Посещений:
ШАПЕРОНОМ-ОПОСРЕДОВАННАЯ АУТОФАГИЯ

Компоненты системы

Chaperone-mediated autophagy at a glance
Susmita Kaushik, Urmi Bandyopadhyay, Sunandini Sridhar, Roberta Kiffin, Marta Martinez-Vicente, Maria Kon, Samantha J. Orenstein, Esther Wong and Ana Maria Cuervo
2011 J Cell Sci 124, 495-499.




Рис.1.  | 

Chaperone-mediated autophagy (CMA) это внутриклеточный катаболический путь. который обеспечивает деградацию избранного субнабора цитозольных белков в лизосомах (Dice, 2007; Cuervo, 2010; Kon and Cuervo, 2010; Orenstein and Cuervo, 2010). Термин аутофагия (само-поедание) широко используется для обозначения доставки и деградации внутриклеточных компонентов лизосомами (Mizushima et al., 2008; Mizushima and Levine, 2010; Yang and Klionsky, 2010). Сосуществуют различные типы аутофагии почти во всех клетках и они могут отличаться по механизмам, которые обеспечивают доставку грузов (субстратов для деградации) в лизосомы. Макроаутофагия и микроаутофагия являются вариантами процесса аутофагии, при которой целые регионы цитозоля (при 'bulk' аутофагии) или избранные цитозольные компоненты (органеллы, белковые комплексы, белковые агрегаты, патогены и т.д.) секвестрируются в везикулярных компартментах. Лизосомные энзимы могут проникать в закрытый груз путем непосредственного слияния пузырьков с лизосомами (при макрофагии), или за счет интернализации груз-содержащих пузырьков, которые образуются на лизосомной мембране (при микрофагии). Третья форма аутофагии, предназначенная исключительно для деградации растворимых белков, также обнаруживается почти во всех типах клеток млекопитающих. Этот процесс аутофагии известен как шапероном-опосредованная аутофагия, отличается от др. форм аутофагии как в отношении белков грузов, распознаваемых для доставки в лизосомы, так и в отношении способа, с помощью которого эти белки достигают просвета лизосом (Dice, 2007; Cuervo, 2010). В статье и постере мы суммирует основные ступени, участвующие в деградации цитозольных белков с помощью CMA, важные компоненты этого пути как в цитозоле, так и в лизосомных мембранах и основы регуляции этого аутофагического процесса. Мы также включили резюме описываемых физиологических функций CMA и некоторые связи между нарушением CMA и болезнями.

CMA step by step


Для белка, пригодного для лизосомной деградации с помощью CMA, абсолютно необходимо присутствие пентапептидного мотива, биохимически связанного с KFERQ в отношении аминокислотных последовательностей (Dice, 1990). Этот мотив распознается с помощью цитозольного шаперона, соотв. хитшокового белка 70 kDa (Hsc70). который вместе с его модуляторными ко-шаперонами (Bag1, Hip, Hop and Hsp40) доставляет белок субстрат на поверхность лизосом (Chiang et al., 1989). После этой ступени доставки комплекс субстратный белок -- шаперон, закрепляется на лизосомной мембране благодаря взаимодействию с цитозольным хвостом однопроходного мембранного белка, lysosome-associated membrane protein type 2A (LAMP-2A), который действует как рецептор для этого пути аутофагии (Cuervo and Dice, 1996). Интернализации субстратного белка предшествует его разворачивание (Salvador et al., 2000), ступень, не нужная для др. типов аутофагии. Транслокация субстрата через лизосомную мембрану также нуждается в присутствии просветной формы Hsc70 (lys-Hsc70), которая помогает транслокации субстрата в просвет лизосом (Agarraberes et al., 1997; Cuervo et al., 1997). После транслокации субстратные белки быстро деградируют с помощью обильного набора лизосомных гидролаз.

