаленных родственных организмов-напр., Pseudomonas или Vibrio видов (Wilderman et al. 2004; Davis et al. 2005)- или GcvB sRNA, которая скорее всего контролирует экспрессию транспортеров пептидов и аминокислот у широкого круга бактерий (Urbanowski et al. 2000; Sharma et al. 2007).
Мы отобрали для обзора три базирующиеся на sRNA циркуита, построенных вокруг
E. coli Spot42, SgrS или GlmYZ sRNAs (Fig. 1), которые способствуют дифференциальной экспрессии
E. coli оперона утилизации galactose, противодействуют токсическим эффектам накопления glucose-6-phosphate (G6P) в клетке, или осуществляют feedback-контрольl синтеза GlmS в продукции amino sugar, соотв.
The galETKM operon and its functions
Оперон E. coli galETKM кодирует энзимы, которые превращают galactose в гликолитический промежуточный glucose-1-phosphate (Fig. 1). Этот путь предоставляет углерод и энергию посредством деградации galactose и важен также для синтеза UDP-glucose и UDP-galactose, которые необходимы для гликозилирования; т.e., биосинтеза lipopolysaccharides.
Оперон gal экспрессируется на довольно высоком уровне даже в отсутствие оперон-специфического индуктора galactose, это позволяет клетке синтезировать UDP сахара из G6P. Этот анаболический путь также генерирует galactose, чья судьба зависит от доступности источника углерода. Если это глюкоза, то галактоза экскретируется и поэтому GalK энзим (кодируемый третьим геном оперона) остается без дела. Если глюкоза отсутствует, то клетки повторно используют сгенерированную внутри клетки галактозу GalK-зависимым способом. Чтобы соответствовать дифференциальной необходимости GalK, белки gal оперона дифференциально синтезируются в зависимости от физиологических условий (Wilson and Hogness 1969). Следовательно, присутствие глюкозы снижает GalK синтез в 4 раза по сравнению с др. Gal белками, тогда как эквимолярные количества всех 4-х белков Gal оперона продуцируются, когда глюкоза отсутствует. Лежащий в основе механизм оставался неясным вплоть до открытия действия Spot42 РНК в этом пути.
Spot42 regulates galK translation within the galETKM operon mRNA
Spot42 до некоторой степени является ветераном области малых РНК; она впервые была открыта в 1970s (~200 копий на клетку) с помощью двумерного гель электрофореза метаболически меченных E. coli РНК (Ikemura and Dahlberg 1973). Ген spf (spot forty-two) кодирует эту в 109-nt РНК (Fig. 2A), он был идентифицирован в polA-yihA межгенной области (Rice and Dahlberg 1982). Огромное количество работ посвящено функции Spot42. Напр., будет ли делеция spf приводить к неспособности продуцировать явный фенотип (Hatfull and Joyce 1986), будет ли избыточная продукция РНК увеличивать время генерации бактериального роста на succinate, приводя к более мелким размерам колоний и нарушенной адаптации к изменениям в составе среды (Rice and Dahlberg 1982). В ранних исследованиях было установлено, что Spot42 скорее всего является регуляторной РНК (Rice et al. 1987).
Мистерия функции Spot42 была разрешена. когда Valentin-Hansen and coworkers (Moller et al. 2002b) заметили, что Spot42 обладает существенной комплементарностью с областью стартового кодона galK. Обратная корреляция в экспрессии spf и galK в ответ на глюкозу подсказала им проследить за galETKM мРНК, как потенциальной антисмысловой мишенью (Moller et al. 2002b). Т.е., ген spf является субъектом репрессии с помощью cAMP-CRP комплекса (Sahagan and Dahlberg 1979; Polayes et al. 1988), который редуцирует пороговые уровни Spot42в 5 раз в отсутствие глюкозы; при этом ослабляется зависимая от глюкозы 4-кратная репрессия синтеза GalK. Это указывает, что sRNA избирательно ингибирует синтез GalK, но не GalE и GalT белков, кодируемых вышестоящими в gal опероне мРНК (Fig. 3A; Moller et al. 2002b).
Spot42 специфически соединяется с 5' частью galK мРНК и действует как ингибитор трансляции, который предупреждает 30S рибосомы от связывания galK части мРНК оперона. Исследование Spot42-galK мРНК комплекса выявили три преимущественно однонитчатые области в Spot42 РНК, которые antisense-спаривались с AUG областью galK мРНК (Fig. 2B). Сайт мишень перекрывается с 3' концом galT, т.о., Spot42 соединение д. противостоять геликазной активности рибосомы, проходящей вдоль вышестоящего гена galT. Избирательная репрессия синтеза GalK с помощью Spot42 выявляет новый принцип регуляции бактериальных генов; т.e., наведение на ген внутри оперона на пост-транскрипционном уровне (Fig. 3).
