Итак, оптимизированный нами протокол MeDIP показал, что главный этап метилирования генов происходит во время имплантации в клетках эпибласта, это совпадет с метилированием de novo , наблюдаемым с помощью иммунофлюоресценции⁷. Особенно это коррелирует со снижением клеточной потенции, подчеркивая тем самым тот факт, что стволовые клетки пост-имплантационного эпибласта epiblast stem cells (EpiSCs) редко вносят вклад в химеры^33'34, и подтверждая тем самым, что метилирование ДНК составляет эпигенетическую границу, которая ограничивает потенцию эпибластных клеток. Снижение потенции EpiSCs может быть также объяснено аномальным метилированием ДНК во время происхождения и в культуре, напр., гены плюрипотентности Dppa3 и Zfp42 , которые метилируются в EpiSCs, но не в эпибласте in vivo³⁵. Сходным образом, мы показали, что эмбриональные стволовые клетки воспринимают сигнатуру метилирования промоторов, которая напоминает таковую пост-имплантационных эмбрионов скорее, чем бластоциста, из которого они происходят. Это согласуется с недавними данными, показавшими, что появление эмбриональных стволовых клеток вызывает изменения в H3K4 и H3K27 метилировании³⁶. Значение этих эпигенетических различий может вызывать вопрос, поскольку эмбриональные стволовые клетки всё ещё способны вносить вклад во все зародышевые слои, будучи повторно внесенными в бластоцист и обладают сходными свойствами с нативными клетками эпибласта из зрелого бластоциста³². Возможно, что это отражает строгую гетерогенность между эмбриональными стволовыми клетками³⁷ или. что метилирование ДНК обратимо, когда клетки помещают обратно в условия in vivot. Мы также отметили, что в противоположность EpiSCs, метилирование ДНК в эмбриональных стволовых клетках не нацелено на гены плюрипотентности, это может объяснить, почему это не влияет на их потенциал развития.

Эксперименты по иммуноокрашиванию показали, что метилирование ДНК понижено во внеэмбриональных по сравнению с эмбриональными клонами⁷, различие, которое сохраняется, т.к. плацента оказывается гипометилированной по сравнению с собственно эмбрионом²³. Интересно, что эти различия не доказуемы на уровне промоторов. Наши данные показывают, что большинство протестированных промоторов генов метилируют ДНК одинаково в эпибласте и во внеэмбриональной эктодерме на ст. E6.5, хотя мы отметили легкое снижение метилирования во внеэмбриональной эктодерме для некоторых генов (Pou2af1, Cplx4, Cryaa и Cd4). Это согласуется с результатами предыдущих исследований, показавших сходное метилирование промоторов между культивируемыми эмбриональными клетками и стволовыми клетками трофобласта¹¹. Следовательно, метилирование CpG островков не сопровождается паттернами глобального метилирования ДНК, это может указывать на то, что они находится под контролем разных путей.

Немногие гены, как было установлено, требуют метилирования ДНК для правильной пространственно-временной экспрессии in vivo. Редкие примеры включают Oct4 и Nanog (ref. 38), а также Rhox гены¹⁶. Наши данные показали, что одной из важный функций метилирования ДНК является репрессия программы экспрессии зародышевой линии в развивающихся эмбрионах in vivo. Предыдущие исследования идентифицировали специфичные для зародышевой линии гены в качестве мишеней для метилирования CpG островков в дифференцированных клетках^9,10,39,40. Здесь мы идентифицировали много новых мишеней и расширили эти наблюдения, показав, что метилирование происходит во время имплантации перед органогенезом и необходимо для поддержания молчания генов in vivo. Удивительно, что некоторые из этих генов обнаруживают высокие концентрации CpGs в своих промоторах (более 4-х CpGs на 100 пн), свойство, которое иным образом ассоциирует с гипометилированием в геноме, за исключением импринтируемых локусов в зародышевой линии DMRs. Это строго указывает на существование механизмов, которые специфически рекрутируют метилирование ДНК на гены зародышевой линии⁴⁰. Мы полагаем, что такое метилирование не инициирует молчания генов, но скорее действует как защита с блокировкой, чтобы предупредить вредные эффекты, вызываемые эктопической реактивацией в соматических клетках. Два аргумента подтверждают эту модель. Во-первых, гены зародышевой линии приобретают метилирование ДНК во время имплантации, когда они уже молчат. Во-вторых, многие из этих генов избыточно экспрессируются при раке, это указывает на то. что их эктопическая реактивация негативно влияет на целостность соматических клеток⁴¹.