CMA substrates


Предполагаемые CMA субстраты были идентифицированы по присутствию KFERQ-подобного мотива в их последовательности (Dice, 1990) с использованием этого критерия было установлено, что ~30% цитозольных белков являются кандидатами для CMA (Wing et al., 1991). Однако , чтобы классифицировать белок как bona fide CMA субстрат, необходима дополнительная экспериментальная оценка (Kaushik and Cuervo, 2009). Базовые критерии, которым д. удовлетворять CMA субстраты: (1) присутствие KFERQ-like мотива; (2) ассоциация с лизосомами, преимущественно с теми, которые обнаруживают высокую CMA активность (позитивны в отношении lys-Hsc70); (3) пониженная скорость деградации, когда лизосомная протеолитическая активность блокирована; (4) взаимодействие с цитозольным Hsc70; (5) взаимодействие с LAMP-2A посредством его цитозольного хвоста; (6) увеличение внутриклеточных уровней белка кандидата в клетках, лишенных LAMP-2A (хотя активация др. путей аутофагии компенсирует снижение CMA и предупреждает накопление субстрата во многих случаях); (7) способность непосредственно транслоцироваться в изолированные лизосомы. Последнее, по-видимому, наиболее убедительное доказательство белка как CMA субстрата, поскольку такого типа метод in vitro не сносит вклада в какую-либо др. протеолитическую систему, наблюдаемой лизосомной транслокации и деградации (Kaushik and Cuervo, 2009).
Примерно 25 белков были оценены как субстраты для CMA и более пяти удовлетворяли 1 или 2 вышеприведенным критериям и ожидают дальнейшей оценки. Спектр CMA субстратов включает - среди прочих - несколько гликолитических энзимов (Aniento et al., 1993; Cuervo et al., 1994), транскрипционные факторы и ингибиторы транскрипционных факторов (Aniento et al., 1996; Cuervo et al., 1998; Sooparb et al., 2004; Liu et al., 2009), Ca2+-связывающие и липид0связывающие белки (Cuervo et al., 1999; Cuervo et al., 2000) и компоненты др. протеолитических систем (Cuervo et al., 1995b; Rothenberg et al., 2010).

Molecular components of CMA


Цитозольные шапероны и ко-шапероны, которые участвуют в CMA участвуют также в др. внутриклеточных путях (Chiang et al., 1989). Шапероны, расположенные в просвете лизосом или ассоциированные с лизосомной мембраной - а именно lys-Hsc70 (Cuervo et al., 1997), ассоциированный с мембраной Hsc70 (Agarraberes et al., 1997) и lys-Hsp90 (Bandyopadhyay et al., 2008) - , по-видимому, предназначены исключительно для CMA. Однако поскольку они являются посттрансляционными вариантами цитозольных шаперонов скорее, чем независимыми генными продуктами, то регуляция их экспрессии не предоставляет способ избирательного воздействия на активность CMA.
LAMP-2A, мембранный белок, который действует как рецептор для субстратов CMA (Cuervo and Dice, 1996), часто подвергался манипуляциям, чтобы регулировать активность CMA. Фактически, уровни LAMP-2A на мембране лизосом непосредственно предопределяют величину активности CMA, поскольку связывание субстрата с цитозольным хвостом LAMP-2A является ограничивающей ступенью в CMA (Cuervo and Dice, 2000c). LAMP-2A является вариантом сплайсинга одиночного Lamp2 гена, который также кодирует два др. варианта, LAMP-2B и LAMP-2C (Eskelinen et al., 2005), с идентичными просветными регионами, но с разными трансмембранной областью и цитозольным хвостом. Связывание субстрата с цитозольным хвостом LAMP-2A не происходит с KFERQ-targeting областью и обозначается как LAMP-2A-связывающий мотив в субстрате, который ещё не идентифицирован. Однако тот факт, что для связывания субстрата необходимы 4 положительных заряда в LAMP-2A цитозольном хвосте указывает на то, что электростатические взаимодействия скорее, чем специфические аминокислотные остатки обеспечивают связывание субстрата (Cuervo and Dice, 2000c).
Функция LAMP-2A выходит за пределы рецепторной функции и выступает также в качестве важного компонента CMA транслокационного комплекса (Bandyopadhyay et al., 2008). Соединение белков субстратов с LAMP-2A мономерами заставляет его организовывать 700 kDa мультимерный помплекс на лизосомной мембране. Мотив GxxG, присутствующий в трансмембранной области LAMP-2A важен для мультимеризации. Показано, что мутации, которые препятствуют мультимеризации устраняют транслокацию субстрата, но не связывание субстрата с LAMP-2A (Bandyopadhyay et al., 2008). Фактически, субстратные белки соединяются только с мономерами LAMP-2A, которые затем 'тянут' субстрат в направлении транслокационного комплекса во время мультимеризации, тогда как их связывание, с уже образованным транслокационным комплесом невозможно (Bandyopadhyay et al., 2008). Разные линии доказательства подтверждают идею, что LAMP-2A подвергается конформационным изменениям после связывания субстрата и во время процесса, который приводит к мультимеризации. Присутствие лизосом-специфической формы Hsp90 на стороне просвета лизосомной мембраны важно для сохранения стабильности LAMP-2A, т.к. оно лежит в основе этих конформационных изменений на лизосомной мембране (Bandyopadhyay et al., 2008).
CMA транслокационный комплекс не присутствует в стабильной форме на лизосомной мембране, а скорее активно образуется после соединения субстрата с LAMP-2A, и быстро разбирается, как только субстрат транслоцируется. LAMP-2A подвергается непрерывным циклам сборки и разборки, это облегчает связывание субстратных белков (когда он является мономером) и их транслокацию через лизосомную мембрану (когда он организован как мультимер) (Bandyopadhyay et al., 2008). Hsc70 активно вносит вклад в диссоциацию LAMP-2A из мультимерного комплекса в процессе, который зависит от АТФазой активности Hsc70 и отсутствия какого-либо субстратного белка с ним связанного (Bandyopadhyay et al., 2008).