A crucial role of Hfq protein in Spot42-target RNA interaction
Подобно многим др. sRNAs (see below), спаривание Spot42 со своей мишенью galK не совершенным и прерывистым. Как же осуществляется эффективное спаривание оснований? Известно, что бактериальный Sm-подобный белок Hfq взаимодействует с некоторыми E. coli sRNAs и что его присутствие необходимо для регуляции in vivo (Zhang et al. 1998; Sledjeski et al. 2001; Wassarman et al. 2001). Spot42 РНК была также обнаружена ассоциированной с Hfq белком in vivo, и, как было показано, Hfq нацеливается на три короткие однонитчатые области sRNA, богатые A/U (Moller et al. 2002a). Интересно, что эти связывающие мотивы напоминают те, что в эукариотических Sm белках, которые участвуют в разных аспектах регуляции и метаболизма РНК. Более того, homohexameric Hfq белок, как было показано, формирует кольце-подобные тороидной формы структуры, напоминающие олигомерные структуры Sm белков. Структурный анализ недвусмысленно подтвердил, что Hfq является гомологом Sm (Brennan and Link 2007). Один Hfq гексамер связывает Spot42 молекулу и Hfq усиливает взаимодействие Spot42 с её galK РНК мишенью в 150 раз, давая в результате состоящий из трех частей ribonucleoprotein (RNP) комплекс, состоящий из регуляторной РНК, её мишени и Hfq. Эти находки вместе с параллельным исследованием Hfq и OxyS sRNA в лаб. Storz (Zhang et al. 1998, 2002), заложили основу для полной оценки роли Hfq как ключевого посредника sRNA-мРНК взаимодействий.
SgrS RNA combats phosphosugar stress
Многие бактерии используют глюкозу за счет phosphoenolpyruvate phosphotransferase system (PTS) (Plumbridge 2002; Deutscher et al. 2006). PTS энзим IICBGlc, кодируемый с помощью ptsGу E. coli, является ключевым игроком в этом процессе; он транспортирует и затем фосфорилирует глюкозу в G6P. Т.к. G6P является важным промежуточным образованием в метаболизме глюкозы, то его внутриклеточное накопление вызывает феномен sugar-phosphate токсичности, также наз. "phosphosugar stress." Лаб. Aiba сделала важное наблюдение, что условия этого стресса дестабилизируют ptsG мРНК, тем самым ограничивают синтез энзима IICBGlc и дальнейшее накопление G6P (Kimata et al. 2001). Эта пост-транскрипционная репрессия ptsG нуждается в Hfq (Morita et al. 2004), указывая тем самым на скрытое действие на sRNA.
sRNA, противостоящая phosphosugar стрессу у E. coli, была идентифицирована как SgrS Vanderpool и Gottesman (2004), sRNA первоначально была открыта с помощью анализа глобального микромассива Hfq-ассоциированных РНК (Zhang et al. 2003). Индуцированная экспрессия SgrS с плазмиды вызывала быструю потерю ptsG messenger, и напротив, делеция sgrS гена устраняла негативную регуляцию ptsG, которая обычно следует за phosphosugar стрессом (Vanderpool and Gottesman 2004). С длиной ~220 nt, E. coli SgrS находятся на шкале самых длинных энтобактериальных sRNA (Fig. 2A). Это отражает тот факт, что SgrS также кодирует полипептид (see below). SgrS транскрибируется с межгенной области, которая разделяет sgrR и setA, два гена, которые непосредственно или косвенно регулируют действие SgrS.
Индукция с помощью phosphosugar stress sgrS нуждается в дополнительно кодируемом SgrR белке, новом типе транскрипционного регулятора, и основываясь на генетических и молекулярных доказательствах, SgrR сегодня рассматривается как надежный транскрипционный активатор sgrS (Vanderpool 2007). Геномное сцепление sRNA гена (sgrS) с геном своего родственного транскрипционного фактора (sgrR) является повторяющейся темой у E. coli; напр., gcvB и oxyS также соседствуют (и дивергентны) с генами своих транскрипционных факторов (Altuvia et al. 1997; Urbanowski et al. 2000).
