Итак, ES клетки, дефицитные по метилированию ДНК, могут эффективно дифференцироваться в трофобластный клон. Было показано, что программа дифференцировки трофобласта имеет место как in vivo , так и in vitro и связана с экспрессией TS клеточных транскрипционных факторов Cdx2, Eomes и Elf5, и развитие происходит упорядоченным образом от стволовых клеток через промежуточный трофобласт до гигантских клеток. Во-вторых, транскрипционный фактор Elf5 соединяется с и позитивно регулирует промоторы генов Cdx2 и Eomes, образуя позитивную петлю обратоной связи, которая является критической для поддержания популяции TS клеток. В-третьих, ген Elf5 гипометилирован в трофобластном клоне, так что петля обратной связи оказывается устойчивой и ведет к экспансии компартмента стволовых клеток и последующей дифференцировке. Напротив, Elf5 стабильно репрессируется с помощью метилирования ДНК в эмбриональном клоне; в результате любая индукция судьбы трофобластных клеток за счет стохастической экспрессии Cdx2 или Eomes не может поддерживаться в этом компартменте.

Несколько исследований продемонстрировали, что эпигенетическая регуляция посредством белков группы Polycomb важна для поддержания плюрипотентного состояния внутри эмбрионального клона в ES клетках^26-28. Нами. было показано, что метилирование ДНК действует как клональный барьер между компартментами эмбрионального и трофобластного клонов (Fig. 7d). Поэтому гипометилированные ES клетки могут воспринимать судьбу трофобластных клеток. Важно отметить, однако, что дефицитные по метилированию клетки ES не просто переключаются с ES на трофобластную судьбу, а расширяют свои потенции, включая как эмбриональную, так и внеэмбрионалную судьбу. Т.о., они воспринимают состояние, сравнимое с более ранней стадией развития до предопределения клонов. Эта интерпретация согласуется с наблюдаемым перекрыванием паттернов окраски клональных маркеров. Хотя дефицитные по метилированию ES клетки способны экспрессировать детерминанты трофобласта Cdx2 и Eomes (а также Fgfr2), промоторы этих генов не метилированы в дикого типа ES клетках. Поэтому мы проводили скрининг по всему геному на различия в метилировании промоторов между ES и TS клетками. Этот анализ выявил, что глобальна асимметрия метилирования, наблюдаемая между эмбриональным и трофобластным клоном, не отражается профилем метилирования генных промоторов по большому счету. Основные различия в метилировании между двумя клонами, следовательно, скорее всего локализованы в не-генных регионах, таких как центромерный гетерохроматин. Эти наблюдения сходны с теми, что X хромосома глобально гиперметилирована, но наблюдается промотр-специфическое гипометилирование активной X²⁹. Однако в результате специфического скрининга по генным промоторам с более высокими уровнями метилирования в ES клетках, мы идентифицировали Elf5 в качестве гена цензора, который метилирован в ES клетках, не метилирован в TS клетках. Elf5 активируется посредством передачи сигналов Fgf-Fgfr ³⁰ и в свою очередь активирует Eomes и Cdx2. Когда промотор Elf5 метилирован, то низкие уровни экспрессии Eomes и/или Cdx2 (Fig. la) оказываются несущественными, т.к. транскрипционная петля прерывается на уровне Elf5. Сильная петля позитивной обратной связи создается с помощью Elf5 в TS клеточной нише, что позволяет этому компартменту расширяться в определенный временной промежуток. Поэтому эта клеточная популяция теряется и экспрессия Cdx2 не может быть устойчивой у Elf5 мутантов²¹. Этот компартмент также может устанавливаться за счет избыточной экспрессии Cdx2 или Eomes в ES клетках³¹, это, как мы показали, не зависит от деметилирования Elf5 на ранних стадиях, но спустя продолжительный период ведет к деметилированию и экспрессии Elf5, тем самым поддерживается петля обратной связи и становится возможной прогрессия по пути дифференцировки трофобласта (Supplementary Information, Fig, S4). Обычно петля обратной связи устанавливается с помощью Elf5 в течение ограниченных во времени нескольких клеточных делений, позиционируя Elf5 в промежутке между усилением трофобластной судьбы и началом дифференцировки. Это может быть обусловлено постепенной потерей др. регуляторных факторов, необходимых для экспрессии Cdx2 (или Eomes). Следовательно, Elf5 может индуцировать дифференцировку трофобласта из ES клеток, но в отличие от Cdx2 не может превратить их в постоянно само-обновляющуюся линию TS клеток. Нельзя исключить возможность, что могут существовать др. gatekeeper гены, такие как Elf5, которые метилируются в ES клетках и эпибласте. Однако наш скрининг был исчерпывающим и оценка исследования показала, что существенные различия в метилировании действительно реальны³¹.

В отсутствие молчания с помощью метилирования ДНК или в force-expression системе, Elf5 выполняет трофобласт-детерминирующую функцию благодаря своей способности активировать Cdx2 и Eomes. Однако в контексте нормального развития, Elf5 действует иерархически ниже трофобластных детерминантов Cdx2 и Eomes, а также недавно идентифицированного Tead4, который, как было показано, индуцирует Cdx2, делая его геном на сегодня, стоящим на вершине каскада предопределения внеэмбриональной судьбы^33-35. Функция gatekeeper для такого действующего относительно поздно гена на первый взгляд кажется противоречащей смыслу. Однако положение во времени Elf5 в каскаде детерминации трофобласта коррелирует в совершенстве с онтогенетической фиксацией клонального ограничения и специфически делает возможной пластичность и регуляцию, которые характерны для раннего развития млекопитающих^3,36,37. Т.о., индивидуальные бластомеры всё ещё способны пересекать границу между клонами и экспрессировать клональные 'маркеры', остающиеся мозаичными вплоть до средней стадии бластоциста¹⁹. Лишь несколько позднее, экспрессия Elf5 во внеэмбриональной эктодерме подкрепляет судьбу внеэмбриональных клеток, тогда как неспособность активировать Elf5 в эпибласте, обусловленная метилированием промотра, ограничивает его производные судьбой эмбриональных клеток. Поздно действующая функция Elf5 согласуется с его нижестоящим положением клон-детерминирующих транскрипционных факторов в промежутке между самообновлением стволовых клеток и началом дифференцировки.

Степень, с которой бластомеры эмбрионов мышей ранних стадий дробления оказываются предетерминированы в отношении их будущей судьбы является спорным вопросом³⁸. Сегодня принято, что положение, клеточная поляризация и относительные пороговые уровни немногих взаимодействующих факторов склоняют бластомеры приобретать судьбу эмбрионального или внеэмбрионального клеточного клона³⁹. Необратимая фиксация клеточных судет происходит только на стадии позднего бластоциста, однако наши находки впервые показывают молекулярный механизм для такого перехода от исходной пластичности к клонально ограниченному потенциалу в ходе развития. Этот взгляд на развитие был выражен C. H. Waddington, который уподоблял путь образования клонов клетками в направлении терминальной дифференцировки с шаром перемещающимся вниз вдоль разветвленных долин: вступив однажды на свою финальную долину он не может легко перескочить гору в соседнюю или вернуться к началу. Это создает канализацию путей развития, так что они становятся стабильными и потенциально необратимыми⁴⁰. Наши наблюдения подтверждают молекулярную модель регуляции и канализации раннего развития млекопитающих. Манипуляции с gatekeeper генами, такими как Elf5, или их эпигенетическая регуляция могут помочь в отношении стратегии в регенеративной медицине, которая имеет целью генерировать соотв. типы клеток с помощью трансдифференцировки или репрограммирования соматических клеток.