Regulation of CMA


Сигнальные механизмы, которые вносят вклад в регуляцию активности CMA, сегодня изучены слабо. Главной мишенью для регуляции CMA, по-видимому, является LAMP-2A, чьи уровни на лизосомной мембране непосредственно коррелируют с активностью CMA и поэтому являются предметом тонкой регуляции (Cuervo and Dice, 2000b). В специфических условиях (т.e. оксидативных стрессах), уровни лизосомного LAMP-2A возрастают благодаря индукции транскрипции и синтеза de novo (Kiffin et al., 2004). Однако в большинстве случаев изменения у уровнях лизосомного LAMP-2A регулируются непосредственно на лизосомной мембране и не нуждаются в синтезе de novo LAMP-2A. LAMP-2A также является предметом для тонко регулируемой деградации на лизосомной мембране посредством последовательного расщепления с помощью cathepsin A и ассоциированной с мембраной metalloprotease, природа которой остается неизвестной (Cuervo and Dice, 2000b; Cuervo et al., 2003). Расщепленная форма LAMP-2A затем доставляется в просвет лизосом, где она быстро деградирует. В условиях, которые нуждаются в максимальной активации CMA, регулируемая деградация LAMP-2A снижается (удваивая их период полужизни) с последующим заметным увеличением его лизосомных уровней без необходимости синтеза новых LAMP-2A белков. Кроме того, просветный пул интактного LAMP-2A (Jadot et al., 1996) также может быть возвращен на лизосомную мембрану во время активации CMA (Cuervo and Dice, 2000b). Это возвращение LAMP-2A не зависит от pH в просвете и зависит от потенциала лизосомной мембраны, присутствия CMA субстратов и уровней ассоциированных с мембраной Hsc70 (Cuervo and Dice, 2000b). Возвращение LAMP-2A на лизосомную мембрану увеличивается во время персистирующей активации CMA, напр. в ответ на продолжительное голодание. Хотя CMA уже активируется после 10 ч голодания - предположительно благодаря блокаде деградации LAMP-2A - достигается максимальная активация после 24 ч благодаря рекрутированию из резидентного просветного пула LAMP-2A на мембрану (Cuervo and Dice, 2000b).
Регуляция CMA путем изменений лизосомного LAMP-2A подчеркивает важность латеральной подвижности внутри мембраны, которая, как было установлено, детерминируется за счет её динамической ассоциации с лизосомными липидными микродоменами (Kaushik et al., 2006). В условиях низкой активности CMA часть LAMP-2A перемещается в регионы с определенным липидным составом, где количество молекул LAMP-2A заметно редуцировано, когда CMA активирована. Соответственно увеличение размера микродоменов с помощью приумножения лизосомного холестерола приводит к уменьшению CMA, тогда как лекарства, экстрагирующие холестерол, увеличивают уровни LAMP-2A на мембране и т. о., активируют CMA (Kaushik et al., 2006). Фактически регулируемая деградация LAMP-2A, описанная выше, происходит в этих липидных микродоменах, поскольку просветный cathepsin A преимущественно ассоциирует с лизосомной мембраной в этих регионах. Напротив, связывание субстратов с LAMP-2A и его соединение в и разборка из мультимерных CMA транслокационных комплексов относится только к молекулам LAMP-2A вне этих микродоменов (Kaushik et al., 2006).
Характерные свойства LAMP-2A необходимы для модулирования его мембранной динамики. В дополнение к GxxG мотиву, необходимому для мультимеризации (Bandyopadhyay et al., 2008), остаток пролина, который присутствует на интерфейсе между его трансмембранным и просветным регионами, абсолютно необходим для мобилизации LAMP-2A в липидные микродомены (Kaushik et al., 2006). Др. компоненты лизосомной мембраны, которые модулируют динамику LAMP-2A это белок промежуточных филамент glial fibrillary acidic protein (GFAP) и фактор элонгации 1? (EF1?) - пара взаимодействующих белков, которые модифицируют стабильность мультимерных LAMP-2A комплексов и ассоциацию LAMP-2A с микродоменами GTP-зависимым способом (Bandyopadhyay et al., 2010). Специфичный для лизосом вариант GFAP ассоциирует с LAMP-2A мультимерами, увеличивая тем самым стабильность комплекса и противодействуя способствующему разборке эффекту Hsc70. Лизосомные GFAP подразделены на две субпопуляции; не фосфорилированный GFAP, который соединяется с мультимерами LAMP-2A, и фосфорилированный GFAP (GFAP-P), который обычно связан с GTP-связывающим белком EF1?. Не фосфорилированный GFAP обладает более высоким сродством с GFAP-P, чем с LAMP-2A, но образованию GFAP-GFAP-P димеров обычно мешает присутствие EF1?, связанного с GFAP-P. В присутствии GTP, EF1? высвобождается из лизосомной мембраны благодаря диссоциации GFAP из транслокационного комплекса и его соединения с GFAP-P (Bandyopadhyay et al., 2010). Такая диссоциация способствует быстрой разборке LAMP-2A мультимерных комплексов и его активной мобилизации в липидные микродомены для деградации. Изменения в уровнях GFAP-GFAP-P, EF1-?, присутствующих на лизосомных мембранах, также как и внутриклеточный GTP или внутрилизосомный Ca2+ (облегчающий ассоциацию cathepsin A с липидными микродоменами) все они могут вносить вклад в модуляцию активности CMA .