SgrS targets ptsG mRNA by short antisense pairing
Наблюдения, что SgrS ассоциирует с Hfq (Zhang et al. 2003) и что Hfq уполномочен на индуцированную стрессом репрессию ptsG (Morita et al. 2004), правильно предсказывают, что SgrS регуляция базируется на антисмысловом механизме. SgrS-ptsG взаимодействие, первоначально предположенное Vanderpool and Gottesman (2004), активно исследовалось Aiba and colleagues (Kawamoto et al. 2005, 2006). Как показано на Figure 2B, остатки 168-187 SgrS спариваются с 5' untranslated region (UTR) из ptsG мРНК вокруг SD последовательности, образуя несовершенный 20-base-pair (bp) дуплекс РНК, который содержит несколько C:U или A:G несовпадений. Детальные доступные генетические доказательства (Kawamoto et al. 2006) делают SgrS-ptsG взаимодействие привлекательным для дальнейшего анализа структуры РНК. Работа с несколькими sRNAs, не связанными с циркуитами контроля сахаров, показала. что взаимодействующие остатки часто представлены разными структурными элементами- напр., регионами апикальной петли (Argaman and Altuvia 2000; Boisset et al. 2007; Papenfort et al. 2008)- и это совершенно зеркальные механизмы распознавания мишеней с помощью cis-кодируемых антисмысловых РНК (Wagner et al. 2002).
Расположение предсказанных SgrS РНК от разных бактерий выявляет существенное разнообразие последовательностей, но сайты связывания ptsG выглядит как короткая законсервированная область (Vanderpool and Gottesman 2004). Учитывая существенную длину бактериальных sRNAs, с одной стороны, и короткие несовершенные взаимодействия с мРНК, с др. стороны, заслуживающие доверия предсказания мишеней sRNA ещё предстоит сделать. Теперь, использование консервации "antisense domains", содержащих сайты связывания мРНК мишеней, таких как наблюдаемые в SgrS, д. улучшить предсказания мишеней; уже поставлена цель идентификации сайтов связывания ~200-nt GcvB sRNA на мРНК мишени множественного ABC транспортера (Sharma et al. 2007).
Concerted action of Hfq and RNase E
Быстрая потеря ptsG мРНК является наиболее очевидным исходом в реакции на phosphosugar стресс (Kimata et al. 2001; Vanderpool and Gottesman 2004). Однако , SgrS спаривание покрывает SD последовательность ptsG мРНК (Fig. 2B), указывая тем самым, что оно может также ингибировать ptsG трансляцию. Т.к. период полу-жизни бактериальной мРНК строго зависит от ассоциации с рибосомами (Deana and Belasco 2005), то можно предложить простую модель, в которой распад ptsG мРНК происходит в результате SgrS-обусловленного блока трансляции. Кроме того, имеется более одного слоя действия SgrS и сюда входит новый ribonucleoprotein complex (RNP), существенный для распада ptsG мРНК.
Этот новый RNP состоит из RNase E, Hfq и SgrS (Morita et al. 2005), но он может также формироваться с др. Hfq-зависимыми sRNAs (Masse' and Gottesman 2002; Morita et al. 2005). RNase E, главная ribonuclease у E. coli, обычно обнаруживается в "degradosome," комплексе состоящем из PNPase, RhlB и enolase, соединяющимся с C-терминальной "каркасной" областью RNase E (Carpousis 2007). Поразительно, в то время как RNase E, включая её каркасную область, существенна для индуцированного стрессом распада ptsG мРНК, др. компоненты degradosome, по-видимому, не являются важными (Morita et al. 2005). Анализ белков, которые очищаются совместно с epitope-tagged RNase E, Hfq или RhlB, показывает, что Hfq взаимодействует с каркасом RNase E независимо от сборки degradosome. Эта ассоциация рекрутирует Hfq-ассоциированную SgrS sRNA на RNase E, и SgrS может затем направлять RNase E/Hfq на ptsG мишень (Morita et al. 2005). T.о., Hfq выполняет двойную функцию: он облегчает стабильное спаривание SgrS-ptsG (Kawamoto et al. 2006) и предоставляет собой нуклеолитический кофактор регуляторных РНК , который д. необратимо инактивировать мишень. Если Hfq и RNase E всегда в комплексе, то возникает интригующий вопрос, почему др. sRNA мишени репрессируются без сопутствующего распада мРНК. Напр., Spot42 , по-видимому, не рекрутирует RNase E на gal опероновую мРНК, хотя она тесно ассоциирует с Hfq. Однако недавнее исследование из лаб. (Worrall et al. 2008) указывает на то, что RNase E-Hfq взаимодействие может быть не прямым, а может быть вызванным с помощью РНК; если это так, то не все регуляторные sRNAs могут быть способны вносить два белка в комплекс.