Удивительно, др. мишени для метилирования промоторов у ранних эмбрионов являются генами, запрограммированными экспрессироваться позднее во время развития, в частности, в гематопоэтических и нейрональных клонах. При исследовании этих мишеней мы сделали два неожиданных наблюдения. Во-первых, некоторые мишени являются членами кластеров генных семейство (Cryg кластер, Cxcl кластер, локусы protocadherin и Tlrl-6 кластер), это указывает на то, что метилирование ДНК может быть использовано в качестве механизма для регуляции удвоенных промоторов. Во-вторых, метилирование промоторов, необходимое в эпибласте, стирается во время терминальной дифференцировки. Кстати, очень мало примеров деметилирования промоторов, описанных in vivo, большинство в бедных CpG промторах⁴². Это деметилирование является возможно следствием активации гена, как недавно показано для чувствительных к гормону генов TFF1 (ref. 29) и CYP27B1 (ref. 28). Здесь мы сообщаем о деметилировании промоторов с более высокой концентрацией CpG, и необходимы дальнейшие исследования для тестирования того, является ли это следствием активации генов и каковы используемые механизмы. Это наблюдение противоречит модели, согласно которой потеря потенциала дифференцировки во время развития ассоциирует с увеличением метилирования ДНК промотора. Напротив, подтверждено, что обратимое метилирование ДНК сдерживает раннюю экспрессию ключевых генов дифференцировки, функция сходная с polycomb-обусловленным метилированием H3K27 в плюрипотентных клетках^43,44. Эта модель предсказывает, что отсутствие метилирования ДНК ведет к активации ранних генов во время развития. Итак, мы неспособны продемонстрировать реактивации гемотопоэтических генов у Dnmt3b-/- E9.5 эмбрионов; однако дальнейшие исследования на др. мишенях и стадиях развития необходимы. чтобы прояснить этот вопрос.

Наши результаты показывают, что Dnmt3b является основным энзимом, ответственным за de novo метилирование тестируемых генов у ранних эмбрионов. Это согласуется с исследованиями, показавшими, что Dnnit3b обнаруживается у преимплантационных эмбрионов и в эпибласте, тогда как Dnmt3a превалирует у поздних эмбрионов^31,45. Однако редкие гены (Brdt, ОрерЗ, Суtip и Crygd) обнаруживают лишь минорное или частичное снижение метилирования в отсутствие Dnmt3b или Dnmt3a, это указывает на то, что оба энзима кооперируются на этих мишенях. Это согласуется с исследованиями, показавшими синергичное действие Dnmt3a и Dnmt3b на Oct4, Nanog и Rhox у E8.5-E9.5 эмбрионов^16,38. Это указывает на то, что разные геномные регионы обнаруживают разные специфичности по энзимам Dnmt3. В будущем усилия д. быть сконцентрированы на понимании механизмов, рекрутируют энзимы Dnmt3 на их мишени.

Наконец, мы установили, что определенные гены, в особенности гены зародышевой линии, но также и соматические гены, резистентны к глобальному деметилированию после оплодотворения и наследуют метилированную ДНК промоторов от родительских гамет. Итак, все протестированные гены указывают на то, что наследование после оплодотворения метилирования ДНК происходит из ооцитов; однако необходима дополнительная оценка для тестирования, происходит ли это и от сперматозоидов. Эти гены отличаются от импринтируемых генов, поскольку некоторые метилированы в обеих гаметах, и не один из этих генов не обнаруживает аллель-специфического метилирования после имплантации. В условиях, в которых эти гены не временно деметилируются на специфических стадиях развития, подтверждают, что имеет место перенос через поколения метилирования ДНК существенной фракцией генома. Важно протестировать, существуют ли сходные механизмы поддержания метилирования ДНК в импринтируемых генах и генах зародышевой линии и обеспечивают ли элементы из специфических последовательностей резистентность к эпигенетическому репрограммированию. Вместе с недавними работами, показавшими, что модификации гистонов передаются через гаметы эмбрионам^20,21, это указывает на то, что оплодотворение участвует в передаче эпигенетической информации, которая может быть важной для ведения ранних стадий развития. Кроме того, показав, что перенос через поколения метилирования ДНК м. происходить в не импринтируемых последовательностях у млекопитающих, наши результаты оправдывают исследования передачи измененного метилирования ДНК, которое связано со средовыми факторами ⁴⁶. URLs. R software for statistical computing, http://www.r-project.org/; DAVID functional annotation tool, http://david.abcc.ncifcrf.gov/; UCSC Genome Annotation, http://www.genome.ucsc.edu/; MethPrimer software, http://www.urogene.org/methprimer/index1.html.