Physiological roles of CMA


Анализ клеточных условий, которые активируют CMA, субстратов, деградируемых при этих условиях, и следствий блокирования этого пути в культивируемых клетках, помог понять клеточные функции CMA (Dice, 2007; Cuervo, 2010). CMA активируется в условиях голодания почти во всех типах клеток. В противовес др. процессам аутофагии, которые активируются самое раннее спустя 30 мин. после доступа к питательным веществам, и оказываются ограниченными, активация CMA стартует позднее (спустя более чем 10 ч процесса голодания) (Backer and Dice, 1986), и достигает плато максимальной активации ~36 ч после начала голодания и остается активной свыше 3-х дней (Cuervo et al., 1995a). Широкий круг CMA субстратов, которые деградируют во время голодания, указывает на то, что большинство из них деградирует, чтобы предоставить свободные аминокислоты для синтеза важных клеточных белков. Избирательность CMA в отношении растворимых белков может позволить клеткам деградировать белки, которые больше не нужны, не затрагивая уровни белков, которые необходимы в этих стрессовых условиях. В подтверждение этой идеи, что CMA вносит вклад в уровни свободных аминокислот для белкового синтеза и/или энергию, это редукция уровней АТФ, обнаруживаемая во время голодания клеток при нарушении CMA (Massey et al., 2006).
Др. функция CMA, которая общая для всех типов клеток, это селективное удаление измененных и поврежденных белков. Эта функция становится особенно важной во врем стрессовых воздействий, которые генерируют повреждения белков, таких как оксидативные стрессы. Фактически, CMA усиливает свою активность во время оксидативных стрессов (Kiffin et al., 2004; Finn and Dice, 2005) , а неспособность к усилению активности CMA делает клетки чувствительными к оксидативным агентам (Massey et al., 2006). Клетки также усиливают CMA во время воздействия токсических соединений, которые находят и денатурируют цитозольные белки (Cuervo et al., 1999), которые затем удаляются избирательно лизосомами посредством CMA.
Также описывается число всё увеличивающихся специализированных функций для CMA, которые сцеплены с типом клеток, в которых происходит активация CMA или специфические белки деградируют с помощью этого пути. CMA вносит вклад, среди прочего, в регуляцию жизнеспособности нейронов посредством деградации фактора жизнеспособности нейронов MEF2D (Yang et al., 2009), в регуляцию роста клеток почечных канальцев посредством деградации транскрипционного фактора Pax2 (Sooparb et al., 2004), в презентацию антигенов в дендритных клетках (Zhou et al., 2005), и в контроль NF-κB-обеспечиваемой транскрипции в ответ на пищевой стресс благодаря деградаци I&kappaB (Cuervo et al., 1998).