Ассоциация SgrS с RNase E может также предоставить механизм упреждающего управления, который позволяет клеткам быстро менять направление негативной регуляции ptsG, когда phosphosugar стресс снимается. Masse' et al. (2003) продемонстрировали с помощью элегантных in vivo экспериментов, что некоторый Hfq-зависимый распад sRNAs вместе с их мишенями происходит RNase E-зависимым способом. В отсутствие спаривания с мишенью, Hfq может защищать sRNAs от RNase E,но после спаривания с мишенью, как мРНК, так и sRNA становятся лабильными (Masse' et al. 2003). Т.к. RNase E и Hfq имеют совпадающие сайты связывания (single-stranded A/U-rich regions) (Moll et al. 2003), то RNase E преимущественно вытесняет Hfq с её РНК мишеней.
Целенаправленная дестабилизация мРНК становится теперь одной из сторон истории SgrS. В мутантной RNase E линии, дефектной по распаду ptsG мРНК, SgrS всё ещё снижает уровни ptsG-кодируемого IICBGlc белка (Morita et al. 2006). Метаболический белок метится непосредственно после индукции phosphosugar стресса, обнаруживая тем самым, что SgrS ингибирует синтез белка IICBGlc in vivo без последующей деструкции мРНК (Morita et al. 2006). Более того, вследствие более ранних подходов по sRNA-индуцированному ингибированию инициации трансляции с использованием 30S рибосом - напр., для OxyS/fhlA мРНК (Altuvia et al. 1998)- было продемонстрировано, что SgrS сама по себе может ингибировать трансляцию ptsG мРНК в восстановленной in vitro системе трансляции (Maki et al. 2008). В более общих терминах, этот механизм репрессии трансляции находится в резком контрасте с функцией эукариотических микроРНК, которые осуществляют репрессию мишеней путем рекрутирования определенных белков и функционируют только по выбору правильных мРНК
mRNA localization matters
Образующаяся ptsG мРНК д. сначала стать цитоплазматической, но поздней оказывается на ближайшей мембране как IICB
Glc белок и д. быть котрансляционно интегрирован во внутреннюю мембрану. Kawamoto et al. (2005) сделали важное наблюдение, что действие SgrS на ptsG мРНК строго зависит от локализации интактного белка. Исследователи обсудили несколько моделей, как локализованная в мембране, но не цитоплазматическая ptsG мРНК становится мишенью для SgrS, включая накопление RNase E вблизи мембраны (Liou et al. 2001) и пониженную скорость инициации трансляции во время хода cotranslational интеграции образующегося пептида в мембрану. Отметим, так как большинство бактериальных sRNAs, как ожидается, действует на рождающиеся мРНК мишени, конкуренция между спариванием с sRNA и соединением с рибосомами, скорее всего, и является генеральным принципом (Unoson and Wagner 2007). В согласии с этой моделью то, что SgrS может регулировать ptsG мРНК независимо от локализации в мембране, если трансляция ptsG искусственно снижена (за счет более слабой SD последовательности) (Kawamoto et al. 2005). Мы также наблюдали, до какой степени локализация мРНК участвует в sRNA circuits. Интересно. что др. SgrS мигшень-напр., manXYZ мРНК- по-видимому, регулируется независимо от локализации мРНК (C. Vanderpool, pers. comm.). Однако, учитывая, что многие sRNA мишени кодируют внецитоплазматические белки - напр., наружной мембраны, периплазматические или секретируемые белки (Guillier et al. 2006; Vogel and Papenfort 2006; Boisset et al. 2007; Sharma et al. 2007)- пространственный контроль не может не быть широко распространенным.
SgrS action taken beyond antisense regulation
Короче говоря, SgrS не является "некодирующей", а бифункциональной РНК, которая является как антисмысловым регулятором, так и мРНК. Wadler and Vanderpool (2007) установили, что в длинной 5' области выше сайта взаимодействия с ptsG имеется консервативная в 43-аминокислоты ORF, названная sgrT (Fig. 2A). Пептид SgrT и ptsG base-pairing являются одинаково достаточными для защиты E. coli от phosphosugar стресса, указывая на их физиологическое перекрывание. С помощью ещё неизвестного механизма, SgrT может противодействовать предсуществующему IICBGlc белку, тогда как спаривание SgrS с ptsG блокирует начало синтеза IICBGlc (Wadler and Vanderpool 2007).
Двойная функция известна для в 514-nt RNA III у Staphylococcus aureus, чей 5' конец кодирует короткий вирулентный пептид, тогда как на 3'-конце локализованный антисмысловой домен регулирует множество мРНК вирулентных факторов (Novick et al. 1993; Huntzinger et al. 2005; Boisset et al. 2007). Хорошо бы понять, как такие РНК могут контролировать транс-кодируемые мРНК, если они являются также мишенями рибосом.