Pathology of CMA


Пониженная активность CMA описывается в многочисленных типах тканей и клеток старых грызунов и в клетках старых взрослых людей (Dice, 1982; Cuervo and Dice, 2000a). Функциональное снижение CMA происходит постепенно с возрастом и возникает преимущественно за счет связанного с возрастом уменьшения уровней LAMP-2A на лизосомных мембранах (Cuervo and Dice, 2000a). Эти более низкие уровни LAMP-2A не являются результатом подавления транскрипции гена Lamp2 с возрастом, изменения сплайсинга, редукции синтеза или проблем с доставкой LAMP-2A белка на лизосомные мембраны во время биогенеза лизосом. Вместо этого, снижается стабильность LAMP-2A на лизосомной мембране с увеличением возраста, это, по-видимому, вносит вклад в снижение содержания LAMP-2A в старых организмах (Kiffin et al., 2007). Наблюдаемое переключение с регулируемой деградации на лизосомных мембранах на случайно расширенную деградацию LAMP-2A в просвете лизосом, по-видимому, является результатом нежелательных пост-трансляционных модификаций компонентов лизосомных мембран или изменений липидного состава лизосомных мембран. Недавние исследования на трансгенных модельных мышах, у которых нормальные уровни LAMP-2A сохраняются вплоть до поздней жизни, подтвердили, что функциональное снижение CMA вносит вклад в различные аспекты старческого фенотипа, такие как альтерации клеточного гомеостаза и реакции клеток и органов на стрессы, которые вносят вклад в функциональные нарушения старческих организмов (Zhang and Cuervo, 2008).
Первичный дефект активности CMA описан при некоторых нейродегенеративных заболеваниях, таких как Болезнь Паркинсона и определенные tauopathies (Cuervo et al., 2004; Martinez-Vicente et al., 2008; Wang et al., 2009). В обоих случаях основой для дисфункции CMA является аберрантное связывание патогенных белков, которые , как известно, накапливаются в клетках, повреждаемые при этих нарушениях компонентов CMA на лизосомной мембране. Напр.,α-synuclein (Cuervo et al., 2004; Martinez-Vicente et al., 2008; Xilouri et al., 2009; Mak et al., 2010) и UCHL1 (Kabuta et al., 2008), белки, ассоциированные с патогенезом болезни Паркинсона, соединяются с аномально высоким сродством с LAMP-2A на лизосомной мембране. В случае α-synuclein, это прочное связывание, как было установлено, ингибирует CMA др. цитозольных белков, тем самым делая клетки более чувствительными к стрессам и неспособные сглаживать стрессы или энергетические затраты при голодании (Massey et al., 2006). CMA также нарушается при мутантных формах Tau, ассоциированного с цитоскелетом белка, ответственного за клеточную токсичность при tauopathies и болезни Алцгеймера (Wang et al., 2009). Определенные мутанты Tau направляются в лизосомы для CMA деградации, но несмотря на свое высокое сродство связывания лизосомных мембран, неспособны полностью транслоцироваться. Часть белка, которая уже оказалась в просвете лизосом, подвергается последовательному расщеплению, которое генерирует высоко amyloidogenic пептиды, которые олигомеризуются (Wang et al., 2009). Эти необратимые олигомерные комплексы фрагментированных Tau, образуют на лизосомной мембране помехи для нормальной активности CMA и в конечном итоге, дестабилизируют лизосомы. Дисфункция CMA была также описана при некоторых болезнях лизосомного хранения (Cuervo et al., 2003; Venugopal et al., 2009), в диабетических почках (Sooparb et al., 2004), в разного типа токсических нефропатиях (Cuervo et al., 1999) и в онкогенных процессах (Welsch et al., 2010).

Perspectives


Although CMA was identified as an autophagic process more than 20 years ago, its molecular dissection, physiological relevance and the links between CMA malfunctioning and disease have only been established in recent years. The identification of proteins dedicated to this pathway, such as LAMP-2A, now permits genetic manipulation of this autophagic process and direct analysis of the consequences at the cellular and organism level. As in any developing field, there are still many questions that require further clarification regarding CMA. For example, the specific roles of each of the co-chaperones that associate to the substrate–Hsc70 complex in the cytosol and at the lysosomal membrane remain poorly characterized, as are the energetic requirements for CMA. Although ATP is required, it is not clear whether it is necessary for substrate unfolding or translocation across the membrane. Other outstanding issues include the signaling mechanisms that connect the different stressors to CMA activation and the possible contribution of CMA to the degradation of proteins located in other subcellular compartments during their transit through the cytosol. The molecular players that mediate coordinated activity of CMA with different autophagic pathways (for example, a blockage of CMA results in the compensatory activation of macroautophagy) and with other proteolytic pathways, such as the proteasome, are also not fully elucidated. Finally, alterations in CMA activity in other pathologies also require further investigations.
Сайт создан в системе uCoz