Ген
sgrS может таить больше сюрпризов благодаря свому расположению справа выше
setABC оперона (Vanderpool and Gottesman 2004). SetABC белки принадлежат семейству транспортеров, выводящих сахара (sugar efflux), а SetA обладает широкой субстратной специфичностью, включая глюкозиды (Liu et al. 1999). Терминатор sgrS располагается всего лишь на ~25 bp выше стартового кодона для setA (Vanderpool and Gottesman 2004) и считываемые транскрипты с sgrS могут также активировать setABC-кодируемы sugar efflux насос, когда повышенные уровни G6P становятся угрожающими. Если это так, то этот цис-эффект д. быть др. новой функцией этого интересного гена дя sRNA.
Intraoperonic gene targeting the other way around: the GlmYZ sRNAs activate a downstream cistron
Мы обсуждали, что Spot42 модулирует экспрессию оперона galETKM за счет избирательной репрессии нижестоящего цистрона. Противоположный случай-т.e., избирательная активация нижестоящего цистрона с помощью sRNA- ведет к дифференциальной экспрессии E. coli glmUS мРНК. Этот оперон кодирует энзимы биосинтетического пути для аминосахаров, которые являются важными предшественниками для peptidoglycan и lipopolysaccharide компонентов клеточной стенки Грам-отрицательных бактерий (Fig. 1). В то время как GlmU необходим постоянно, GlmS становится важным только для синтеза glucosamine-6-phosphate (GlcN-6-P), если недоступны внешние аминосахара. Из-за строгого транскрипционного купирования glmUS генов (Plumbridge 1995), относительный синтез GlmS в ответ на доступный субстрат может быть установлен только после транскрипции (Fig. 3B). Хотя RNase E-зависимый процессинг, как было показано, генерирует моноцистронную glmS с двухцистронной glmUS мРНК (Joanny et al. 2007; Kalamorz et al. 2007), не получено доказательств, что расщепление регулируется метаболически. Напротив, в независимых исследованиях двух наших лаб. недавно были идентифицированы две E. coli sRNAs, GlmY и GlmZ (Fig. 2 A), в качестве субоперонных стимуляторов синтеза GlmS (Kalamorz et al. 2007; Urban et al. 2007; Reichenbach et al. 2008; Urban and Vogel 2008).
GlmY и GlmZ sRNAs первоначально были описаны во многих E. coli скринингах (Argaman et al. 2001; Rivas et al. 2001; Wassarman et al. 2001; Vogel et al. 2003), но их функциональные и структурные взаимоотношения были неясны до тех пор, пока каждая из них не оказалась активатором синтеза GlmS. Избыточная экспрессия GlmY вызывает столь радикальное накопление GlmS, что этот белок становится уже видимым на стандартном SDS геле; уровни вышестоящего GlmU белка, однако оставались неизменными (Urban et al. 2007). Параллельно скрининг транспозонов открыл ген glmZ в качестве причины хронической избыточной продукции GlmS у определенного мутанта E. coli (yhbJ; see below); и опять изменялись только уровни GlmS, а не GlmU (Kalamorz et al. 2007). Отметим, что последнее исследование представляет редкий случай, при котором скрининг на транспозоновый мутагенез привел к распознаванию функции sRNA's, в то время как избыточная экспрессия sRNA является jsxysv путем к успеху (Vogel and Wagner 2007).
Две sRNAs очень сходны поо длине, последовательностям и структуре (Fig. 2A). Однако эти кажущиеся гомологичными sRNAs активируют синтез GlmS с помощью совершенно разных механизмов и действуют иерархически в каскаде некодирующих РНК.
Mechanism of translational activation by bacterial sRNAs
Трансляция glmS мРНК обычно слабая из-за внутренней шпилечной структуры, содержащей glmS SD последовательность (Fig. 2B), ограничивает доступ рибосомам к нижестоящим glmS RBS , а значит и синтез GlmS. Эта ситуация напоминает контроль rpoS мРНК у E. coli (rpoS кодирует генеральный стрессовый sigma фактор, σS): трансляция этой мРНК обычно низкая из-за прирожденной RBS шпильки. Всё же трансляция rpoS может быть активирована с помощью транс-кодируемых DsrA и RprA sRNAs посредством "антисмыслового" механизма; спаривание оснований этих sRNAs с лидерной rpoS мРНК конкурирует с образованием ингибирующей RBS шпильки, это способствует трансляции (Lease et al. 1998; Majdalani et al. 1998, 2002).
In silico анализ (Kalamorz et al. 2007) и эксперименты по изучению структуры РНК (Urban and Vogel 2008) выявили один и тот же механизм для glmS мРНК: около 15 остатков доступны, однонитчатая область GlmZ РНК спаривается основаниями с 5' фланга glmS RBS шпильки (Fig. 2B); это альтернативное спаривание высвобождает SD и активирует трансляцию glmS мРНК. Мутационный анализ in vivo подтвердил это взаимодействие; точковые мутации в верхней и нижней спирали GlmZ-glmS взаимодействия устраняют индукцию glmS, но если комбинируется компенсаторным способом, то активация с помощью GlmZ is восстанавливается (Urban and Vogel 2008). Кроме того, активация glmS мРНК с помощью GlmZ также воспроизводится в in vitro системе трансляции (Urban and Vogel 2008). Это иллюстрирует, что антисмысловой механизм по существу нуждается только в трансляционном аппарате и активаторной sRNA. Вследствие своего столкновения с др. бактериальным sRNA circuits (Hammer and Bassler 2007; Prevost et al. 2007), антисмысловой механизм теперь рассматривается как пример sRNA-обеспечиваемой активации мРНК.
Отметим однако, что
in vivo GlmZ не только усиливает трансляцию glmS , но и также стабилизирует эту мРНК (Kalamorz et al. 2007; Urban and Vogel 2008). Увеличивается ли трансляция и стабильность мРНК сочетано, предстоит установить.
In vitro добавление очищенного белка Hfq усиливает эффект трансляции GlmZ почти в 10 раз (Urban and Vogel 2008), а
in vivo, Hfq в конечном итоге оказывается необходим для активации glmS (Kalamorz et al. 2007; Urban and Vogel 2008).
In vivo Hfq не только ассоциирует с GlmY или GlmZ sRNAs (Zhang et al. 2003; Sittka et al. 2008), но также специфически с glmUS межгенной областью (Sittka et al. 2008), в согласии с общей функцией Hfq's как устроителя взаимодействий sRNA-мРНК мишень.
A regulatory RNA cascade-GlmY acts on GlmZ to activate GlmS synthesis
GlmY и GlmZ выглядят очень похожими, всё же GlmY лишена остатков GlmZ, которые нацеливают glmS шпильку (Fig. 2A), и также неспособна помогать синтезу GlmS in vitro (Urban and Vogel 2008). Как она может затем активировать ген glmS in vivo? Она делает это, противодействуя инактивации GlmZ.
Первичный в 207-nt GlmZ транскрипт становится предметом 3'-РНК процессинга, который использует действие YhbJ, консервативного белка с ещё неизвестной функцией (Kalamorz et al. 2007). Процессинг генерирует в 153-nt GlmZ вид (Argaman et al. 2001), который лишен glmS-связывающего сайта и не способствует синтезу GlmS in vitro (Urban and Vogel 2008). С помощью ещё неизвестного механизма, GlmY противодействует вредному процессингу GlmZ и тем самым увеличивает уровни прямого glmS активатора (Reichenbach et al. 2008; Urban and Vogel 2008). Этот антагонизм может использовать РНК мимикрию GlmY, чтобы конкурировать с фактором(и), которые метят очень сходную GlmZ РНК на расщепление.
Семейства гомологичных sRNAs были описаны от разных бактерий, иных чем
E. coli; напр., Vibrio, Pseudomonas и виды цианобактерий (Lenz et al. 2004; Wilderman et al. 2004; Axmann et al. 2005; Lapouge et al. 2008). Известно, что эти sRNAs действуют перекрываясь и/или аддитивно и до некоторой степени замещают функцию один др. В противоположность иерархическому действию GlmYZ sRNAs существуют новые, такие как GlmY, строго необходимые GlmZ для glmS активации(Reichenbach et al. 2008; Urban and Vogel 2008).
Polyadenylation controls sRNA expression
Hfq и YhbJ играют важные роли в GlmYZ каскаде, контролируя активность GlmZ на уровне РНК (Kalamorz et al. 2007; Urban and Vogel 2008). Ещё один белок регулирует уровни GlmY и снова на пост-транскрипционном уровне; он является основным энзимом, ответственным за полиаденилирование 3'-конца РНК, PAP I [poly(A) polymerase I колируемая pcnB] (Cao and Sarkar 1992).
Исторически, PAP I явился первым фактором, участвующим в пост-транскрипционной регуляции glmS, когда изучение E. coli pcnB мутантов выявило хроническую избыточную продукцию как glmS мРНК, так и GlmS белка (Joanny et al. 2007). Т.к. poly(A) хвосты обычно дестабилизируют бактериальные транскрипты за счет ускорения 3' → 5' экзонуклеолитической деградации РНК (Dreyfus and Regnier 2002; Kushner 2004),было предположено, что потеря полиаденилирования непосредственно препятствует распаду glmS мРНК (Joanny et al. 2007). Однако наблюдения, что glmS репортера слияния с 3' концами, отличными от нативной glmS мРНК, также как и то, что GlmYZ sRNAs также позитивно регулируются в PAP I-дефицитной линии (pcnBΔ1), указывают на др. механизм (Kalamorz et al. 2007; Reichenbach et al. 2008; Urban and Vogel 2008). Оценка стабильности и статуса poly(A) GlmY, GlmZ или glmS РНК показала, что GlmY является единственной РНК, для которой дифференциальная стабильность и уровни экспрессии в pcnBΔ1 клетках коррелирует с присутствием или отсутствием 3'-концевых poly(A) хвостов. Т.о., если GlmY более не полиаденилирована (обычно более 50% всех GlmY молекул), то она стабилизирована и накапливается, это в свою очередь стабилизирует GlmZ и усиливает трансляцию glmS (Reichenbach et al. 2008; Urban and Vogel 2008).
Зависимая от полиаденилирования дестабилизация, как давно известно, затрагивает цис-кодируемые антисмысловые RNAs из бактериальных плазмид (Xu et al. 1993; Dam Mikkelsen and Gerdes 1997; So"derbom et al. 1997), кроме того GlmY явилась первой хромосомной sRNA, чьё полиаденилирование влияет на синтез клеточного белка.
Multiple input functions in sRNA-mediated amino sugar regulation
Анализ GlmYZ РНК решает давно существующую загадку, как активность GlmS, которая ингибируется петлей обратной связи на уровне энзима в эукариотических системах (Milewski 2002) и цис-контролируется в Грам-позитивных бактериях (Winkler et al. 2004), авторегулируется в Грам-отрицательных бактериях. Физиологические исследования, использующие различные ингибиторы аминосахаров и пути синтеза клеточной стенки, продемонстрировали, что GlmYZ РНК являются существенными для контроля с помощью обратной связи E. coli синтеза GlmS с помощью её продукта, GlcN6P. Истощение GlcN6P вызывает накопление GlmY, который индуцирует синтез GlmS путем стабилизации GlmZ (Kalamorz et al. 2007; Reichenbach et al. 2008).
Сегодня важно понять, как эти РНК каскады воспринимают средовые сигналы, которые предопределяют эпистаз glmS. Более того, точный механизм того, как YhbJ влияет на процессинг GlmZ РНК пока не решён. Белок, который законсервирован у многих бактерий, содержит мотив, связывающий нуклеотиды, и компьютерный анализ предсказывает предполагаемый РНК-связывающий домен на С конце. Независимо от точного молекулярного способа действия, неожиданное открытие YhbJ в качестве медиатора процессинга sRNA указывает на существование дополнительных белков, которые модулируют активность регуляторных sRNAs.
Regulation of glmS expression by a ribozyme in Gram-positive bacteria
У низших GC Gram-позитивных бактерий экспрессия glmS также регулируется на пост-транскрипционном уровне с помощью cis-кодируемого ribozyme (Winkler et al. 2004) скорее, чем транс-кодируемых sRNAs. Рибозим glmS был открыт во время биокомпьютерных поисков консервативной последовательности и структурных элементов необычно крупных межгенных регионов в геноме бактерий (Barrick et al. 2004). Рибозим располагается в 5' UTR glmS мРНК. В отличие от классических riboswitches, он лишен ослабителей транскрипции или трансляции. Напротив, в экспериментах in vitro показано, что он подвергается само-расщеплению специфически в присутствие GlcN6P (Winkler et al. 2004).
В ситуации in vivo это событие расщепления высвобождает glmS мРНК из крупного полицистронного транскрипта (Winkler et al. 2004) и подавляет синтез GlmS. В лаб. Winkler расшифровали in vivo механизм генной регуляции с помощью рибозима Bacillus subtilis (Collins et al. 2007). Путем изменения внутриклеточной концентрации GlcN6P они показали, что истощение GlcN6P сильно увеличивает экспрессию glmS. В этих условиях не расщепленный полной длины glmS транскрипт накапливается, тогда как транскрипты glmS не обнаруживаются в присутствие высоких концентраций GlcN6P. Мутации в рибозиме, которые предупреждают расщепление, также вызывают накопление мРНК glmS полной длины, независимо от концентрации GlcN6P. RNase J1, являющаяся важной нуклеазой с ключевой ролью в процессинге и деградации РНК у B. subtilis (Even et al. 2005; Mathy et al. 2007), была идентифицирована в качестве энзима, который отвечает за быструю деградацию 3' продукта расщепления рибозима (Collins et al. 2007).
Расщепление glmS рибозима, как было показано, происходит с помощью внутреннего переноса фосфоэфира, дающего продукты с 2',3'-cyclic phosphate и 5' гидроксильной половинкой на концах (Winkler et al. 2004; Collins et al. 2007). RNase J1 специфически деградирует РНК с 5' гидроксильной группой, которые радикально отличаются от образцовой модели глобального распада мРНК у
E. coli, в которой неродственный энзим RNase E специфически распознает 5' monophosphate мРНК, тогда как 5' гидроксильная РНК стабильна (Celesnik et al. 2007). Накапливаются доказательства, что Gram-позитивные и Gram-негативные бактерии используют полностью отличные механизмы распада РНК.
The unique features of the glmS ribozyme
Среди известных ощущающих метаболиты РНК в природе, одна в glmS является уникальной, потому что представляет собой единственный рибозим, контролирующий генную экспрессию, и потому что его лиганд GlcN6P является кофактором в лежащем ниже acid-based катализе само-расщепления РНК. Рибозим glmS становится моделью РНК для биохимических и биофизических исследований, включая детерминацию его кристаллической структуры в одиночестве или комплексе с GlcN6P (Klein and Ferre-D'Amare 2006; Cochrane et al. 2007). Итак, эти исследования продемонстрировали, что в отличие от классических riboswitches, не происходит конформационных изменений в рибозиме после связывания GlcN6P и расщепления РНК. Недавнее исследование показало, что рибозим может быть физически отделен от своей РНК мишени без потери активности (Tinsley et al. 2007); если искусственно видоизмененный glmS рибозим может регулировать генную экспрессию в транс-положении, то небольшие воспринимающие метаболиты, РНК также могут существовать в природе.
Conclusion and outlook
Noncoding RNAs have been implicated in ever more cellular pathways and stress responses (Majdalani et al. 2005; Storz et al. 2005). Besides the control of virulence and transcription factors (Romby et al. 2006; Wassarman 2007) and outer membrane protein biogenesis (Guillier et al. 2006; Vogel and Papenfort 2006), the regulation of metabolic sugar pathways has emerged as a major domain of bacterial sRNA action.
We have highlighted how the SgrS, Spot42, GlmY, and GlmZ sRNAs control the flux through central carbohydrate metabolic pathways. Much remains to be learned about each of these circuits. For example, the various phenotypes upon Spot42 overproduction suggest the existence of additional targets—e.g., in succinate metabolism—and Spot42 is predicted to pair with the 5? end of sucC mRNA, encoding the ?-subunit of succinyl-CoA synthetase (M?ller et al. 2002b). Regarding SgrS, microarray analyses have predicted that in addition to ptsG, the mRNAs of the PTS sugar transporters specific for fructose and mannose are SgrS targets (see Vanderpool 2007). Similar analysis in Salmonella has shown that SgrS action extends beyond sugar regulation, and that by using the same binding region as for ptsG, SgrS regulates a laterally acquired Salmonella virulence factor (K. Papenfort and J. Vogel, in prep.). Note that there is an intimate connection between carbohydrate utilization and virulence in many pathogenic bacteria (Go"rke and Stu"lke 2008).
Global transcriptome analyses of hfq mutants (Ding et al. 2004; Sonnleitner et al. 2006; Guisbert et al. 2007; Sittka et al. 2008) have revealed an extensive role of Hfq in the regulation of sugar pathways. Moreover, micoarray- or deep sequencing-based identification of Hfq-associated RNA (Zhang et al. 2003; Sittka et al. 2008) suggests that Hfq targets mRNAs not only of many sugar transporters and metabolic enzymes, but also of transcription factors that coordinate the uptake and utilization of carbohydrates. It is reasonable to predict that numerous of these Hfq-associated mRNAs will turn out as being targeted by sRNAs. Hfq also binds the mRNA coding for Crp (Sittka et al. 2008), and this global transcription factor in turn controls not only metabolic genes (Gutierrez-Rios et al. 2007), but also the synthesis of two sRNAs, Spot42, and CyaR (Polayes et al. 1988; Papenfort et al. 2008). All these observations suggest that we are just beginning to understand the manifold and widespread role for sRNAs in control of sugar metabolism.
This might also be true for metabolite-sensing ribozymes and riboswitches. We note that a potential riboswitch was identified upstream of the sucA gene in ?-proteobacteria (Weinberg et al. 2007); SucA catalyzes a reaction in the Krebs cycle. In E. coli, the same function is encoded by sucC mRNA, which is a putative target of Spot42 sRNA (see above). Since riboswitches are abundant in low G + C Gram-positive bacteria such as B. subtilis but rare in E. coli (Barrick and Breaker 2007), it is tempting to speculate that regulation by trans-encoded sRNAs generally compensates for the much lower number of riboswitches in enteric bacteria. The documented differences in glmS regulation in B. subtilis (ribozyme) and E. coli (GlmYZ sRNAs) are in favor of this speculation.
Сайт создан в системе
uCoz
